新型雙孔免疫側(cè)向?qū)游鰷y(cè)試卡的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)臨床免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種新型雙孔免疫側(cè)向?qū)游鰷y(cè)試卡。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤是一種常見病和多發(fā)病，發(fā)病率居第二位。據(jù)世界衛(wèi)生組織1997年報(bào)告稱全球腫瘤患者每年死亡人數(shù)高達(dá)660萬(wàn)，到2020年全球的腫瘤患者將達(dá)到1500萬(wàn)。各種惡性腫瘤嚴(yán)重地威脅著人類的身體健康。
[0003]目前研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種與惡性腫瘤相關(guān)的標(biāo)志物，例如AFP(甲胎蛋白)、CEA(癌胚抗原)、CA15 — 3、CA19 — 9、CA50、CA125、PSA等等。然而，這些腫瘤相關(guān)標(biāo)志物均為單功能標(biāo)志物。利用單功能腫瘤標(biāo)志物只能檢測(cè)其對(duì)應(yīng)的一類腫瘤，對(duì)其它腫瘤則無(wú)能為力。如果要檢查體內(nèi)是否存在某些常見的惡性腫瘤就必須作多項(xiàng)檢查。
[0004]1987年Geraghty等(I)發(fā)現(xiàn)并克隆了HLA—G13HLA-G是人類白細(xì)胞抗原(HLA)I組中非經(jīng)典的組織相容性抗原。在正常人體中不存在。初期有關(guān)HLA—G的研究集中于胎兒同母親之間的免疫耐受(2)近20年，HLA—G已成為重要的免疫分子，在免疫、生殖、腫瘤、器官移植等方面發(fā)揮著重要作用(3)。免疫組化檢測(cè)結(jié)果證實(shí)在喉癌、食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌等多種惡性腫瘤組織中都能表達(dá)HLA—G。大量的實(shí)驗(yàn)證明，HLA-G是一個(gè)具有高度腫瘤特異性的腫瘤標(biāo)志物，在惡性腫瘤表達(dá)具有普遍性。在惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中其水平在血液、其它體液及腫瘤組織中增高。因此檢測(cè)HLA-G能廣泛地應(yīng)用于診斷各種常見的惡性腫瘤。通過檢測(cè)HLA-G便可探明受檢者體內(nèi)是否存在常見的惡性腫瘤。
[0005]由于在腫瘤發(fā)病的早期往往沒有自覺癥狀，不能引起人們的警覺?？墒且坏┌l(fā)覺自覺癥狀到醫(yī)院看病時(shí)已到無(wú)法根治的中晚期。如果在腫瘤發(fā)病的早期，在未發(fā)覺自覺癥狀之前能夠早期發(fā)現(xiàn)早期腫瘤，進(jìn)行早期治療，就能獲得根治。為了實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)早治療的目標(biāo)開展腫瘤基層普查是必要的。但是由于缺乏基層普查的技術(shù)，所以很難開展腫瘤基層普查。并且目前檢測(cè)腫瘤常用的設(shè)備比較復(fù)雜，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)需要專人操作，不適合基層流動(dòng)性工作。
[0006]側(cè)向免疫分析是一種簡(jiǎn)便、快速、廉價(jià)、可自檢自測(cè)的技術(shù)，很適合在基層篩查早期腫瘤。
[0007]金標(biāo)技術(shù)制備的金顆粒直徑大小往往不均一，直徑不均一的金顆粒在層析過程中運(yùn)動(dòng)速度不同，于是導(dǎo)致拖尾現(xiàn)象。另外金顆粒不穩(wěn)定，容易凝聚或沉淀導(dǎo)致試劑失效。第三，標(biāo)記蛋白的方法很繁瑣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]有鑒于此，本發(fā)明實(shí)施例提供一種雙孔免疫側(cè)向?qū)游鰷y(cè)試卡，主要目的是提高測(cè)試卡檢測(cè)HLA-G的準(zhǔn)確度及側(cè)向?qū)游鲈噭┑姆€(wěn)定性。
[0009]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明主要提供如下技術(shù)方案:
[0010]—方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種新型雙孔免疫側(cè)向?qū)游鰷y(cè)試卡，利用廣譜腫瘤標(biāo)志物HLA-G的抗體為主，以癌胚抗原CEA的抗體和乙肝表面抗原HBsAg的抗體作為參照物，通過三種抗體聯(lián)合檢測(cè)HLA-G，組成篩查癌癥的新型雙孔免疫側(cè)向?qū)游鰷y(cè)試卡。
[0011]作為優(yōu)選，所述雙孔免疫側(cè)向?qū)游鰷y(cè)試卡以三種抗體聯(lián)合檢測(cè)HLA-G。所述測(cè)試卡的A孔窗口設(shè)置Tl和T2標(biāo)志，B孔窗口設(shè)置T3和C的標(biāo)志。
[0012]作為優(yōu)選，以廣譜腫瘤標(biāo)志物HLA-G的抗體為主，輔以CEA、HBsAg的抗體，組成三種抗體聯(lián)合檢測(cè)HLA-G的測(cè)試卡。
[0013]作為優(yōu)選，使用HBsAg的抗體，可以掌控由HBsAg引起的非特異交叉反應(yīng)產(chǎn)生的假陽(yáng)性。
[0014]作為優(yōu)選，使用常用腫瘤標(biāo)志物CEA的抗體，以彌補(bǔ)HLA-G產(chǎn)生的假陰性。
[0015]作為優(yōu)選，測(cè)試卡采用三種抗體聯(lián)合檢測(cè)HLA-G，可以管控假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，式測(cè)試卡具有更高的準(zhǔn)確度。
[0016]作為優(yōu)選，HLA-G和CEA的標(biāo)記抗體Al和A2分別設(shè)置在A孔附近;HBsAg的標(biāo)記抗體A3設(shè)置在B孔附近。
[0017]作為優(yōu)選，T1、T2和T3標(biāo)志分別固定HLA-G、CEA和HBsAg的捕獲抗體B1、B2和B3。
[0018]作為優(yōu)選，當(dāng)A孔和B孔加入待測(cè)血清后，標(biāo)記抗體A1、A2、A3分別與相應(yīng)的抗原結(jié)合后形成彩色免疫復(fù)合物，沿著NC膜向前移動(dòng)，當(dāng)?shù)竭_(dá)T1、T2、T3標(biāo)志處，與固定在這里的捕獲抗體Β1、Β2和Β3分別結(jié)合形成鮮亮的彩色線條。根據(jù)待測(cè)血清中所含三種抗原存在與否，表現(xiàn)在Tl、Τ2、Τ3標(biāo)志處有無(wú)彩色線條形成，由此可以得到測(cè)試卡檢測(cè)HLA-G的結(jié)果。依據(jù)制定的判斷標(biāo)準(zhǔn)，可以掌控假陽(yáng)性和假陰性，準(zhǔn)確判斷有無(wú)HLA-G。
[0019]作為優(yōu)選，測(cè)試卡所用的抗體A為兔抗體。當(dāng)過量的彩標(biāo)記抗體A到達(dá)C標(biāo)志處，彩標(biāo)抗體A與固定在C處的羊抗兔IgG結(jié)合形成彩色線條，表示試劑有效。
[0020]采用三種抗體聯(lián)合檢測(cè)HLA-G的新型雙孔免疫側(cè)向?qū)游鰷y(cè)試卡可掌控假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，有效提高檢測(cè)HLA-G的準(zhǔn)確度。
[0021]作為優(yōu)選，所述測(cè)試卡采用彩色高分子微球代替?zhèn)鹘y(tǒng)側(cè)向?qū)游龅慕痤w粒與被測(cè)抗原的抗體A結(jié)合形成彩色的標(biāo)記抗體A。
[0022]作為優(yōu)選，所述彩色高分子微球上具有羧基或氨基。
[0023]作為優(yōu)選，所述高分子微球的直徑為10-150納米。
[0024]作為優(yōu)選，所述彩色高分子微球采用市售的彩色高分子微球，所述彩色高分子微球帶有羧基或氨基，與水溶性碳二亞胺(EDC)作用，使高分子彩色微球與蛋白或多肽結(jié)合，使蛋白或多肽標(biāo)記上彩色高分子微球，形成彩色免疫微球，用于免疫側(cè)向?qū)游鰷y(cè)定;高分子微球或與戊二醛作用，使其與蛋白或多肽結(jié)合，使蛋白或多肽標(biāo)記上彩色高分子微球，形成了彩色免疫微球，用于免疫側(cè)向?qū)游鰷y(cè)定。
[0025]作為優(yōu)選，所述彩色免疫微球的制備方法，包括如下步驟:
[0026](I)選擇直徑合適的彩色高分子微球，彩色高分子微球的直徑通常在10-150納米之間；
[0027](2)單抗々先經(jīng)?!18.0-9.0，0.0111101/1 tris-HCL緩沖液透析，過夜后離心除去變性蛋白沉淀備用；
[0028](3)高分子微球懸在pH8.0-9.0，0.0lmol/L tris-HCL緩沖液中，在蛋白交聯(lián)劑炭二亞胺(EDC)、N-羥基硫代琥柏酰亞胺或己二酸二酰肼存在下，在不斷攪拌下，滴入除去變形蛋白沉淀的單抗A;加完單抗A后繼續(xù)攪拌10分鐘，然后加入PEG20000 (聚乙二醇20000)，使PEG20000在緩沖溶液中最終濃度達(dá)到0.1 %以穩(wěn)定高分子微球與單抗A結(jié)合形成的彩色的標(biāo)記抗體A，繼續(xù)反應(yīng)20分鐘至I小時(shí)；
[0029](4)洗滌:彩色免疫微球用pH8.0-9.0,0.0lmol/L Tris-HCL緩沖液離心洗滌兩次，所述緩沖液中PEG20000的濃度為1% ;
[°03°] (5)在標(biāo)記物離心沉淀中加入10毫升pH8.0-9.0,0.0lmol/L tris-HCL緩沖液，再往其中加牛血清白蛋白(BSA)達(dá)I %，再加入占總體積50%的甘油，疊氮鈉防腐，4度冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0031]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0032]本發(fā)明實(shí)施例采用三種抗體聯(lián)合檢測(cè)HLA-G的新型雙孔免疫側(cè)向?qū)游鰷y(cè)試卡，可掌控假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，可有效提高檢測(cè)HLA-G的準(zhǔn)確度。
[0033]彩色帶有活性基團(tuán)的高分子微球與抗體共價(jià)鍵結(jié)合形成彩色免疫微球。彩色微球標(biāo)記抗體極為簡(jiǎn)單快速，標(biāo)記抗體后十分穩(wěn)定不易凝聚或沉淀。用彩色高分子微球代替金顆粒用于免疫側(cè)向?qū)游鋈〉昧撕芎眯Ч?br>【附圖說明】
[0034]圖1為本發(fā)明實(shí)施例的新型雙孔免疫側(cè)向?qū)游鰷y(cè)試卡的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。在下述說明中，不同的“一實(shí)施例”或“實(shí)施例”指的不一定是同一實(shí)施例。此外，一或多個(gè)實(shí)施例中的特定特征、結(jié)構(gòu)、或特點(diǎn)可由任何合適形式組合。
[0036]實(shí)施例1:用紅色聚苯乙烯微球標(biāo)記HLA-G單抗Al
[0037](I)準(zhǔn)備彩色聚苯乙烯微球:采用市售紅色聚苯乙烯微球，直徑在10-150納米，其上帶有活潑羧基或氨基；
[0038](2)HLA-G單抗Al先經(jīng)pH8.0-9.0,0.0lmol/L tris-HCL緩沖液透析過夜，然后離心除去變型蛋白沉淀備用；
[0039](3)將聚苯乙烯彩色微球懸在pH8.0-9.0,0.01mol/L tris-HCL緩沖液中，在蛋白交聯(lián)劑炭二亞胺(EDC)、N-羥基硫代琥柏酰亞胺、己二酸二酰肼等存在下，在不斷攪拌下，滴入HLA-G單抗Al ；加完HLA-G單抗Al后繼續(xù)攪拌10分鐘，然后加入PEG20000，使PEG20000在緩沖液中的最終濃度達(dá)到0.1 %以穩(wěn)定彩色免疫微球;繼續(xù)反應(yīng)20分鐘至I小時(shí)；
[0040](4)洗滌:標(biāo)記物用pH8.0-9.0,0.0lmol/L Tris-HCL緩沖液洗滌兩次，緩沖液中PEG20000的濃度為1%;
[0041 ] (5)在標(biāo)記物離心沉淀中加入10毫升pH8.0-9.0,0.0lmol/L tris-HCL緩沖液，再往其中加BSA達(dá)I %，再加入體積占50%的甘油，以疊氮鈉防腐，4度冰箱保存?zhèn)溆?。也可?20攝氏度冰箱保存一年以上。
[0042]實(shí)施例2:新型雙孔免疫側(cè)向?qū)游鰷y(cè)試卡(簡(jiǎn)稱測(cè)試卡)的制備
[0043](I)準(zhǔn)備HLA-G、CEA、HBsAg三者的標(biāo)記抗體Al、A2、A3。把標(biāo)記抗體A1、A2設(shè)置在A孔附近的玻纖膜上，標(biāo)記抗體A3設(shè)置在B孔附近的玻纖膜上。請(qǐng)參閱附圖1。
[0044](2)準(zhǔn)備HLA-G、CEA、HBsAg三者的捕獲抗體B1、B2、B3。把捕獲抗體B1、B2固定住A孔窗口的Tl、T2標(biāo)志處的NC膜上。把捕獲抗體B3固定在B孔窗口的Τ3