經(jīng)由自體干細(xì)胞動(dòng)員的創(chuàng)傷愈合的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2013年11月22日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/907,624號(hào)以及于2013 年4月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61 /816，827號(hào)的權(quán)益，所述美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)中的每一個(gè)通 過引用整體并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及創(chuàng)傷愈合領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了可用于經(jīng)由自體干細(xì)胞動(dòng)員 改善創(chuàng)傷愈合的方法和組合物。
[0004] 以電子方式提交的材料通過引用并入
[0005] 本申請(qǐng)包含序列表。序列表已經(jīng)以標(biāo)題為"P12415-03_ST25.txt"的ASCII文本文 件經(jīng)由EFS-Web以電子方式提交。序列表的大小為2,713字節(jié)，并且創(chuàng)建于2014年4月24日。 據(jù)此通過引用整體并入。
【背景技術(shù)】
[0006] 在美國(guó)每年有多于125萬人遭受燒傷以及650萬人具有由壓力、靜脈淤滯或糖尿病 引起的慢性皮膚潰瘍(Singer and Clark，1999)。這些病況的治療仍不完善并且費(fèi)用昂貴。 希望干細(xì)胞療法可以證明是有益的，因?yàn)橐呀?jīng)越來越明確確定的是干細(xì)胞在創(chuàng)傷愈合中起 著重要作用。例如，已經(jīng)顯示，人工皮膚替代物在將干細(xì)胞摻入這些膜時(shí)更有效。燒傷愈合 的質(zhì)量得到改善(Leonardi等，2012)，減少了瘢痕形成并且重建皮膚附屬器(Mansilla等， 2010 ;Tamai等，2011 ;Huang和BurcU 2012)。慢性靜態(tài)糖尿病潰瘍的治療已經(jīng)通過將患者的 骨髓(BM)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)與埋入可生物降解的膠原膜(ColadermR)的自體皮膚成纖維 細(xì)胞組合使用而得到改善(Vojtassak等，2006)。已經(jīng)顯示來自胚胎來源和出生后來源的BM 細(xì)胞修復(fù)膠原合成中的遺傳缺陷和基膜缺陷，從而促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合（Chino等，2008 ; Tolar等，2009 ;Fujita等，2010)。最近，臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在患有由缺乏Col 7引起的發(fā)皰皮膚 病癥的人中的同種異體的全BM移植致使皮膚完整性恢復(fù)以及Col 7在基膜中表達(dá)(Wagner 等，2010)。
[0007]許多基礎(chǔ)的細(xì)胞研究也已經(jīng)強(qiáng)調(diào)皮膚與BM之間的可塑關(guān)系。在具有造血譜系和間 充質(zhì)譜系的真皮中的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞來源于BM，并且這些細(xì)胞的數(shù)目在皮膚創(chuàng)傷之后增 加(Fathke等，2004; Ishii等，2005)。在BM移植之后，供體細(xì)胞已經(jīng)替換一些角化細(xì)胞并且 已經(jīng)在表皮中存留至少3年(Korbling等，2002) AM細(xì)胞有助于胎兒皮膚形成，因?yàn)閷⒕G色 熒光蛋白（GFP)BM細(xì)胞輸注入小鼠的子宮中導(dǎo)致GFP-陽性細(xì)胞在形成的皮膚中積聚，所述 皮膚特別是與形成毛囊相關(guān)的(Chino等，2008)。
[0008]這些大量的研究記錄BM干細(xì)胞在創(chuàng)傷愈合中的重要性并且提出了令人向往的可 能性:可利用細(xì)胞過程制定實(shí)用的治療方案來治療需要立即治療的大量全皮層燒傷和大量 軟組織損傷。通過利用干細(xì)胞改善創(chuàng)傷修復(fù)的可能性使用NIH登記簿列出的基于MSC的療法 通過存在的90個(gè)臨床試驗(yàn)得以證實(shí)(Cerque ira等，2012)。
[0009] 為避免價(jià)格昂貴且耗時(shí)的內(nèi)源干細(xì)胞的制備，我們計(jì)劃在這些研究中將內(nèi)源干細(xì) 胞與AMD3100和他克莫司（Tacrolimus)藥理動(dòng)員。已經(jīng)顯示AMD3100能在動(dòng)物和人中將來自 BM的內(nèi)源干細(xì)胞驅(qū)向血流。低劑量的他克莫司證明具有協(xié)同效應(yīng)，組合治療有希望成為將 干細(xì)胞呈遞至損害區(qū)域的簡(jiǎn)單、安全且迅速的方法。在此，我們?cè)谛∈蠛痛笫笾兄斡?皮膚創(chuàng)傷來檢驗(yàn)這一假設(shè)。發(fā)現(xiàn)該治療能夠?qū)⑼耆系臅r(shí)間減少25%，我們描繪了創(chuàng)傷 中干細(xì)胞/祖細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞因子/生長(zhǎng)因子的特性并且使用譜系示蹤證實(shí)動(dòng)員的CD133+ 干細(xì)胞在創(chuàng)傷區(qū)的血管生成和毛囊再生中的重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明至少部分基于這樣的發(fā)現(xiàn):干細(xì)胞動(dòng)員劑和免疫抑制劑可被用于促進(jìn)或改 善患者中的創(chuàng)傷愈合。事實(shí)上，如本發(fā)明的實(shí)施方案中所述的內(nèi)源性干細(xì)胞的藥理學(xué)擴(kuò)增 是吸引人的，因?yàn)樗峁┝讼驌p傷區(qū)呈遞干細(xì)胞的簡(jiǎn)單、迅速的方法。
[0011] 如本文所述，本發(fā)明人假設(shè):用AMD3100(即普樂沙福(plerixafor))與低劑量的他 克莫司組合動(dòng)員骨髓干細(xì)胞將在一些實(shí)施方式中促進(jìn)再上皮化以及在進(jìn)一步實(shí)施方式中 促進(jìn)毛囊的再生，從而產(chǎn)生較迅速的正常皮膚的恢復(fù)。為檢驗(yàn)該假設(shè)，我們首先檢查普樂沙 福、他克莫司或雙重藥物對(duì)全皮層皮膚切除的小鼠模型中的創(chuàng)傷愈合的效果。第二，我們描 述了創(chuàng)傷區(qū)中干細(xì)胞/祖細(xì)胞和相關(guān)的細(xì)胞因子/生長(zhǎng)因子的特征。最后，我們通過使用譜 系示蹤來評(píng)估動(dòng)員的CD133+干細(xì)胞對(duì)創(chuàng)傷區(qū)的血管生成和毛囊再生的貢獻(xiàn)。
[0012] 更具體地，在特定實(shí)施方式中，低劑量而非高劑量的他克莫司(FK-506)經(jīng)由將產(chǎn) 生SDF-I的巨噬細(xì)胞募集至創(chuàng)傷區(qū)來改善創(chuàng)傷愈合。另外，用普樂沙福與低劑量的他克莫司 組合動(dòng)員骨髓干細(xì)胞加速創(chuàng)傷愈合、促進(jìn)再上皮化以及促進(jìn)毛囊再生。事實(shí)上，低劑量的他 克莫司與普樂沙福的組合通過促進(jìn)皮膚組分的再上皮化和分化來改善創(chuàng)傷愈合。
[0013]因此，在一方面，本發(fā)明提供了可用于改善患者的創(chuàng)傷愈合的方法和組合物。在一 個(gè)實(shí)施方式中，用于改善患者的創(chuàng)傷愈合的方法包括向患者施用治療有效量的干細(xì)胞動(dòng)員 劑和免疫抑制劑。在一些實(shí)施方式中，干細(xì)胞動(dòng)員劑選自由AMD3100、AMD3465、TG-0054、 8〇140、6-03?、61-03?、30?-1和30?構(gòu)成的組。在【具體實(shí)施方式】中，干細(xì)胞動(dòng)員劑為0乂〇?4拮 抗劑。在更具體的實(shí)施方式中，干細(xì)胞動(dòng)員劑為AMD3100。在其它實(shí)施方式中，免疫抑制劑選 自由他克莫司、環(huán)孢菌素、莫羅單抗-CD3(0rth 〇Cl〇ne 0KT3)、麥考酚酯和西羅莫司構(gòu)成的 組。在【具體實(shí)施方式】中，免疫抑制劑為他克莫司。在特定實(shí)施方式中，以低劑量施用免疫抑 制劑。在某些實(shí)施方式中，干細(xì)胞動(dòng)員劑和免疫抑制劑為相同化合物。
[0014] 在另一實(shí)施方式中，改善患者的創(chuàng)傷愈合的方法包括向患者施用治療有效量的干 細(xì)胞動(dòng)員劑和低劑量的免疫抑制劑。在更具體的實(shí)施方式中，改善患者的創(chuàng)傷愈合的方法 包括向患者施用治療有效量的AMD3100和低劑量的他克莫司。在甚至更具體的實(shí)施方式中， 低劑量的他克莫司為約〇. 〇lmg/kg至約0.05mg/kg。
[0015] 本發(fā)明還提供改善患者的創(chuàng)傷愈合的方法，其包括向患者施用治療有效量的藥劑 (agent)和低劑量的免疫抑制劑，所述藥劑動(dòng)員CD34+和/或CD133+干細(xì)胞。在某些實(shí)施方式 中，動(dòng)員⑶34+和/或⑶133+干細(xì)胞的藥劑為AMD3100并且免疫抑制劑為他克莫司。
[0016] 在另一方面，藥劑充當(dāng)干細(xì)胞動(dòng)員劑和免疫抑制劑兩者。在一個(gè)實(shí)施方式中，改善 患者的創(chuàng)傷愈合的方法包括以足以將干細(xì)胞動(dòng)員至接受者的外周血的量向患者施用低劑 量的他克莫司。在【具體實(shí)施方式】中，低劑量的他克莫司為約O.Olmg/kg至約0.05mg/kg。在另 一實(shí)施方式中，低劑量的他克莫司導(dǎo)致約〇. lng/ml至約10ng/ml的血液濃度范圍。在更具體 的實(shí)施方式中，低劑量的他克莫司為約〇.〇lmg/kg至約0.05mg/kg。在另一實(shí)施方式中，低劑 量包括約O.lyg/kg至I mg/kg。
[0017] 在某些實(shí)施方式中，所述方法還包括施用第二藥劑以將干細(xì)胞動(dòng)員至外周血。在 一個(gè)實(shí)施方式中，干細(xì)胞動(dòng)員劑選自由 AMD3100、AMD3465、TG-0054、BKT140、G-CSF、GM-CSF、 SDF-I和SCF構(gòu)成的組。在【具體實(shí)施方式】中，干細(xì)胞動(dòng)員劑為CXCR4拮抗劑。在更具體的實(shí)施 方式中，干細(xì)胞動(dòng)員劑為AMD3100。
[0018] 本發(fā)明還提供改善患者的創(chuàng)傷愈合的方法，其包括以足以將⑶34+和/或⑶133+干 細(xì)胞動(dòng)員至外周血的量向患者施用低劑量的他克莫司。在【具體實(shí)施方式】中，低劑量的他克 莫司為約0.05mg/kg至約0.5mg/kg(在嗤齒動(dòng)物中，所述量可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員轉(zhuǎn)化成 人類劑量）。
[00?9]在另一實(shí)施方式中，改善患者的創(chuàng)傷愈合的方法包括以約0.01mg/kg/天至約 0.05mg/kg/天的劑量向患者施用他克莫司，其中所述劑量范圍足以將⑶34+和/或⑶133+干 細(xì)胞動(dòng)員至外周血。在另一實(shí)施方式中，改善患者的創(chuàng)傷愈合的方法包括以約〇.〇lmg/kg至 約0.075mg/kg的劑量向患者施用他克莫司，其中所述劑量范圍足以將⑶34+和/或⑶133+干 細(xì)胞動(dòng)員至外周血。在特定實(shí)施方式中，患者為糖尿病患者或者遭受燒傷。
[0020]在某些實(shí)施方式中，低劑量的他克莫司導(dǎo)致約0. lng/ml至約10ng/ml的血液濃度。 在其它實(shí)施方式中，可施用低于約〇.〇75mg/kg/天（口服)或低于約0.01mg/kg/天（IV)的任 何量。
[0021]用于免疫抑制的他克莫司的正常劑量為約0. lmg/kg/天至0.3mg/kg/天（口服）以 及約0.01mg/kg/天至0.05mg/kg/天（IV)。在某些實(shí)施方式中，他克莫司的低劑量為約正常 劑量的1/10，例如約〇 · 〇lmg/kg/天至0 · 03mg/kg/天（口服）以及約0 · 001mg/kg/天至 0·005mg/kg/天（IV)。
[0022] 本發(fā)明提供了在用于改善對(duì)象中創(chuàng)傷愈合的方法中使用的干細(xì)胞動(dòng)員劑和免疫 抑制劑，其中干細(xì)胞動(dòng)員劑和免疫抑制劑以治療有效量施用于對(duì)象，并且其中以本文所述 的低劑量施用免疫抑制劑。動(dòng)員CD34+和/或CD133+干細(xì)胞的藥劑以及低劑量的免疫抑制劑 用于治療器官移植接受者的方法中，其中所述干細(xì)胞動(dòng)員劑和所述免疫抑制劑以治療有效 量施用于接受者。干細(xì)胞動(dòng)員劑和免疫抑制劑，其中動(dòng)員CD34+和/或CD133+干細(xì)胞的藥劑為 AMD3100并且免疫抑制劑為他克莫司。根據(jù)此處所述的任一實(shí)施方式中所使用的干細(xì)胞動(dòng) 員劑和免疫抑制劑，其中所述干細(xì)胞動(dòng)員劑和所述免疫抑制劑為相同化合物。
【附圖說明】
[0023] 圖1示出用低劑量的他克莫司和AMD3100組合治療的小鼠中加速的創(chuàng)傷愈合。（a) 模型:在第〇天，在C57BL/6或CD133+/C-L小鼠中創(chuàng)建四個(gè)圓形切除創(chuàng)傷。(b)創(chuàng)傷測(cè)量。使用 Adobe Photoshop軟件測(cè)定創(chuàng)傷區(qū)域。（c)早期愈合。小鼠(n = 6)中代表性的創(chuàng)傷照片在第5 天開始顯示出顯著差異。（d)小鼠（n = 6)中創(chuàng)傷閉合的定量分析。噸〈0.05。（幻在第5天時(shí)創(chuàng) 傷的H&E顯微照片。比例尺:200μηι。（;〇用夾板固定的（splinted)創(chuàng)傷模型。（g)在用夾板固 定的小鼠中皮膚創(chuàng)傷愈合的肉眼可見分析。（h)在用夾板固定的小鼠（η = 6)中創(chuàng)傷閉合的 定量分析。*P〈〇.〇5。所有數(shù)據(jù)表示平均值±SEM。
[0024] 圖2示出在用雙重藥物療法治療的小鼠的愈合皮膚中毛囊再生增加以及瘢痕形成 減少。（a)再上皮化創(chuàng)傷的代表性肉眼可見的外觀(第15天）。卬)來自瘢痕中部的代表性顯 微鏡可見的H&E-染色切片顯示愈合創(chuàng)傷內(nèi)新的毛囊。瘢痕區(qū)通過虛線描畫出輪廓。兩條豎 直的點(diǎn)線有助于區(qū)別具有與在鹽水處理組中愈合的瘢痕區(qū)的長(zhǎng)度相同的區(qū)域。比例尺:200 Wiu(C)用Masson三色法染色的相鄰切片。（d)在創(chuàng)傷后15天雙重藥物治療的動(dòng)物的代表性 照片顯示出在再上皮化創(chuàng)傷中毛發(fā)生長(zhǎng)。（e)在愈合的瘢痕內(nèi)（2mm)毛囊的定量。數(shù)據(jù)表示 平均值土 SEMb = ^。*?^ .01。
[0025] 圖3示出用雙重藥物療法募集BM干細(xì)胞。（a)在損傷之后第5天通過流式細(xì)胞術(shù)定 量分析外周血中的譜系陰性(Lin-)c-Kit+、⑶34+和⑶133+細(xì)胞。數(shù)據(jù)表示平均值土SEM(n =3)。*?〈0.05。（13)在損傷之后第5天對(duì)來自受傷小鼠的組織切片中的干細(xì)胞標(biāo)志物(3-1(^、 CD34和CD133以及內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31進(jìn)行免疫熒光染色?？騾^(qū)顯示在較高放大倍數(shù)下，接 受雙重藥物治療的小鼠具有管狀排列的CD133細(xì)胞，其與CD31共染色。細(xì)胞核被DAPI染成藍(lán) 色。代表性照片為每組η = 3的個(gè)體受損皮膚樣本。epi，表皮;we，創(chuàng)傷邊緣。比例尺:200μηι。 [0026]圖4示出SDF-I和⑶133在用雙重藥物療法治療的小鼠的皮膚創(chuàng)傷中的表達(dá)增加。 在損傷后5天對(duì)受傷皮膚中的肉芽組織進(jìn)行半定量RT-PCR分析。（a)吸引子分子SDF-I的 mRNA表達(dá)在低劑量的他克莫司治療組中顯著增加，并在雙重治療組中進(jìn)一步升高。（b)干細(xì) 胞標(biāo)志物⑶133mRNA水平在雙重治療組的創(chuàng)傷中也顯著較高，所述水平平行SDF-I基因表 達(dá)。所有數(shù)據(jù)表示平均值土 SEM(n = 3)。*p〈0.05。（c)在損傷之后5天對(duì)SDF-l和F4/80(巨噬 細(xì)胞的標(biāo)志物)進(jìn)行雙重免疫熒光染色。epi，表皮;we，創(chuàng)傷邊緣。比例尺:200μπι。
[0027] 圖5示出用雙重藥物療法治療的受傷小鼠中促血管生成因子表達(dá)增加。（a)肉芽組 織的半定量PCR分析(第5天）顯示VEGF、bFGF和HGF的mRNA上調(diào)。（b)通過計(jì)算生長(zhǎng)因子與β-肌動(dòng)蛋白比率來確定mRNA表達(dá)增加的圖示。值表示平均值土SEM(Ii = S)t^pW.05。（c)雙重 熒光染色顯示:在肉芽組織(第5天）中，大部分表達(dá)HGF的細(xì)胞與內(nèi)皮標(biāo)志物⑶31共染色，并 且這些細(xì)胞在雙重治療組中的豐度更高。較下行中的圖為對(duì)于α-SMA的染色并且顯示這些 產(chǎn)生基質(zhì)的細(xì)胞的豐度，平行于⑶31的發(fā)現(xiàn)。Epi，表皮;we，創(chuàng)傷邊緣。比例尺:200μπι。
[0028] 圖6示出⑶133+干細(xì)胞在雙重治療組的⑶133+/C-L小鼠中生成毛囊和上皮。（a)分 析在CDl 33-譜系中他莫昔芬誘導(dǎo)的Cre-依賴性GFP表達(dá)的方案。（b)未受損的小鼠皮膚組織 顯示毛囊中顯著的GFP和CD133(lacZ+)表達(dá)。（c)在損傷后第15天CD133+/C-L-Rosa26EGFP 創(chuàng)傷皮膚的相同切片的同時(shí)的GFP熒光、β-半乳糖苷酶（IacZ)和H&E染色。（d)較高倍 (higher power)顯微照片。在框區(qū)中，箭頭表示在GFP+(左圖）、IacZ+(中圖）和H&E(右圖）染 色的相同切片中的毛囊。箭頭指向GFP和IacZ陽性上皮。epi，表皮;we，創(chuàng)傷邊緣。比例尺： 200μπι。（ e)在皮膚創(chuàng)傷愈合中組合治療的治療機(jī)制的圖示。
[0029] 圖7示出AMD3100與低劑量的他克莫司的治療提高受傷大鼠中創(chuàng)傷閉合的速度。 (a)全皮層切除創(chuàng)傷的大鼠模型的示例性照片。以指定時(shí)間間隔測(cè)量5-mm打孔活組織檢查 的創(chuàng)傷區(qū)直至到達(dá)完全閉合。（b)大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合的動(dòng)力學(xué)分析。顯示出n = 6只動(dòng)物/組 的代表性圖像。（c)顯示出在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)相對(duì)于最初創(chuàng)傷區(qū)的創(chuàng)傷區(qū)百分?jǐn)?shù)。數(shù)據(jù)表示n = 6 只動(dòng)物/組的平均值土 SEM。*p〈0.05雙重治療的大鼠相對(duì)于媒介物治療的大鼠。
[0030] 圖8示出高劑量的他克莫司和AMD3100對(duì)小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合的影響。（a)皮膚切除 創(chuàng)傷愈合的動(dòng)力學(xué)分析。在指定時(shí)間拍照創(chuàng)傷部位。代表性照片是n = 3或4只動(dòng)物/組的照 片。（b)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處與最初創(chuàng)傷區(qū)相比創(chuàng)傷區(qū)百分比的變化。數(shù)據(jù)表示n = 3或4只動(dòng)物/ 組的平均值±SEM。與用鹽水處理的小鼠中的創(chuàng)傷閉合相比，定量評(píng)價(jià)未顯示出用他克莫司 (l.Omg kg-Ι)或AMD3100(5.0mg kg-Ι)治療的小鼠中的創(chuàng)傷閉合的顯著差異。
[0031] 圖9示出雙重藥物治療刺激創(chuàng)傷后大鼠皮膚中的毛囊再生并降低瘢痕形成。全皮 層皮膚切除的大鼠模型如上所述。（a)在創(chuàng)傷后第20天通過H&E(左圖和中圖）和Masson三色 法(右圖）染色評(píng)估毛囊再生。顯示出每組n = 12個(gè)個(gè)體皮膚樣本的代表性圖像:瘢痕用虛線 描畫出輪廓，并且箭頭指向愈合