Dna5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測序方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測序方法，屬于基 因測序領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA不僅由胞嘧啶、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤四種堿基組合而成。5-甲基胞嘧啶與 5-羥甲基胞嘧啶是DNA中的重要修飾修飾堿基是DNA上的第五種與第六種堿基。他們是調(diào)控 生物通路，細(xì)胞生命周期的重要標(biāo)記，起到多重的生物功能，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控，轉(zhuǎn)座子沉默，基 因印記和X染色體失活等。在多種疾病特別是癌癥等重大疾病中呈現(xiàn)特定的基因組分布，在 受精發(fā)育初期過程中呈現(xiàn)明顯的分布變化，被認(rèn)為可能參與與標(biāo)記了這些過程。所以利用 測序技術(shù)全面了解這一過程顯得尤為重要。
[0003] 由于這類5位修飾的胞嘧啶物理化學(xué)性質(zhì)接近，不能直接利用現(xiàn)有的一代或二代 測序技術(shù)進(jìn)行檢測。一類常用的方法是將DNA打斷成片段，再將5位修飾的胞嘧啶特異性結(jié) 合，從而特異性地富集含有5位修飾的胞嘧啶的DNA片段。通過對富集后的片段的測序，可以 得到5位修飾的胞嘧啶在基因組上的分布信息，并藉由此信息進(jìn)行各類定性、半定量、定量 生物信息學(xué)分析。此類方法的優(yōu)點(diǎn)是測序深度要求低，成本低，覆蓋性好。其中普遍使用的 富集手段有兩類，一類是特異性抗體捕獲，另一類是特異性的化學(xué)生物學(xué)標(biāo)記捕獲。兩類手 段均可給出重復(fù)性好的結(jié)果，其中抗體較為昂貴，捕獲的位點(diǎn)序列要求較高，對修飾堿基 分布稀疏的序列結(jié)合性差，可能引入歧視誤差。而特異性的化學(xué)生物學(xué)標(biāo)記可能會因為化 學(xué)生物反應(yīng)的選擇性優(yōu)化不完全導(dǎo)致脫靶副產(chǎn)物，從而引入背景。由于是富集過程，大量的 不含5位修飾胞嘧啶的DNA片段在過程中被棄去，導(dǎo)致在測序應(yīng)用中，兩者均需要大量的DNA 作為起始。這類傳統(tǒng)的測序方法一般只能就1微克以上的DNA作為起始樣品量進(jìn)行測序。在 實際的生物、醫(yī)療應(yīng)用中，往往只能得到1微克以下，甚至1-10納克的DNA樣品，對于此類樣 品的檢測方法將直接獲取有生物與臨床價值的基因調(diào)控信息，因而在生物臨床研發(fā)與檢測 中有著重大意義。
[0004] 根據(jù)上文分析，現(xiàn)有富集手段未獲得重大突破的原因有三：一是富集后的DNA過 少，在測序文庫建立過程中損失太大。傳統(tǒng)建立文庫的流程中涉及到了多步反應(yīng)純化，小量 DNA的純化效率低下;二是富集方法在低濃度的DNA上的效率下降，使用抗體富集時，結(jié)合效 率直接與抗原濃度相關(guān)，現(xiàn)報導(dǎo)的的抗原-抗體的結(jié)合能力不能滿足極低的DNA濃度下的反 應(yīng);三是富集后的DNA不能有效地從固相洗脫，固相負(fù)載的DNA在富集過程中只占原始DNA的 5%以內(nèi)。洗脫的過程中涉及的純化或化學(xué)反應(yīng)會極大的損失固相負(fù)載的DNA片段，造成后 續(xù)PCR反應(yīng)失敗或引入大量測序誤差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測序方 法，以提高含有5位修飾胞嘧啶的測序效率。
[0006] 本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0007] 一種DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測序方法，其特征在于，包括以 下步驟：
[0008] (l)DNA的提純與片段化預(yù)處理：
[0009]將目的DNA提取后使用機(jī)械力或消化酶將其打斷至平均50個核苷酸長度到10000 個核苷酸長度的片段；
[0010] (2)微量DNA的修復(fù)與接頭引物連接：
[0011] 將預(yù)處理的DNA片段修復(fù)并與二代測序需要的測序接頭引物連接；
[0012] (3)共價標(biāo)記5-甲基胞嘧啶與5-輕甲基胞嘧啶：
[0013] 將連接好接頭引物的DNA片段中的5位修飾的胞嘧啶進(jìn)行共價標(biāo)記；
[0014] (4)固相富集含有標(biāo)記的5位修飾胞嘧啶的DNA片段：
[0015] 將標(biāo)記的5位修飾的胞嘧啶的DNA片段在結(jié)合緩沖液中結(jié)合到固相上，對固相表面 進(jìn)行反復(fù)洗滌，去除未結(jié)合的DNA片段，
[0016] 在固相上，用對應(yīng)接頭引物的PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增。取得的PCR產(chǎn)物，經(jīng)純化后即 得到二代測序所需的基因組5位修飾胞嘧啶的分布圖譜。
[0017] 進(jìn)一步，本發(fā)明的DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測序方法，還可以 具有這樣的特征:其中，步驟(1)中，所述DNA片段來源于體液中游離的DNA片段;或提純于組 織、細(xì)胞及細(xì)胞器的完整的基因組DNA。
[0018] 進(jìn)一步，本發(fā)明的DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測序方法，還可以 具有這樣的特征:步驟(1)中，DNA片段的體液來自于血液、尿液、汗液、痰液、糞便、腦脊液、 腹水、胸水、膽汁、胰腺液等人體體液。
[0019] 進(jìn)一步，本發(fā)明的DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞啼啶基因圖譜測序方法，還可以 具有這樣的特征:其中，上述步驟(2)中的DNA片段修復(fù)是指修復(fù)DNA片段中的堿基損壞，并 將DNA的5 '及3 '補(bǔ)齊成平末端。
[0020] 進(jìn)一步，本發(fā)明的DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測序方法，還可以 具有這樣的特征:步驟(3)中，標(biāo)記的方法包括步驟:i)利用轉(zhuǎn)糖酶將帶有疊氮基團(tuán)修飾的 糖共價連接到5-羥甲基胞嘧啶的羥甲基上，i i)將直接或間接連有生物素的點(diǎn)擊化學(xué)底物 與疊氮糖修飾的5-羥甲基胞嘧啶反應(yīng)。
[0021] 進(jìn)一步，本發(fā)明的DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測序方法，還可以 具有這樣的特征：所述轉(zhuǎn)糖酶包括但 glucosyl transferase (T4·菌體β-葡糖基轉(zhuǎn)移酶）、T4 bacteriophage enzymea-glucosyl transferase (Τ4·菌體a-葡糖基轉(zhuǎn)移酶)及其衍生物，類似物，或重組酶;疊氮基 團(tuán)修飾的糖包括但不限于6-N3-葡萄糖或其他疊氮修飾的糖類。
[0022] 進(jìn)一步，本發(fā)明的DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測序方法，還可以 具有這樣的特征:標(biāo)記甲基胞嘧啶的步驟為i)利用鼠 Tet氧化酶或其衍生物、類似物、重組 酶將甲基胞嘧啶氧化為5-羥甲基胞嘧啶ii)同上文所述將5-羥甲基胞嘧啶進(jìn)行生物素標(biāo) 記。
[0023] 進(jìn)一步，本發(fā)明的DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測序方法，還可 以具有這樣的特征：其中，5-羥甲基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的標(biāo)記步驟可以按順序進(jìn)行也 可以在一個反應(yīng)中同時進(jìn)行。
[0024] 進(jìn)一步，本發(fā)明的DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測序方法，還可以 具有這樣的特征:其中，步驟⑷中，固相材料包括直徑lnm至1 OOum的磁性小球，直徑lnm至 100um的瓊脂糖小球，直徑lnm至100um的人工高分子小球，帶有表面修飾的娃片或其他生物 芯片。
[0025] 進(jìn)一步，本發(fā)明的DNA5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測序方法，還可以 具有這樣的特征:在步驟(5)中，在固相上擴(kuò)增采用直接在固相上經(jīng)1-40個PCR循環(huán)擴(kuò)增得 到合格的測序文庫，或經(jīng)1-40個PCR循環(huán)擴(kuò)增后分離固液相再經(jīng)1-40個PCR循環(huán)擴(kuò)增得到合 格的測序文庫。
[0026] 上述步驟（1)中，DNA片段的體液來源指來自于又不限于血液、尿液、汗液、痰液、糞 便、腦脊液、腹水、胸水、膽汁、胰腺液等人體體液。
[0027] 上述步驟（1)中，組織、細(xì)胞及細(xì)胞器指來自于又不限于活體組織、培養(yǎng)細(xì)胞、脫落 細(xì)胞、血液循環(huán)細(xì)胞、手術(shù)中沖洗下的細(xì)胞等。
[0028] 上述步驟（1)中，提DNA片段或完整的基因組DNA的方法包括常用的純化方法或商 業(yè)化的純化試劑盒。方法中包括但不受限于:使用氯仿-苯酚萃取，Proteinase K消解，硅膠 膜離心柱法，磁珠法，乙醇、異丙醇沉淀等技術(shù)中的一項或多項組合。純化試劑盒包括但不 受限于:QIAamp fast DNA tissue kit(Qiagen) ,ZR Genomic DNA-Tissue Kits(Zymo)。
[0029] 上述步驟（1)中，機(jī)械力包括但不限于劇烈震蕩、超聲等技術(shù)。消化酶包括但不限 于NEBNext dsDNAFragmentase(NEB)〇
[0030] 上述步驟(2)中的DNA片段修復(fù)是指修復(fù)DNA片段中的堿基損壞，并將DNA雙鏈的5 ' 及3'補(bǔ)齊成平末端。DNA的片段與測序接頭引物的連接方法包括但不限于：i)平末端連接； ii)在DNA片段的3'端末尾增加一至多個dA，利用接頭引物中相對應(yīng)的dT進(jìn)行連接。修復(fù)與 連接中涉及的酶包括但不限于T4 polymerase，T4 Kinase，Klenow exo-中的一種或其組 合。修復(fù)與連接也可以使用商業(yè)化的試劑盒，包括但不限于TruSeq Nano DNA Library Prep Kit(11 lumina) ,Kapa Hyper Prep Kit(Kapa), NEBNext? DNALibrary Prep Master Mix Set(NEB)。
[0031] 上述步驟(3)中，使用的化學(xué)生物學(xué)標(biāo)記方法指:標(biāo)記5-羥甲基胞嘧啶的步驟為i) 利用轉(zhuǎn)糖酶將帶有疊氮基團(tuán)修飾的糖共價連接到5-輕甲基胞啼啶的輕甲基上，見下面反應(yīng) 式，連接底物為UDP-6-N3-Glucose。
[0032] 12 5-?甲基胞嘧啶共價標(biāo)記反應(yīng)
2 轉(zhuǎn)糖酶包括但不限于T4 bacteriophage enzymeP-glucosyltransferase、T4 bacteriophage enzymea-glucosyltransferase及其衍生物，類似物，或重組酶。疊氮基團(tuán) 修飾的糖包括但不限于6-N3-葡萄糖或其他化學(xué)修飾包括但不限于羰基，巰基，羥基，羧 基，碳-碳雙鍵，碳-碳三鍵，二硫鍵，胺基，酰胺基，雙烯)的糖類。i i)將直接或間接連有生物 素 (biotin)的點(diǎn)擊化學(xué)底物或相應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)底物與疊氮糖修飾的或者其它化學(xué)修飾的 5_羥甲基胞嘧啶反應(yīng)。
[0035]反應(yīng)基團(tuán)包括但不限于以下含三鍵的化合物：
[0036]
[0037] 間接連接生物素的化學(xué)基團(tuán)及反應(yīng)包括但不限于:羰基，巰基，羥基，羧基，碳-碳 雙鍵，碳-碳三鍵，二硫鍵，胺基，酰胺基，雙烯。
[0038] 標(biāo)記甲基胞嘧啶的步驟為i)利用利用轉(zhuǎn)糖酶將不帶有下一步反應(yīng)修飾基團(tuán)修飾 的糖共價連接到5-羥甲基胞嘧啶的羥甲基上，用于掩蔽相對于5-甲基胞嘧啶含量較低的5-輕甲基胞啼啶ii)利用ten-eleven translocation(TET)氧化酶或其衍生物、類似物、重組 酶將5-甲基胞嘧啶
[0039]
1234567 氧化為5-羥甲基胞嘧啶（見5-甲基胞嘧啶氧化反應(yīng)的反應(yīng)式）同上文所述將5-羥 甲基胞嘧啶進(jìn)行生物素標(biāo)記。 2 上述5-羥甲基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的標(biāo)記步驟可以按順序進(jìn)行也可以在一個 反應(yīng)中同時進(jìn)行。 3 上述步驟(4)中，所使用的固相為