三唑磷生物條形碼免疫分析測定試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食品安全檢測免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種三唑磷生物條 形碼免疫分析測定試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著高毒農(nóng)藥品種將逐步從市場退出，三唑磷已成為替代甲胺磷農(nóng)藥的主要品 種，近年來其使用量迅速增加，廣泛用于長江中下游流域水稻二化螟的防治。在三唑磷農(nóng)藥 在我國正進(jìn)入市場旺季的同時，國外已經(jīng)開始限制或禁止三唑磷農(nóng)藥的使用與銷售。2004 年11月28日，國家質(zhì)檢總局發(fā)布緊急預(yù)警，稱歐盟于12月31日起正式禁止320種農(nóng)藥在歐盟 銷售。其中涉及中國正在生產(chǎn)、使用以及出口的農(nóng)藥達(dá)60多個品種，其中就包括了三唑磷農(nóng) 藥。其他國家和地區(qū)對三唑磷的最大殘留限量也提出了越來越嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)：日本規(guī)定稻米 中三唑磷的最大殘留限量(MRL)為不得檢出；歐盟除茶葉為0.05mg/kg、棉籽0. lmg/kg外，其 余樣品為0.02mg/kg;我國三唑磷的最大殘留限量一般都限定為0.05mg/kg。因此，加強三唑 磷檢測方法學(xué)研究對于保障我國食品安全和農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易具有重要意義。
[0003] 免疫分析方法的作用和地位目前已得到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛認(rèn)可，免疫分析方法的 研究也是檢測方法研究最熱門的領(lǐng)域之一。在免疫分析方法領(lǐng)域中，我國在酶聯(lián)免疫分析 方法方面開展了較為深入的研究，包括半抗原合成、抗體制備、標(biāo)記物偶聯(lián)、反應(yīng)體系中各 種理化性質(zhì)對免疫分析方法的影響及半抗原結(jié)構(gòu)與其所制備得到抗體之間的構(gòu)效關(guān)系等 方面。近年來，我國學(xué)者在焚光免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、生物傳感器和生物條形碼免 疫分析方法方面也開展了較多的研究工作。
[0004] 基于磁性納米粒子的生物條形碼免疫分析方法，利用生物條形碼信號放大作用及 磁性納米粒子的分離富集作用，其最低檢出限相對于ELISA方法提高了幾個數(shù)量級，致使其 從誕生以來，便獲得了科學(xué)界的高度關(guān)注。生物條形碼指的是可結(jié)合在納米粒子上的大量 相同序列的DNA片段。該方法最早是用于對前列腺特異性抗原（Prostatespecif ic Antigen，PSA)的檢測。該方法主要包括:磁性納米粒子表面修飾PSA單克隆抗體，膠體金納 米探針表面修飾起信號放大作用的生物條形碼和針對PSA的另一種抗體。在PSA存在時，磁 性納米粒子、PSA、膠體金納米探針通過抗原抗體反應(yīng)形成"三明治"夾心復(fù)合結(jié)構(gòu)。形成的 復(fù)合物經(jīng)磁場分離，富集的磁性納米探針通過高溫低鹽法變性，釋放生物條形碼，通過檢測 解離下來的生物條形碼含量便可以間接得到PSA的含量。
[0005] 生物條形碼分析方法近十年來在痕量蛋白質(zhì)和核酸檢測方法得到了快速的發(fā)展， 通過與免疫反應(yīng)相結(jié)合建立的生物條形碼免疫分析方法，將免疫分析方法的檢測限提高到 了一個新的高度。然而該方法建立至今，只能通過構(gòu)建"三明治"結(jié)構(gòu)模式實現(xiàn)對蛋白質(zhì)等 大分子物質(zhì)的檢測。由于三唑磷為小分子化合物，通常情況下只有一個抗原結(jié)合位點，因此 目前生物條形碼免疫分析方法采用的"三明治"結(jié)構(gòu)模式基本不能適用于三唑磷的檢測。
[0006] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種三唑磷生物條形碼免疫分析測定試劑盒，使用該試劑 盒可以特異地定量檢測水中或食品中三唑磷含量。該試劑盒通過競爭反應(yīng)體系進(jìn)行檢測， 克服了目前生物條形碼免疫分析方法采用的"三明治"結(jié)構(gòu)模式基本不能適用于三唑磷的 檢測的缺陷。
[0008] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
[0009] -種三唑磷生物條形碼免疫分析測定試劑盒，所述試劑盒包括盒體，所述盒體內(nèi) 包含有：
[0010] 三唑磷標(biāo)準(zhǔn)品、三唑磷磁性納米探針、單標(biāo)膠體金納米探針、三唑磷雙標(biāo)膠體金納 米探針、DNA生物芯片、銀染試劑。
[0011 ]三挫磷（Tr iazophos)分子式：C12H16N3O3PS; CAS 號：24017-47-8。
[0012] 本發(fā)明通過改變生物條形碼免疫分析方法的現(xiàn)有反應(yīng)模式，建立基于小分子競爭 反應(yīng)模式的生物條形碼免疫分析方法。通過將三唑磷與載體蛋白的偶聯(lián)物包被于磁性納米 粒子表面制備三唑磷磁性納米探針，并于膠體金納米探針表面結(jié)合農(nóng)藥抗體和起信號放大 作用的生物條形碼用以制備三唑磷雙標(biāo)膠體金納米探針，利用磁性納米粒子表面的包被抗 原與農(nóng)藥分子競爭結(jié)合膠體金納米探針表面的抗體建立競爭型免疫化學(xué)反應(yīng)體系。利用磁 分離系統(tǒng)分離免疫結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物，采用熱變性技術(shù)促使膠體金納米探針釋放生物 條形碼，并利用DNA芯片探針和單標(biāo)膠體金納米探針雜交結(jié)合生物條形碼，進(jìn)而利用金標(biāo)銀 染法測定生物條形碼含量，實現(xiàn)對三唑磷農(nóng)藥的定量檢測。
[0013] 該試劑盒的使用效果具有簡便、快速、靈敏、特異、穩(wěn)定等優(yōu)點。并且，根據(jù)本發(fā)明 的檢測系統(tǒng)為開放式操作，簡便快速，特別適合廣大的質(zhì)檢機(jī)構(gòu)推廣使用，為食品安全檢測 提供一種非常有價值的檢測手段。
[0014] 優(yōu)選的，所述三唑磷磁性納米探針由磁性納米粒子和三唑磷完全抗原偶聯(lián)而成； 所述三唑磷完全抗原由三唑磷和載體蛋白偶聯(lián)而成。
[0015] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述載體蛋白為雞卵白蛋白；所述磁性納米粒子的粒徑為18~ 22nm〇
[0016] 雞卵白蛋白（Ovalbumin，OVA)也稱雞卵清白蛋白，由386個氨基酸組成，分子量約 43KcL0VA作為惰性蛋白，它能維持膠體金的膠體穩(wěn)定，起著有分散膠體金顆粒的骨架作用。
[0017] 惰性蛋白也可選用酪蛋白（Casein)或牛血清白蛋白（BSA)等。
[0018] 磁性納米粒子的粒徑對三唑磷完全抗原的偶聯(lián)數(shù)量有著很大的影響，從而影響著 最終反應(yīng)的靈敏度。
[0019] 優(yōu)選的，如上所述的試劑盒：
[0020]所述單標(biāo)膠體金納米探針由單鏈DNA1包被膠體金顆粒得到；
[0021]所述三唑磷雙標(biāo)膠體金納米探針由抗三唑磷抗體和雙鏈DNA包被膠體金顆粒得 到；
[0022] 所述DNA生物芯片由單鏈DNA2點制得到；
[0023] 所述雙鏈DNA由硫醇修飾的單鏈DNA和條形碼單鏈DNA互補配對而成；所述單鏈 DNA1和單鏈DNA2與所述條形碼單鏈DNA存在互補配對關(guān)系，且配對區(qū)域不重疊。
[0024] DNA生物芯片上點制的DNA2為捕獲DNA，能與條形碼DNA互補配對并將其捕獲在芯 片上;單標(biāo)膠體金納米探針上的DNA1的作用在于進(jìn)一步放大條形碼DNA信號。
[0025] 雙標(biāo)膠體金納米探針是雙鏈DNA包被膠體金顆粒和抗被檢物的抗被檢物抗體，雙 鏈DNA中的1條和膠體金顆粒通過Au-S鍵相連，另1條DNA鏈?zhǔn)怯脕碇甘颈粰z物的條形碼 DNA。每一個膠體金顆粒上標(biāo)記有很多條的條形碼DNA，因而起到方法信號的作用，靈敏度較 尚。
[0026] 在實際操作中，條形碼DNA的選擇為現(xiàn)有技術(shù)，只要特異性和靈敏度夠好即可。 [0027]優(yōu)選的，所述膠體金顆粒的粒徑為13~15nm。
[0028] 本申請的技術(shù)要點是通過形成三唑磷磁性納米探針-三唑磷雙標(biāo)膠體金納米探針 的結(jié)合，與三唑磷-三唑磷雙標(biāo)膠體金納米探針的結(jié)合進(jìn)行競爭，并且前者的結(jié)合應(yīng)該可以 均一的分離。靈敏度提高的關(guān)鍵在于被檢物的有效回收和作為每個被檢物識別結(jié)合位點對 應(yīng)的條形碼DNA鏈的有效釋放。條形碼DNA的量對應(yīng)被檢物的量(三唑磷磁性納米探針對被 檢三唑磷的競爭性結(jié)合的抑制率），因此可以通過定量條形碼DNA間接定量痕量的被檢物。 三唑磷磁性納米探針-三唑磷雙標(biāo)膠體金納米探針的結(jié)合實質(zhì)是磁性納米探針中的三唑磷 完全抗原與雙標(biāo)膠體金納米探針中的抗三唑磷抗體的結(jié)合，而二者的結(jié)合強度與抗體/抗 原的量密切相關(guān)，抗體/抗原的量則與膠體金顆粒/磁性納米粒子的粒徑密切相關(guān)。
[0029] 優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，所述三唑磷雙標(biāo)膠體金納米探針具體由以下方法制 備得到：
[0030] 1 )、取膠體金溶液調(diào)pH至8.8~9.2后向其中加入抗三唑磷抗體，攪拌混合，靜置25 ~35min;然后加入硫醇修飾的單鏈DNA鏈，8~12°C靜置36~44h;再調(diào)整pH至7.3~7.5，加 入似01至濃度0.08~0.12111〇1八，8000~110001'/111；[11離心8~12111；[11，棄上清，得到含寡核苷 酸的膠體金；
[0031 ] 2 )、用牛血清白蛋白濃度為0.8~1.2 %的磷酸鹽緩沖液重懸所述含寡核苷酸的膠 體金，孵育1~3h;再加入與所述硫醇修飾的單鏈DNA鏈互補的生物條形碼DNA鏈，室溫雜交3 ~5h，8000~11000r/min離心，棄上清，得到所述三唑磷雙標(biāo)膠體金納米探針。
[0032] 進(jìn)一步優(yōu)選的，在加入NaCl至既定濃度時，在120~180min內(nèi)分2~4次等量加入， 每次間隔40~60min。
[0033]加入NaCl的過程即DNA的老化過程。納米金和DNA都帶負(fù)電，所以會相互排斥，加入 NaCl可以屏蔽掉納米金表面的一些電荷，減少納米粒子間的排斥。但過高濃度的NaCl會導(dǎo) 致鹽離子強度過大，易引起D