結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物、表達(dá)評(píng)估方法、試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物、該標(biāo)記物在 制備試劑盒中的應(yīng)用、該標(biāo)記物的表達(dá)評(píng)估方法、包含該標(biāo)記物的試劑盒及該試劑盒在用 于結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物表達(dá)水平檢測(cè)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)直腸癌包括結(jié)腸癌和直腸癌，是全世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，其病死率位居 全球惡性腫瘤死因的第二位，進(jìn)展期結(jié)直腸癌預(yù)后較差。根據(jù)國(guó)際癌癥研究組織2005年 公布的數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，其中大多數(shù)為結(jié)腸癌。我國(guó)結(jié)腸癌 的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)病率為13. 29/10萬，發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。結(jié)直腸癌的發(fā)生與飲食、環(huán)境、遺傳 等密切相關(guān)，是多因素協(xié)同作用的結(jié)果。結(jié)直腸癌的防治研究引起人們的高度重視，生物 標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與檢測(cè)，對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展、治療效果及預(yù)后判斷有一定的臨床指 導(dǎo)意義。
[0003] TNM分期目前是判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后的最重要的臨床預(yù)測(cè)指標(biāo)。然而，許多患者 即使??Μ分期屬于早期，腫瘤仍有可能復(fù)發(fā)。因此需要研究更好的用于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的預(yù)后標(biāo) 志物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物 SLC12A5,其高水平的表達(dá)與患者的預(yù)后較差成正相關(guān)。
[0005] 本發(fā)明另一目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記 物在制備試劑盒中的應(yīng)用，該試劑盒可以用于結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物SLC12A5的表達(dá)水 平檢測(cè)。
[0006] 本發(fā)明又一目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記 物的表達(dá)評(píng)估方法，可以評(píng)估結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物SLC12A5的表達(dá)水平。
[0007] 本發(fā)明再一目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種試劑盒，可用于檢測(cè)結(jié) 直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物SLC12A5的表達(dá)水平。
[0008] 本發(fā)明的還一目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種試劑盒在用于結(jié)直腸 癌預(yù)后判斷標(biāo)記物SLC12A5表達(dá)水平檢測(cè)中的應(yīng)用，通過應(yīng)用該試劑盒可方便地檢測(cè)結(jié)直 腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物SLC12A5的表達(dá)水平。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0010] -種結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物，所述結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物SLC12A5的氨基酸 序列如SEQ N0 :1所示。
[0011] -種結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物在制備試劑盒中的應(yīng)用，所述試劑盒用于氨基酸序 列如SEQ N0 :1所示的結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物SLC12A5表達(dá)水平的檢測(cè)。
[0012] -種結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物的表達(dá)評(píng)估方法，包括：
[0013] 獲取待測(cè)標(biāo)本；
[0014] 將包埋所述待測(cè)標(biāo)本的蠟塊切成切片；
[0015] 對(duì)所述切片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)；
[0016] 根據(jù)氨基酸序列如SEQ N0 :1所示的結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物SLC12A5的陽(yáng)性細(xì) 胞染色的百分比評(píng)估結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物SLC12A5的表達(dá)水平。
[0017] -種試劑盒，用于結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物的表達(dá)水平檢測(cè)，包括一抗，所述一抗 為氨基酸序列如SEQ N0 :1所示的結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物SLC12A5的抗體。
[0018] 以及，一種上述試劑盒在用于結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物表達(dá)水平檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明提供的結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物SLC12A5,在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中起著重 要的促進(jìn)作用，SLC12A5在正常腸粘膜組織中表達(dá)沉默，但是在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平高低 不一，大樣本的臨床資料分析發(fā)現(xiàn)SLC12A5的高水平的表達(dá)與患者的預(yù)后較差成正相關(guān)， 提示SLC12A5有望成為重要的結(jié)直腸癌患者預(yù)后的生物標(biāo)記物。
[0020] 采用本發(fā)明的結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物，可以制備用于氨基酸序列如SEQ N0 :1 所示的結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物SLC12A5的表達(dá)水平檢測(cè)的試劑盒。
[0021] 本發(fā)明提供的結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物的表達(dá)評(píng)估方法，可以檢測(cè)結(jié)直腸癌預(yù)后 判斷標(biāo)記物的表達(dá)水平，有助于判斷結(jié)直腸癌患者的預(yù)后情況。
[0022] 本發(fā)明提供的試劑盒，可方便地檢測(cè)結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物的表達(dá)水平
[0023] 采用本發(fā)明提供的試劑盒，可方便檢測(cè)結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物的表達(dá)水平。
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的SLC12A5在結(jié)直腸癌及正常腸粘膜中的表達(dá)水平結(jié)果；
[0025] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中SLC12A5在成對(duì)的結(jié)直腸癌和癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量 結(jié)果；
[0026] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中SLC12A5在結(jié)直腸癌中的低表達(dá)和高表達(dá)的示意圖；
[0027] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線圖；
[0028] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例2中裸鼠的腫瘤重量的直方圖；
[0029] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例3中SLC12A5不同表達(dá)水平對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后判斷的 Kaplan-Meier分析曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0031] 本發(fā)明提供了一種結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物。該結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物 SLC12A5的氨基酸序列如SEQ N0 :1所示。
[0032] 該結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物SLC12A5由全基因組測(cè)序及大樣本結(jié)直腸癌研究發(fā) 現(xiàn)，在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中起著重要的促進(jìn)作用，SLC12A5在正常腸粘膜組織中表達(dá)沉默， 但是在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平高低不一，大樣本的臨床資料分析發(fā)現(xiàn)SLC12A5的高水平的 表達(dá)與患者的預(yù)后較差成正相關(guān)，提示SLC12A5有望成為重要的結(jié)直腸癌患者預(yù)后的生物 標(biāo)記物。
[0033] 下述實(shí)施例1表征了該結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物SLC12A5在正常組織和結(jié)直腸 癌中的表達(dá)水平。該實(shí)施例驗(yàn)證了 SLC12A5在正常腸粘膜組織中表達(dá)沉默，但是在結(jié)直腸 癌中的表達(dá)水平高低不一，從而可以作為結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物。實(shí)施例2表征了敲低 SLC12A5的表達(dá)對(duì)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)影響，從而論證了該SLC12A5在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中起著 重要的促進(jìn)作用，表明其可以作為結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物。
[0034] 實(shí)施例1SLC12A5在結(jié)直腸癌表達(dá)上調(diào)試驗(yàn)
[0035] 分別在結(jié)直腸癌及正常腸粘膜中應(yīng)用本發(fā)明實(shí)施例的免疫組化方法檢測(cè)SLC12A5 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)SLC12A5在正常腸粘膜中表達(dá)沉默，而在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)。其結(jié)果如 圖1所示，圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的SLC12A5在結(jié)直腸癌及正常腸粘膜中的表達(dá)水平結(jié)果。 其中，圖（a)表示結(jié)直腸癌組織（CRC tumor tissues)，圖（b)表示癌旁正常組織（Adjacent normal tissues)〇
[0036] 基于SLC12A5在結(jié)直腸癌的上調(diào)現(xiàn)象，選取15對(duì)結(jié)直腸癌組織樣本，并利用免疫 組化分析其SLC12A5的表達(dá)情況。結(jié)果如圖2所示，圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中SLC12A5在 成對(duì)的結(jié)直腸癌和癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果，其中T表示結(jié)直腸癌組織，AN表示癌旁 組織。從圖2可以看出，SLC12A5在結(jié)直腸癌的表達(dá)量顯著高于癌旁組織中的表達(dá)量。根 據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物的表達(dá)評(píng)估方法的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估結(jié)直腸癌標(biāo) 記物的表達(dá)水平，其結(jié)果如圖3所示。圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中SLC12A5在結(jié)直腸癌中的 低表達(dá)和尚表達(dá)的不意圖，其中，圖（a)表不低表達(dá)，圖（b)表不尚表達(dá)。
[0037] 實(shí)施例2敲低SLC12A5的表達(dá)對(duì)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)影響的體內(nèi)試驗(yàn)
[0038] 隨機(jī)將對(duì)照細(xì)胞株HCT116/control或HCT116/shSLC12A5注入到裸鼠的背側(cè)，并 對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)模式進(jìn)行了比較。腫瘤體積每3天測(cè)量一次，持續(xù)大約三個(gè)星期。通過測(cè)量最 長(zhǎng)和最短的腫瘤直徑長(zhǎng)度（體積公式=0. 5X長(zhǎng)X2X寬）計(jì)算腫瘤體積（mm3)。接種后 22天，實(shí)驗(yàn)終止，老鼠被處死。裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線如圖4所示，其中，C表示注入HCT116/ control的腫瘤生長(zhǎng)曲線，S表示注入HCT116/shSLC12A5的腫瘤生長(zhǎng)曲線。注射HCT116/ shSLC12A5裸鼠的平均腫瘤大小顯著低于注射HCT116/control的對(duì)照組裸鼠（P〈0. 001， 方差分析，η = 5/組）。將腫瘤分離，測(cè)量重量。如圖5所示，直方圖分別表示HCT116/ shSLC12A5和HCT116/control兩組的腫瘤重量（Ρ值小于0.05, t檢驗(yàn)），其中，C表示注 入HCT116/control的腫瘤重量，S表示注入HCT116/shSLC12A5的腫瘤重量。從HCT116/ shSLC12A5組分離下的腫瘤組織比對(duì)照組輕（P〈0. 05)。
[0039] 針對(duì)該SLC12A5可以作為結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物的特性，本發(fā)明還提供了該結(jié) 直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物SLC12A5在制備試劑盒中的應(yīng)用，該試劑盒用于氨基酸序列如SEQ N0 :1所示的結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物SLC12A5表達(dá)水平的檢測(cè)。
[0040] 針對(duì)該SLC12A5可以作為結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物的特性，本發(fā)明還提供了一種 結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物的表達(dá)評(píng)估方法，可以通過該方法評(píng)估結(jié)直腸癌預(yù)后判斷標(biāo)記物 的表達(dá)水平，從而判斷結(jié)直腸癌患者的預(yù)后情況。該方法包括如下的步驟：
[0041] 步驟S10 :獲取待測(cè)標(biāo)本。
[0042] 待測(cè)標(biāo)本可以是結(jié)直腸癌新鮮樣本或者蠟塊標(biāo)本。
[0043] 步驟S20 :將包埋待測(cè)標(biāo)本的蠟塊切成切片。
[0044] 該步驟的目的是包埋腫瘤