生鮮乳中皮革水解蛋白l-羥脯氨酸的酶標(biāo)快速檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生鮮乳檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體的涉及一種生鮮乳中皮革水解蛋白L-羥 脯氨酸的酶標(biāo)快速檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] L-輕脯氨酸，英文名稱hydroxyproline，簡稱HYP，又名反式-4-羥基-L-脯氨酸，分 子式為C5H9N03,分子量131.13。
[0003] L-羥脯氨酸是一種亞氨基酸，通常在脯氨酸的第4位上帶有羥基，但有時也在第3 位上。L-羥脯氨酸是膠原蛋白所特有的氨基酸，約占膠原蛋白中氨基酸總量的10%，而在其 他蛋白質(zhì)中含量甚微，這使得它幾乎成為膠原蛋白所特有的成分，因而可通過測定L-羥脯 氨酸含量來計算膠原蛋白的含量，從而確定膠原蛋白的總體水平。
[0004] 動物膠原水解蛋白是一種廉價蛋白原料，是將牛皮及其制品下腳料等成分粗加工 后制成的水解蛋白質(zhì)，皮革水解蛋白粉就是利用皮革下腳料甚至動物毛發(fā)等物質(zhì)，經(jīng)水解 而生成的一種粉狀物，因其氨基酸或者說蛋白含量較高，故人們稱之為皮革水解蛋白粉。某 些非法廠家在生鮮乳中摻入廉價的水解動物蛋白來冒充或替代乳蛋白質(zhì)，提高乳中蛋白的 質(zhì)量分?jǐn)?shù)，降低成本。摻加動物膠原水解蛋白不但會影響乳的口感和風(fēng)味，改變牛乳的溶解 度，因其氨基酸的組成不合理，且不易消化，所以營養(yǎng)價值低下，導(dǎo)致人體吸收利用率降低， 會嚴(yán)重影響消費者的健康狀況。嚴(yán)格來講皮革水解蛋白粉對人體健康并無傷害，不過其前 提條件是所用皮革必須是未經(jīng)糅制、染色等人工加工處理過的；然而這樣的皮革水解蛋白 粉是不存在的，因為經(jīng)過糅制、染色等人工加工處理過的皮革比直接制作成蛋白粉利潤要 高得多，因而皮革水解蛋白粉多用皮革廠制作服裝、皮鞋后的下腳料來生產(chǎn)，自然這種蛋白 粉中混進(jìn)了大量皮革糅制、染色過程中添加進(jìn)來的重鉻酸鉀和重鉻酸鈉等有毒物質(zhì)，如果 長期食用含有皮革水解蛋白粉的食物，鉻重金屬離子便會被人體吸收、積累、中毒，使人體 關(guān)節(jié)疏松腫大，甚至造成兒童死亡。
[0005] L-羥脯氨酸為人體非必需氨基酸，是機(jī)體膠原蛋白（動物水解蛋白）的主要成分之 一，含量相對穩(wěn)定，為膠原蛋白中的特有組分，其含量占10%以上；而乳蛋白中不含有此成 分，如若樣品中含有L(-)_羥脯氨酸，可判定添加了動物水解蛋白。其檢測方法包括比色法、 電泳法、高效液相色譜法等。目前常用的比色法(colorimetry)是通過比較或測量有色物質(zhì) 溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法。比色法檢測試劑毒性高，操作相對繁瑣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種生鮮乳中皮革水解蛋白L-羥脯 氨酸的酶標(biāo)快速檢測方法，該方法靈敏度高，重復(fù)性好，檢測速度快，適用于生鮮乳中皮革 水解蛋白的快速篩查。
[0007] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種生鮮乳中皮革水解蛋白L-羥脯氨酸的酶標(biāo)快速檢測方 法，包括如下步驟：
[0008] 步驟1、試劑準(zhǔn)備:包括氯胺T溶液配制、顯色劑配制、L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制、 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液配制；
[0009] 步驟2、樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的制備：
[0010] a、樣品制備：準(zhǔn)確稱取生鮮乳2g，精確到0.0 001 g，置于水解管中，加濃鹽酸 2. OOmL，加入2滴50g/L苯酚溶液，氮吹3min，在充氮氣的狀態(tài)下封口，將已封口的水解管放 入110 °C的恒溫干燥箱內(nèi)，水解12h，取出，打開水解管，將水解液經(jīng)濾紙過濾到250mL容量瓶 中，用水反復(fù)沖洗水解管和濾紙，洗液并入濾液中，定容，搖勻，作為樣品待測；
[0011] b、標(biāo)準(zhǔn)品制備：準(zhǔn)確稱取濃度為20.0yg/mL的L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液0 . OOmL、 2.50mL、5.00mL、7.50mL、10.00mL分別于100mL容量瓶中，用水定容，搖勻，得到濃度分別為0 yg/mL、0.5yg/mL、l .0yg/mL、l .5yg/mL、2.0yg/mL的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品；
[0012] 步驟3、酶標(biāo)檢測：
[0013]步驟3.1、準(zhǔn)備足夠用的空白酶標(biāo)板；
[0014] 步驟3.2、用移液槍吸取標(biāo)準(zhǔn)品和樣品150yL，分別加入到指定的微孔中，然后加入 60yL現(xiàn)配的氯胺T溶液到每一個微孔中，用封口膜把酶標(biāo)板蓋住，室溫放置20分鐘；
[0015] 步驟3.3、用8通道移液槍移取60yL顯色劑到每一孔里，用封口膜將酶標(biāo)板封好，放 到60 °C干燥箱中20分鐘；
[0016] 步驟3.4、取出酶標(biāo)板，室溫放置數(shù)分鐘，待其到室溫后，用560nm的酶標(biāo)儀測定吸 光度值；
[0017] 步驟4、標(biāo)準(zhǔn)曲線建立和結(jié)果計算；
[0018] 以對標(biāo)準(zhǔn)品所測吸光值為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的L-羥脯氨酸的濃度作為橫坐標(biāo)，繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)樣品測定的吸光值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出樣品中L-羥脯氨酸的的濃度c， 利用如下公式計算出生鮮乳中L-羥脯氨酸的含量：
[0019]
[0020] 式中:X-生鮮乳中L-輕脯氨酸的含量，以％表示；
[0021] C-從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的L-輕脯氨酸的濃度，單位為yg/mL;
[0022] v-樣品溶液的體積，mL;
[0023] m-樣品中生鮮乳的質(zhì)量，單位為g。
[0024] 本發(fā)明的特點還在于，所述步驟1中，氯胺T溶液配制方式具體為:將1.41g氯胺T溶 于10mL水中，然后依次加入10mL正丙醇和80mL緩沖液；
[0025]顯色劑配制方式具體為：稱取10g對二甲氨基苯甲醛，用35mL的純高氯酸溶解，再 緩慢加入65mL異丙醇。
[0026] L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制方式具體為:稱取100.00mg的L-羥脯氨酸用少量水溶 解，加一滴6mo 1/L的鹽酸，用水定容至100mL容量瓶中，得到1.0mg/mL的L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲 備液；
[0027] L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液配制方式具體為：吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液2.00mL于100mL容量瓶 中，用水定容，得到20.0yg/mL的L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液。
[0028]本發(fā)明的特點還在于，所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = 0.1248x+0.0644。
[0029]本發(fā)明的有益效果如下：
[0030] 本發(fā)明提供了一種生鮮乳中皮革水解蛋白L-羥脯氨酸的酶標(biāo)快速檢測方法，該檢 測方法靈敏度高，重復(fù)性好，檢測速度快，適用于生鮮乳中皮革水解蛋白的快速篩查。而且 本發(fā)明檢測方法與衛(wèi)生部指定方法相比所用時間要縮短三分之二以上，而所用試劑量幾乎 是它的百分之三，故本發(fā)明方法檢測快速、成本低、環(huán)境污染少。
【附圖說明】
[0031] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以 根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0032] 圖1為本發(fā)明實施例提供的一種生鮮乳中皮革水解蛋白L-羥脯氨酸的酶標(biāo)快速檢 測方法流程示意圖；
[0033] 圖2為本發(fā)明實施例中建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系圖。
【具體實施方式】
[0034]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；?本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0035]圖1示例性的示出了本發(fā)明實施例提供的一種生鮮乳中皮革水解蛋白L-羥脯氨酸 的酶標(biāo)快速檢測方法流程示意圖，該方法至少可以應(yīng)用于乳及乳制品中L-羥脯氨酸含量的 測定和判定乳及乳制品中是否添加了動物水解蛋白。這是因為L-羥脯氨酸為膠原蛋白中的 特有組分，其含量占10%以上;而乳蛋白中不含有此成分，如若樣品中含有L-羥脯氨酸，則 可判定添加了動物水解蛋白。
[0036]本發(fā)明所用主要儀器設(shè)備如下：
[0037] 酶標(biāo)分析儀(配置560nm濾光片），氮吹儀，恒溫干燥箱（110 °C，60 °C )，具蓋螺紋口 試管（10mL，110°C)，可拆的96孔酶標(biāo)板(空白板）。
[0038] 本發(fā)明所用試劑如無特殊說明均為分析純，水為蒸餾水或同等純度的水。
[0039] 如圖1所示，本發(fā)明實施例提供的一種生鮮乳中皮革水解蛋白L-羥脯氨酸的酶標(biāo) 快速檢測方法，包括如下步驟：
[0040] 步驟1、試劑準(zhǔn)備:包括氯胺T溶液配制、顯色劑配制、L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制、 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液配制；
[0041] 在本發(fā)明實施例中，氯胺T溶液配制方式具體為:將1.41g氯胺T溶于10mL水中，然 后依次加入10mL正丙醇和80mL緩沖液；
[0042]顯色劑配制方式具體為：稱取10g對二甲氨基苯甲醛，用35mL的純高氯酸溶解，再 緩慢加入65mL異丙醇。
[0043] L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制方式具體為:稱取100.0 Omg的L-羥脯氨酸用少量水溶 解，加一滴6mo 1/L的鹽酸，用水定容至100mL容量瓶中，得到1.0mg/mL的L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲 備液；
[0044] L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液配制方式具體為:吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液2. OOmL于lOOmL容量瓶 中，用水定容，得到20.0 yg/mL的L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液。
[0045] 步驟2、樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的制備：
[0046] a、樣品制備：準(zhǔn)確稱取生鮮乳2 g，精確到0.0 0 01 g，置于水解管中，加濃鹽酸 2. OOmL，加入2滴50g/L苯酚溶液，氮吹3min，在充氮氣的狀態(tài)下封口，將已封口的水解管放 入110 °C的恒溫干燥箱內(nèi)，水解12h，取出，打開水解管，將水解液經(jīng)濾紙過濾到250mL容量瓶 中，用水反復(fù)沖洗水解管和濾紙，洗液并入濾液中，定容，搖勻，作為樣品待測；
[0047] b、標(biāo)準(zhǔn)品制備：準(zhǔn)確稱取濃度為20 . Oyg/mL的L-羥脯氨