效。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的【具體實(shí)施方式】加以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書(shū)中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0030]在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)形式。
[0031]當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
[0032]除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說(shuō)明，具體可參見(jiàn)Sambrook等 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Second edit1n，Cold Spring HarborLaboratory Press,1989 and Third edit1n,2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR B1LOGY， John Wiley & Sons， New York,1987 and per1dic updates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY， Academic Press, San Diego ；ffolffe, CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCT1N, Third edit1n， Academic Press, San Diego，1998 ;METH0DSIN ENZYM0L0GY，Vol.304，Chromatin (P.M.Wassarman and A.P.ffolffe, eds.)，AcademicPress, San Diego,1999 ；和 METHODS IN MOLECULAR B1LOGY, Vol.119，ChromatinProtocols (P.B.Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999 等。
[0033]核受體超家族(nuclear receptor superfamily)是一組配體激活的轉(zhuǎn)錄因子家族，通過(guò)在信號(hào)分子與轉(zhuǎn)錄應(yīng)答間建立聯(lián)系，調(diào)控著細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。RXR在抵御病毒感染的宿主防御中的作用仍然是未知的。我們發(fā)現(xiàn)RXR的過(guò)度表達(dá)以及其配體的刺激會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞的易感性的鼠的γ -皰疹病毒68 (MHV68)的功能缺失或RXR拮抗劑治療使其病毒感染。與這些功能型研究相一致的是，配體刺激RXR在巨噬細(xì)胞顯著抑制抗病毒基因的表達(dá)，其中包括一型干擾素以及多種干擾素刺激基因。我們的研究已經(jīng)提供了進(jìn)一步證據(jù)表明，COXl在RXR刺激巨噬細(xì)胞中顯著誘導(dǎo)產(chǎn)生，介導(dǎo)RXR對(duì)一型干擾素的抑制作用，因此我們發(fā)現(xiàn)了一種新型的RXR-Cox-1依賴性途徑，其在抑制一型干擾素-調(diào)節(jié)抗病毒免疫中起到重要作用。這說(shuō)明，RXR在病毒感染的自身免疫反應(yīng)中通過(guò)下調(diào)其表達(dá)來(lái)抑制抗病毒基因的表達(dá)，并在宿主抗病毒反應(yīng)中起到優(yōu)勢(shì)作用。
[0034]各實(shí)施例中所使用的RAW264.7細(xì)胞系從ATCC公司購(gòu)得，并給與DMEM加百分之十的FBS以及百分之一的青霉素或鏈霉素共同培養(yǎng)。RAW264.7細(xì)胞系從ATCC公司購(gòu)得，并給與DMEM加百分之十的FBS以及百分之一的青霉素或鏈霉素共同培養(yǎng)。
[0035]本發(fā)明實(shí)施例中所使用的MHV68-1UC由UCLA的孫仁博士提供。
[0036]將RAW264.7細(xì)胞植入6孔板中鋪成6*105，給予DMSO或RXR激動(dòng)劑或RXR拮抗劑處理16-24小時(shí)。病毒傳播同之前描述的一致(DoyIe等2002 )。在培養(yǎng)基中細(xì)胞感染MHV68(感染復(fù)數(shù)=0.01)1小時(shí)后，重新更換含有百分之一胎牛血清的DMEM。在第12小時(shí)-16小時(shí)質(zhì)檢收集其上清液、MHV68-luc感染由熒光素酶檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量檢測(cè)(Promega)。
[0037]穩(wěn)定的細(xì)胞系的構(gòu)建方法:人RXR克隆到pBABE -嘌呤霉素逆轉(zhuǎn)錄載體中，重組pBABE-人RXR，pBABE空載體，或pBABE-人RXR共轉(zhuǎn)染載體psiA48小時(shí)。收集病毒上清液用來(lái)將人RXR轉(zhuǎn)換為RAW264.7或F9胚胎癌細(xì)胞。感染細(xì)胞通過(guò)嘌呤霉素(2g/ml)形成轉(zhuǎn)化株2周后，轉(zhuǎn)化細(xì)胞即成為穩(wěn)定的細(xì)胞系。
[0038]無(wú)限增值的骨髓源性巨噬細(xì)胞制備方法參見(jiàn)Palleroni等1991 ；zhou等2008。
[0039]poly 1:C、poly dA: dT 和 siRNA 轉(zhuǎn)染:
poly 1:C與poly dA: dT在六孔板轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體2000溶解于改良型DMEM培養(yǎng)基5分鐘，2gpoly1:C或2g poly dA: dT溶解于改良型DMEM培養(yǎng)基，將以上脂質(zhì)體2000溶液以及poly 1:C或poly dA: dT溶液混合，室溫培養(yǎng)15分鐘，隨后，混合液加入含有1.6ml新鮮培養(yǎng)基的細(xì)胞中。酶聯(lián)免疫吸附法中的轉(zhuǎn)染試劑(polyplus制備公司)用做小干擾RNA的轉(zhuǎn)染。根據(jù)廠家說(shuō)明，將1nM對(duì)照組小干擾RNA或所示小干擾RNA轉(zhuǎn)染J2骨髓源性巨噬細(xì)胞中。
[0040]統(tǒng)計(jì)方法:病毒滴度曲線使用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行比較。對(duì)于其他數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)顯著性，通過(guò) 2 tailed unpaired t test, 2-tailed Mann-ffhitney U test 確定 PFU 數(shù)據(jù)，視情況使用1-way ANOVA corrected多重比較法。P取值小于等于0.05，則被認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的。所有計(jì)算均使用GraphPad Software Inc.的Windows的Prism軟件程序。PFU數(shù)據(jù)中的橫條為各例的平均值，各圖中的誤差條表示結(jié)構(gòu)方程模型(SEM)和重復(fù)數(shù)據(jù)。
[0041]實(shí)施例1
RXR的表達(dá)調(diào)控著宿主易感性的鼠的γ -皰疹病毒68的感染:
我們以往的基因研究已經(jīng)確立了一種新型的干擾素調(diào)節(jié)因子3依賴性但干擾素非依賴性的機(jī)制來(lái)下調(diào)RXR的表達(dá)(Chow等2006)。通過(guò)不同類型的病毒感染來(lái)確定RXR的表達(dá)水平，骨髓來(lái)源的巨■細(xì)胞被鼠的γ -皰疹病毒68病毒感染。結(jié)果表明，感染以上病毒后引起RXR的表達(dá)下調(diào)(如圖1A所不)。RXR基因的抑制并不是由于感染后細(xì)胞狀態(tài)改變引起，因?yàn)長(zhǎng)32控制基因沒(méi)有變化(數(shù)據(jù)未顯示)。給予RNA病毒類似物poly I:C和DNA病毒類似物poly dA:dT，可以激活細(xì)胞內(nèi)病毒，也顯著抑制在骨髓巨噬細(xì)胞中RXR的表達(dá)。(如圖1B所示)更重要的是，它證實(shí)了這種抑制是宿主反應(yīng)抗病毒刺激產(chǎn)生而不是病毒直接抑制宿主基因產(chǎn)生的。為了確定RXR在宿主的免疫反應(yīng)在病毒感染過(guò)程中是否起到作用，可以持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)人類RXR，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染產(chǎn)生PBABE控制載體。(如圖1C所示)鼠的T -皰疹病毒68在人類RXR中感染引起過(guò)度表達(dá)的Raw264.7細(xì)胞系比對(duì)照組的細(xì)胞病毒載量更多。這個(gè)結(jié)果在不同的群體之間以及單細(xì)胞克隆持續(xù)表達(dá)人類RXR之間是一致的(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)表明RXR的過(guò)度表達(dá)增加宿主細(xì)胞對(duì)病毒感染的易感性。
[0042]為了進(jìn)一步明確RXR在宿主抗病毒感染中的作用，野生型RXR和缺乏F9胚胎癌細(xì)胞給予注射鼠的γ -皰疹病毒68，通過(guò)蛋白免疫印跡測(cè)定RXR缺乏感染后細(xì)胞明顯比野生型細(xì)胞對(duì)水泡型口炎病毒更具有抵抗性。(如圖1E所示)為了確定這種差異是否為RXR依賴性，RXR缺乏F9細(xì)胞通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染重新建立人類RXR以及pBABE控制載體。給予三種不同的人類RXR注射鼠的γ -皰疹病毒68比給予RXR缺乏F9細(xì)胞系重塑pBABE控制產(chǎn)生更高的病毒滴度。(如圖1D所示)這些結(jié)果表明RXR的缺乏降低了鼠的γ-皰疹病毒68感染的宿主易感性。
[0043]綜上所述，在RXR過(guò)度表達(dá)的細(xì)胞給予更多病毒感染以及RXR缺乏細(xì)胞給予較少的病毒感染，說(shuō)明RXR表達(dá)水平可能調(diào)控鼠的γ -皰疹病毒68感染的宿主易感性。
[0044]實(shí)施例2
配體激活RXR抑制多種抗病毒基因的表達(dá):
為了研究RXR是如何減弱宿主免疫反應(yīng)并有利于病毒感染，本發(fā)明發(fā)明人對(duì)給予RXR激動(dòng)劑預(yù)先處理組以及巨噬細(xì)胞Poly 1:C轉(zhuǎn)染組進(jìn)行了基因芯片檢測(cè)。結(jié)果表明9順式維甲酸可以抑制多種Poly 1:C誘導(dǎo)基因，其中包括I型干擾素基因(例如IFN1、IFN2、IFN4、IFN5)Isgl5、Ifit3以及Gbp3(如圖3A)考慮到I型干擾素以及其下游的干擾素刺激基因ISGs在抗病毒感染中對(duì)宿主的免疫反應(yīng)發(fā)揮著重要的作用，RXR介導(dǎo)的對(duì)這些抗病毒基因的抑制可能是宿主對(duì)病毒感染的易感性引起的。為了驗(yàn)證基因數(shù)據(jù)以及證明RXR通過(guò)抑制抗病毒基因有利于病毒感染這一假說(shuō)，本發(fā)明發(fā)明人給與RAW264.7細(xì)胞RXR激動(dòng)劑預(yù)處理，或者給予其拮抗劑過(guò)夜處理，接著通過(guò)Poly 1:C轉(zhuǎn)染來(lái)模擬病毒感染刺激細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后2小時(shí)，通過(guò)給予9順式維甲酸，配體激活RXR對(duì)主要抗病毒基因IFNl以及Isgl5顯著抑制(如圖3B所示)。通過(guò)抗病毒的刺激，次要干擾素誘導(dǎo)基因例如Gbp-1，0as2，IRF7以及Isg20在該組表達(dá)水平也有所降低。(如圖3C所示)給予RXR拮抗劑HX531，一部分但不是全部抗病毒的表達(dá)顯著增加。(如圖3B和3C所示)有趣的是，9順式維甲酸以及HX531處理后給以調(diào)整部分基因的基礎(chǔ)表達(dá)，這說(shuō)明RXR