一種煙草根結(jié)線蟲病的生物防治方法及其生防制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于煙草病害防治領(lǐng)域，具體涉及一種煙草根結(jié)線蟲病的生物防治方法及其生防制劑。
技術(shù)背景:
[0002]煙草根結(jié)線蟲病是由根結(jié)線蟲侵入煙株根部而引起的。此線蟲屬線形動物門，線蟲綱、墊刃目，墊刃總科、異皮科，根結(jié)線蟲屬。我國以南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincongnita Chitwood)為害為主。
[0003]煙草根結(jié)線蟲病在苗期和大田期均可發(fā)生，多在大田成株期發(fā)病。染病煙株首先是根部形成大小不等的根瘤，須根上初生根瘤為白色。嚴重時整個根系腫脹變粗呈雞爪狀，病根后期中空腐爛，僅存留根皮和木質(zhì)部，其中包含大量不同發(fā)育時期的病原線蟲。病株葉片從葉尖和邊緣開始干枯內(nèi)卷，葉色變淡，生長不良似缺肥狀。須根上長出形狀、大小不等的根瘤，主根、駐叉根粗腫呈雞爪狀。高溫干旱癥狀明顯，重病株葉片發(fā)黃下垂甚至枯死。
[0004]煙草根結(jié)線蟲病在云南各煙區(qū)均有為害，上世紀90年代末“雙控”以前，因輪作困難等因素，發(fā)病面積較大，“雙控”后煙草種植面積減少，發(fā)病面積在減少。近年來發(fā)生面積有增加的趨勢，已成為為害煙草生產(chǎn)的主要病害之一。根結(jié)線蟲除直接為害煙株外，還會因線蟲在煙株根部造成傷口而誘發(fā)其他根莖部病害發(fā)生，如煙草黑脛病、根黑腐病、青枯病等，使為害加重。
[0005]目前，煙草根結(jié)線蟲病的防治主要依靠化學農(nóng)藥、抗病品種和農(nóng)業(yè)防治措施?；瘜W農(nóng)藥防治往往造成環(huán)境污染并降低煙草品質(zhì)和食用安全性;抗病品種選育難度大、成本高，且大多只能抗根結(jié)線蟲病單個生理小種，在其他生理小種入侵時存在大面積爆發(fā)的危險；農(nóng)業(yè)防治措施費工費時，防治效果普遍不理想。生物防治方法不僅能夠有效防治煙草根結(jié)線蟲病，還能有效保護生態(tài)環(huán)境，提高煙草品質(zhì)和食用安全性。開發(fā)煙草根結(jié)線蟲病生物防治方法前景廣闊，對煙農(nóng)和煙草種植產(chǎn)業(yè)良性發(fā)展具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種煙草根結(jié)線蟲病的生物防治方法及其生防制劑。
[0007]本發(fā)明的煙草根結(jié)線蟲病的生物防治方法包括:煙草育苗時根結(jié)線蟲拮抗菌定殖、煙苗大田移栽時根結(jié)線蟲拮抗菌定殖、煙草植株生長期根結(jié)線蟲拮抗菌定殖，具體為:
[0008]A:煙草育苗時根結(jié)線蟲拮抗菌定殖:在煙草育苗時將根結(jié)線蟲拮抗復合微生物菌劑拌入市購的漂浮育苗基質(zhì)中進行育苗，煙草根結(jié)線蟲拮抗復合微生物菌劑拌入育苗基質(zhì)的量為每10kg基質(zhì)中加入0.5-5kg;或者在煙草出苗后按每畝0.2-1.0kg噴施根結(jié)線蟲拮抗菌劑200-1000倍稀釋液，每隔7-10天噴施I次，噴2-3次。
[0009]B:煙苗大田移栽時根結(jié)線蟲拮抗菌定殖:在煙苗大田移栽前塘施煙草根結(jié)線蟲拮抗生物有機肥或移栽后灌施煙草根結(jié)線蟲拮抗復合微生物菌劑;煙草根結(jié)線蟲拮抗生物有機肥在煙草移栽前按每畝20-100kg施入塘內(nèi)；煙草根結(jié)線蟲拮抗復合微生物菌劑按每畝2-1kg在煙苗移栽后稀釋200-1000倍液灌施。
[0010]C:煙草大田生長期根結(jié)線蟲拮抗菌定殖:在煙草大田生長期追施煙草根結(jié)線蟲拮抗生物有機肥和/或煙草根結(jié)線蟲拮抗復合微生物菌劑;煙草根結(jié)線蟲拮抗生物有機肥在煙株周圍開塘穴施，每畝20-100kg，團棵期和旺長期按每畝20-100kg各追施I次煙草根結(jié)線蟲拮抗生物有機肥;或者將煙草根結(jié)線蟲拮抗復合微生物菌劑按每畝2-10kg稀釋200-1000倍后灌施煙草根部，團棵期和旺長期按每畝2-10kg稀釋200-1000倍后各追施I次煙草根結(jié)線蟲拮抗復合微生物菌劑。
[0011 ]上述A步驟所述的煙草育苗時根結(jié)線蟲拮抗菌的兩種定殖方式能單獨采用一種，亦能兩種同時米用；
[0012]上述B步驟所述的煙苗大田移栽時根結(jié)線蟲拮抗菌的定殖，能單獨采用煙草根結(jié)線蟲拮抗生物有機肥或煙草根結(jié)線蟲拮抗復合微生物菌劑進行定殖，亦能兩者同時采用進行定殖；
[0013]上述C步驟所述的煙草大田生長期根結(jié)線蟲措抗菌定殖，能單獨追施含煙草根結(jié)線蟲拮抗菌劑的生物有機肥或煙草根結(jié)線蟲拮抗菌劑，亦能兩者同時追施。
[0014]所述的煙草根結(jié)線蟲的生物防治方法，在煙草苗育苗時根結(jié)線蟲拮抗菌定殖、煙苗大田移栽時根結(jié)線蟲拮抗菌定殖、煙草植株生長期根結(jié)線蟲拮抗菌定殖三個過程能單獨采用其中一部分措施，亦能全部措施一同采用。
[0015]用于本發(fā)明的煙草根結(jié)線蟲病的生物防治方法中的生防制劑包括:煙草根結(jié)線蟲拮抗復合微生物菌劑和煙草根結(jié)線蟲拮抗生物有機肥;該生防制劑經(jīng)由如下步驟得到:
[0016]—、分別將保藏在北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號、中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC N0.1213、保藏日為2004年8月30日的巨大芽孢桿菌(BaciIIus megaterium)Ap25株;保藏號為CGMCC N0.1211、保藏日為2004年8月30日的褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)YKT41 株;保藏號為CGMCC N0.1212、保藏日為2004 年8月30日的越南伯克霍爾德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)P418株；以及保藏在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號、中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC N0.5938、保藏日為2012年3月27日的綠色木霉(Trichoderma viride)L_10株;保藏號為CGMCC N0.7938、保藏日 2013年7月 19 日為的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Tll-ff株五種菌種分別按常規(guī)方法進行液體或固體發(fā)酵;具體如下:
[0017]1、巨大芽孢桿菌Ap25的液體發(fā)酵
[0018]巨大芽孢桿菌Ap25的液體發(fā)酵按以下步驟進行:
[0019](I)斜面菌種:采用固體無氮培養(yǎng)基(K2HP04 0.5g、MgS04.7H20 0.2g、NaCl
0.02g、CaC12 0.2g、Fe_EDTA 0.066g、Na2Mo04 0.002g、L_谷氨酸(或味精)0.05g、葡萄糖5g、瓊脂15g、pH7.2-7.4)將菌種接種在試管培養(yǎng)基中，28-32°C培養(yǎng)18-24小時。
[0020](2)搖瓶菌種:稱取蛋白胨1g、酵母浸出物Ig、氯化鈣0.2g配制成pH7.0的液體培養(yǎng)基，將斜面菌種的單菌落接種在液體無氮培養(yǎng)基中置搖床上28-32Γ培養(yǎng)18-24小時。
[0021](3)液體發(fā)酵:采用含蔗糖I %、玉米粉4%、黃豆餅粉I %、硫酸銨0.2%、硫酸鎂
0.02%、磷酸二氫鉀0.1 %、磷酸氫二鉀0.1 % (前述物料均按質(zhì)量百分比添加)、pH7.2-7.4培養(yǎng)基，121°C滅菌20min，將搖瓶液體培養(yǎng)的菌種接種到發(fā)酵罐內(nèi)(接種量為2-10% )，28-32°C條件下培養(yǎng)，每分鐘通發(fā)酵罐容積1-1.5倍的氣量，攪拌速度為150-250r/min，培養(yǎng)時間36-48小時。在接種量為10%，30°C恒溫培養(yǎng)的情況下，32小時進入穩(wěn)定期，此時可結(jié)束發(fā)酵，獲得巨大芽孢桿菌Ap25的孢子發(fā)酵液，留作配制復合微生物菌劑用。
[0022]2、褐球固氮菌YKT41的液體發(fā)酵
[0023]褐球固氮菌YKT41的液體發(fā)酵按以下步驟進行:
[0024](I)斜面菌種:采用固體無氮培養(yǎng)基(K2HP04 0.64g,KH2PO4 0.16g,MgS04.7H200.2g、NaCl 0.2g、CaS04.2H20 0.05g^Na2MoO4 O-OOlg^FeSO4 0.03g、蔗糖20g、瓊脂 15g、水
1000ml、pH7.0-7.2)，將菌種接種在試管培養(yǎng)基中，28-32 °C培養(yǎng)18-24小時。
[0025](2)搖瓶菌種:采用液體無氮培養(yǎng)基(K2HP04 0.64g,KH2PO4 0.16g,MgS04.7H200.2g、NaCl 0.2g、CaS04.2H20 0.05g^Na2MoO4 O-OOlg^FeSO4 0.03g、蔗糖20g、水 1000ml、pH7.0-7.2)，將斜面菌種的單菌落接種在液體無氮培養(yǎng)基中置搖床上28-32°C培養(yǎng)18-24小時。
[0026](3)液體發(fā)酵:采用含蔗糖I %、玉米粉4%、黃豆餅粉I %、硫酸銨0.2%、硫酸鎂
0.02%、磷酸二氫鉀0.1 %、磷酸氫二鉀0.1 % (前述物料均按質(zhì)量百分比添加)，pH7.0-7.2的培養(yǎng)基，121°C滅菌20min，將搖瓶液體培養(yǎng)的菌種接種到發(fā)酵罐內(nèi)(接種量為2-10%)，28-32 0C條件下培養(yǎng)，每分鐘通發(fā)酵罐容積1-1.5倍的氣量，攪拌速度為150-250r/min，培養(yǎng)時間36-48小時。在接種量為10 %，300C恒溫培養(yǎng)的情況下，32小時進入穩(wěn)定期，此時作為發(fā)酵終點，獲得褐球固氮菌YKT41的孢子發(fā)酵液，留作配制復合微生物菌劑用。
[0027]3、越南伯克霍爾德氏菌P418的液體發(fā)酵
[0028]越南伯克霍爾德氏菌P418的液體發(fā)酵按以下步驟進行:
[0029](I)斜面菌種:采用固體無氮培養(yǎng)基(K2HP04 0.5g、MgS04.7H20 0.2g、NaCl 0.02g、CaCl2 0.2g、Fe-EDTA 0.066g,Na2MoO4 0.002g、L_谷