預(yù)測受試者對多激酶抑制劑的反應(yīng)的基因表達(dá)標(biāo)志及其使用方法
【專利說明】預(yù)測受試者對多激酶抑制劑的反應(yīng)的基因表達(dá)標(biāo)志及其使用 方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年8月28日提交的國際專利申請系列號PCT/CN2013/082487的優(yōu) 先權(quán)和權(quán)益，該案全文通過引用并入本文中用于所有目的。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明設(shè)及受試者的治療W及用于用多激酶抑制劑，例如索拉非尼(SorafenA)、 舒尼替尼（Sunitinib)、阿西替尼（Axitinib)、凡德他尼（Vandetanib)、帕挫帕尼 (Pazopanib)、卡博替尼（化bozantinA)等，或其鹽、溶劑化物或生理功能衍生物，或其混合 物治療的受試者的鑒別和選擇。提供了用于如癌癥等疾病的預(yù)測、診斷、預(yù)后及治療的方 法、試劑及工具。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 肝細(xì)胞癌化CC)是一種侵襲性腫瘤并且是世界上第五大致命性癌癥。它在東亞和 男性中特別流行（Parkin DM，Bray FiFerlay J，Pisani P.Global cancer statistics, 2002.CA (Mincer J Clin 2005;55:74-108;El-Serag 皿，7.Rudolp.h KL.Hepatocellular carcinoma：epidemiology and molecular carcinogenesis.Gastroenterology 2007； 132:2557-76)。在美國和中國，其發(fā)病率穩(wěn)步增加（1)。截至目前，有效的治療選擇很少。常 見的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法(例如多柔比星(doxorub icin))具有極少臨床益處。
[0006] 唯一得到批準(zhǔn)的可用祀向療法是索拉非尼，該療法目前變得可行（1)。索拉非尼是 祀向血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)介導(dǎo)的血管生成并且阻斷RAF/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶化服)激 酶(MEKVE服級聯(lián)的一種多激酶抑制劑。它是最先發(fā)現(xiàn)的可延長晚期肝細(xì)胞癌化CC)患者的 存活期的藥物，并且已經(jīng)被銷售用于治療晚期腎細(xì)胞癌和不可切除的HCC。然而，HCC患者的 存活期增加僅3個(gè)月。與許多新一代的祀向療法相同，索拉非尼也具有不利的副作用。就安 全性和缺乏功效而言，許多HCC患者對索拉非尼的反應(yīng)不良。很明顯，需要索拉非尼的預(yù)測 標(biāo)記物來幫助選擇可能得到最大益處的患者群體。
[0007] 關(guān)于索拉非尼的初始單組II期研究報(bào)導(dǎo)，憐酸化E服(祀服）的基線水平可能是一 種相關(guān)的標(biāo)記物，而且有一些報(bào)導(dǎo)公布了血清標(biāo)記物(例如可溶性C-KIT、服F、AFP、VEGF等） 與索拉非尼治療結(jié)果之間的關(guān)系，但運(yùn)些結(jié)果只是非常初步的結(jié)果或在多項(xiàng)研究中并不恒 定。因此，利用運(yùn)些因素作為潛在預(yù)測標(biāo)記物需要進(jìn)行進(jìn)一步評價(jià)，并且新的策略，如基于 基因組學(xué)的分子標(biāo)志分析，可用于鑒別新的預(yù)測標(biāo)記物，并有助于更好地了解索拉非尼在 肥C中的作用機(jī)制。
[000引發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明提供了可W用于預(yù)測受試者對藥物的反應(yīng)性/抗性的一組基因標(biāo)記物。在 一些實(shí)施方案中，基因標(biāo)記物包括SEC1 化2、H6PD、TMEM140、SLC2A5、ACTA1、IRF8、STAT2、 UGT2A1、其功能變體、片段或直系同源物。
[0010] 本發(fā)明還提供了一組基因標(biāo)記物的活性譜集合，所述組基因標(biāo)記物包括至少兩個(gè) 或更多個(gè)選自由W下組成的組的基因標(biāo)記物：SEC14L2、H6PD、TMEM140、化C2A5、ACTA1、 IRF8、STAT2、UGT2A1，其功能變體、片段或直系同源物。在一些實(shí)施方案中，該活性譜從超過 一個(gè)對藥物起反應(yīng)的受試者收集。在一些實(shí)施方案中，該活性譜從超過一個(gè)對藥物具有抗 性的受試者收集。在一些實(shí)施方案中，該藥物是多激酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，多激酶 抑制劑祀向血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)介導(dǎo)的血管生成并且阻斷RAF/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 化服)激酶(MEKVE服級聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，多激酶抑制劑包括索拉非尼，或其鹽、溶劑 化物或生理功能衍生物。在一些實(shí)施方案中，活性譜集合在用藥物治療之前、期間和/或之 后從受試者、受試者的部分或源自于受試者的細(xì)胞收集。在一些實(shí)施方案中，該組基因標(biāo)記 物包括至少兩個(gè)、Ξ個(gè)或四個(gè)本發(fā)明的基因標(biāo)記物。
[0011] 本發(fā)明還提供了用于確定受試者對藥物的反應(yīng)性或抗性的方法。在一些實(shí)施方案 中，該藥物是多激酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，多激酶抑制劑祀向血管內(nèi)皮生長因子 (VEG巧介導(dǎo)的血管生成并且阻斷RAF/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶巧服)激酶(MEKVE服級聯(lián)。在一 些實(shí)施方案中，多激酶抑制劑包括索拉非尼，或其鹽、溶劑化物或生理功能衍生物。在一些 實(shí)施方案中，所述方法包括測量一組基因標(biāo)記物的活性譜。在一些實(shí)施方案中，所述方法另 外包括將該組的活性譜與預(yù)定活性譜相比較。在一些實(shí)施方案中，受試者的反應(yīng)性是基于 該組基因標(biāo)記物的活性譜與該預(yù)定活性譜之間的比較確定。在一些實(shí)施方案中，如果該組 的活性譜在該預(yù)定活性譜的范圍內(nèi)，那么確定該受試者對藥物具有反應(yīng)，或如果該組的活 性譜不在該預(yù)定活性譜的范圍內(nèi)，那么確定其對藥物具有抗性。在一些實(shí)施方案中，也可W 使用從對藥物不具有反應(yīng)的受試者得到的活性譜。舉例來說，如果該組的活性譜是在源自 于對藥物不具有反應(yīng)的受試者的活性譜的范圍內(nèi)，那么確定該受試者對藥物不具有反應(yīng)。
[0012] 在一些實(shí)施方案中，一組基因標(biāo)記物的活性譜包括描述基因表達(dá)水平、RNA活性水 平和/或蛋白質(zhì)活性水平的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)。在一些實(shí)施方案中，該活性譜由基于基因表達(dá) 水平、RNA活性水平和/或蛋白質(zhì)活性水平計(jì)算的一個(gè)定量標(biāo)志值或一組標(biāo)志值反映。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，該組包括至少兩個(gè)、Ξ個(gè)或四個(gè)基因標(biāo)記物。在一些實(shí)施方案 中，基因標(biāo)記物包括至少一個(gè)或多個(gè)選自由W下組成的組的標(biāo)記物：SEC14L2、H6PD、 TMEM140、SLC2A5、ACTA1、IRF8、STAT2 及 UGT2A1，或其任何組合。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，活性譜是基因表達(dá)水平，其中一個(gè)或多個(gè)基因標(biāo)記物的表達(dá) 在多激酶抑制劑治療前類似于或低于預(yù)定活性譜指示受試者具有反應(yīng)，而一個(gè)或多個(gè)基因 標(biāo)記物的表達(dá)在多激酶抑制劑治療前高于預(yù)定活性譜指示受試者具有抗性。
[0015] 作為替代方案，本發(fā)明的生物標(biāo)記物的活性水平在治療后關(guān)于預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)水平標(biāo)準(zhǔn) 化或穩(wěn)定化指示受試者具有反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，SECHL2、H6PD、TMEM140、^X2A5、 ACTA1、IRF8、STAT2和/或UGT2A1關(guān)于預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)水平標(biāo)準(zhǔn)化或穩(wěn)定化指示受試者具有反應(yīng)。 在一些實(shí)施方案中，SEC14L2、冊PD、TMEM140、SLC2A5、ACTA1、IRF8、STAT2 和/或UGT2A1 關(guān)于 預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)水平不存在標(biāo)準(zhǔn)化和穩(wěn)定化指示受試者對治療具有抗性。如本文所使用，當(dāng)一個(gè) 生物標(biāo)記物的水平趨近預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)水平時(shí)，它被稱為標(biāo)準(zhǔn)化。如本文所使用，當(dāng)一個(gè)生物標(biāo)記 物的水平遠(yuǎn)離預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)水平的速度降低時(shí)，它被稱為穩(wěn)定化。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，多激酶抑制劑是索拉非尼、阿西替尼、凡德他尼、帕挫帕尼、卡 博替尼或其任何組合。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，受試者是患有癌癥的人。在一些實(shí)施例中，癌癥是肝細(xì)胞癌。
[0018] 本發(fā)明還提供了用于向受試者施用藥物的方法。在一些實(shí)施方案中，該藥物是多 激酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括測試該受試者的一組基因標(biāo)記物的活性譜。 在一些實(shí)施方案中，該組基因標(biāo)記物包括至少一個(gè)或多個(gè)選自由W下組成的組的標(biāo)記物： SEC14L2、H6PD、TMEM140、化 C2A5、ACTA1、IRF8、STAT2 及 UGT2A1。在一些實(shí)施方案中，所述方 法另外包括將該組的活性譜與預(yù)定活性譜相比較。在一些實(shí)施方案中，該比較在施用藥物 之前、期間或之后進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，該藥物包含至少一種多激酶抑制劑。在一些實(shí) 施方案中，多激酶抑制劑祀向血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)介導(dǎo)的血管生成并且阻斷RAF/細(xì)胞 外信號調(diào)節(jié)激酶化服)激酶(MEKVE服級聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，如果該組的活性譜是在源 自于對藥物起反應(yīng)的一群受試者的預(yù)定活性譜的范圍內(nèi)，那么向受試者施用多激酶抑制 劑。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種陣列，該陣列包含用于檢測至少兩個(gè)或更多個(gè)基因標(biāo)記物的 探針。在一些實(shí)施方案中，基因標(biāo)記物選自由W下組成的組：SEC14L2、H6PD、TMEM140、 SLC2A5、ACTA1、IRF8、STAT2及UGT2A1。在一些實(shí)施例中，該陣列是微陣列。
[0020] 附圖簡述
[0021] 圖1示出了對于索拉非尼在一大組化Prime HCC PDX中的功效的評價(jià)。圖1A:計(jì)算 Δ T/ Δ C，其中A T和Δ C分別是治療組和對照組在指定目的平均腫瘤體積變化，在圖B-E中 W 箭頭指示。*:9<〇.〇5;**:9<0.01;***:9<0.001。圖18至16顯示代表性 HCC-HuPrime⑩對索拉非尼起反應(yīng)，模型代碼分別是001、006、020及021。
[0022] 圖2示出了通過I肥檢測的基線祀服水平與模型對索拉非尼的反應(yīng)無關(guān)。
[0023] 圖3顯示標(biāo)志基因的表達(dá)預(yù)示著在PDX模型中索拉非尼治療對于HCC的影響。W l〇g2標(biāo)度表示的標(biāo)記物基因的平均mRNA表達(dá)強(qiáng)度指定為標(biāo)志評分。
[0024] 圖4示出了RAF/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶化服)激酶(MEKVE服級聯(lián)。
[00劇發(fā)明詳述
[0026] 如本文所使用，W下術(shù)語應(yīng)具有W下含義：
[0027] 在本說明和權(quán)利要求書中使用的動詞"包括(comprise)"及其變化形式是W其非 限制性意義使用，意思指包括該詞語之后的項(xiàng)目，而且不排除未具體提到的項(xiàng)目。
[0028] 術(shù)語"一個(gè)(種）（a/an)"是指一個(gè)或多個(gè)所述實(shí)體;舉例來說，"一個(gè)基因"是指一 個(gè)或多個(gè)基因或者至少一個(gè)基因。因此，術(shù)語"一個(gè)(種)"、"一個(gè)(種)或多個(gè)(種Γ及"至少 一個(gè)(種r在本文中可互換使用。此外，加不定冠詞"一個(gè)(種r提到的"一個(gè)要素"不排除可 能存在超過一個(gè)要素，除非上下文清楚地要求有且僅有一個(gè)要素。
[0029] 本發(fā)明提供了分離的、嵌合的、重組或合成的多核巧酸序列。如本文所使用，術(shù)語 "多核巧酸"、"多核巧酸序列"、"核酸序列"、"核酸片段"及"分離的核酸片段"在本文中可互 換使用并且涵蓋單鏈或雙鏈的0麻、3酷、〇0魁，^及其化學(xué)修飾。運(yùn)些術(shù)語涵蓋核巧酸序列 等。多核巧酸可W是單鏈或雙鏈RNA或DNA的聚合物，其中任選地含有合成、非天然或改變的 核巧酸堿基。呈DNA聚合物形式的多核巧酸可W包含一個(gè)或多個(gè)具cDNA、基因組DNA、合成 DNA或其混合物的區(qū)段。核巧酸(通常W其5/-單憐酸形式存在)是W單字母名稱提及，如下 所示："A"表示腺巧酸或脫氧腺巧酸（分別針對RNA或DNA)，"C"表示胞巧酸或脫氧胞巧酸， "G"表示鳥巧酸或脫氧鳥巧酸，"U"表示尿巧酸，?'表示脫氧胸巧酸，"R"表示嚷嶺(A或G)， ?'表示喀晚(C或T)，"K"表示G或T，表示A或C或T，"Γ表示肌巧，并且"N"表示任何核巧 酸。在一些實(shí)施方案中，所述分離的、嵌合的、重組或合成的多核巧酸序列是來源于本發(fā)明 的基因標(biāo)記物。
[0030] 本文所使用的單字母氨基酸縮寫具有其在本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)含義，并且本文所描述 的所有膚序列都是根據(jù)慣例書寫，其中N末端在左邊，而C末端在右邊。
[0031] 本發(fā)明提供了可W用于預(yù)測患者對藥物的反應(yīng)的表達(dá)基因標(biāo)志。如本文所使用， 術(shù)語"基因"是指與生物功能有關(guān)的任何DNA區(qū)段。因此，基因包括但不限于，其表達(dá)所需的 編碼序列和/或調(diào)控序列。基因還可W包括例如形成其它蛋白質(zhì)的識別序列的不表達(dá)的DNA 區(qū)段。基因可W從多種來源獲得，包括從所關(guān)注的來源克隆，或由已知或預(yù)測的序列信息合 成，并且可W包括被設(shè)計(jì)成具有所希望的參數(shù)的序列。
[0032] 本發(fā)明提供了同源和直系同源的多核巧酸和多膚。如本文所使用，術(shù)語"同源的" 或"同源物"或"直系同源物"是本領(lǐng)域中已知的并且是指共有共同的祖先或家族成員并且 基于序列同一性程度確定的相關(guān)序列。術(shù)語"同源性"、"同源的"、"基本上類似"及"基本上 對應(yīng)"在本文中可互換使用。運(yùn)些術(shù)語是指運(yùn)樣一些核酸片段，其中一個(gè)或多個(gè)核巧酸堿基 的變化不會影響核酸片段介導(dǎo)基因表達(dá)或產(chǎn)生某些表型的能力。運(yùn)些術(shù)語還指本發(fā)明的核 酸片段的修飾，如相對于初始未修飾的片段，基本上不改變所得核酸片段的功能特性的一 個(gè)或多個(gè)核巧酸的缺失或插入。因此，應(yīng)了解的是，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解，本發(fā)明不 僅僅涵蓋具體的示范性序列。運(yùn)些術(shù)語描述了在一個(gè)物種、亞種、品種、培養(yǎng)變種或品系中 發(fā)現(xiàn)的基因與在另一物種、亞種、品種、培養(yǎng)變種或品系中相應(yīng)或相同的基因之間的關(guān)系。 出于本發(fā)明的目的，將比較同源序列。"同源序列"或"同源物"或"直系同源物"被認(rèn)為、相信 或已知是功能相關(guān)的。功能關(guān)系可W通過多種方式中的任一種指示，運(yùn)些方式包括但不限 于：（a)序列同一性的程度和/或(b)相同或類似的生物功能。優(yōu)選地，同時(shí)適用(a)和(b)。序 列同一性程度可能變化，而在一些實(shí)施方案中，該同一性程度是至少50% (當(dāng)使用本領(lǐng)域中 已知的標(biāo)準(zhǔn)序列比對程序時(shí)）、至少60 %、至少65 %、至少70%、至少75 %、至少80 %、至少 85%、至少90 %、至少約91 %、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95 %、至少約 96%、至少約97%、至少約98%，或至少98.5%，或至少約99%，或至少99.5%，或至少 99.8 %，或至少99.9 %。同源性可W使用本領(lǐng)域中易于得到的軟件程序，如Current ProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel等人編，1987)增刊30，第7.718節(jié)，表7.71 中所論述的那些測定。一些比對程序是MacVectoHOxford Molecular Ltd,Oxford，U.K.)、 ALIGN Plus(Scientific and Educational Software,Pennsylvania)^,AlignX(Vector NTI，Invihogen，Carlsbad，CA)。另一比對程序是Sequencher(Gene Codes，Ann Arbor， Michigan)，使用默認(rèn)參數(shù)。
[0033] 本發(fā)明提供了來源于標(biāo)志基因的核酸序列的探針和引物。如本文所使用，術(shù)語"探 針"是指能夠與擴(kuò)增祀標(biāo)特異性退火的寡核巧酸。如本文所使用，術(shù)語"引物"是指運(yùn)樣一種 寡核巧酸，該寡核巧酸能夠與擴(kuò)增祀標(biāo)退火，使DNA聚合酶附接，由此當(dāng)處于誘導(dǎo)引物延伸 產(chǎn)物合成的條件下，即，在核巧酸和聚合試劑(如DNA聚合酶)存在下并且在適合溫度和pH下 時(shí)充當(dāng)DNA合成的起始點(diǎn)。為得到最大擴(kuò)增效率，（擴(kuò)增）引物優(yōu)選是單鏈的。優(yōu)選地，引物是 寡聚脫氧核糖核巧酸。引物必須足夠長W在聚合試劑存在下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物的 確切長度將取決于許多因素，包括溫度和引物組成(A/T對比G/C含量）。如在DNA擴(kuò)增領(lǐng)域， 如在PCR擴(kuò)增中常用的，一對雙向引物由一個(gè)正向引物和一個(gè)反向引物組成。在一些實(shí)施方 案中，運(yùn)些引物或探針與沈Q ID ^.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27及29中的任 一個(gè)雜交。在一些實(shí)施方案中，運(yùn)些引物或探針與沈Q ID N0.1、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、 21、23、25、27及29中的任一個(gè)在嚴(yán)格雜交條件下雜交。如本文所使用，嚴(yán)格雜交條件可^是 6XSSC(0.9M NaCl，0.09M巧樣酸鋼，pH 7.4)，65°C。
[0034] 術(shù)語"陣列"或"矩陣"是指可定址的位置或"地址"在裝置上的排列。運(yùn)些位置可W 排列成二維陣列形式、Ξ維陣列形式或其它矩陣形式。位置的數(shù)量可W在