一種構(gòu)建微生物共培養(yǎng)體系產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是通過構(gòu)建木醋桿菌Acetobacter xylinum NUST4.2 (簡(jiǎn)稱Ax.4.2)和衣藻(Chlamydomonas)共培養(yǎng)體系,提高細(xì)菌纖維素的產(chǎn)率,并實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素微納米尺度組裝過程進(jìn)行精密調(diào)控,具體涉及微生物共培養(yǎng)體系的構(gòu)建。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)菌纖維素(BacterialCellulose, BC)是由木醋桿菌(Acetobacter xy linum)生物合成的一種新型高性能微生物合成材料,與其他形式形成的纖維素相比,盡管具有相同的化學(xué)成分,但其還具有特殊的物理化學(xué)和生物學(xué)特性,特別是發(fā)酵過程的可調(diào)控發(fā)酵底物的多樣性、微生物的多樣性等。
[0003]作為一種新興的生物功能材料,細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)雖然已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。但迄今為止,在細(xì)菌纖維素的工業(yè)化生產(chǎn)過程中依然存在很多問題亟待解決,這些問題的存在也嚴(yán)重阻礙了細(xì)菌纖維素作為優(yōu)良生物材料的廣泛使用。其中,最嚴(yán)峻的工藝難題是在發(fā)酵后期,細(xì)胞會(huì)向環(huán)境中分泌一種水溶性多糖,acetan。這種物質(zhì)會(huì)使發(fā)酵液粘度增加。Acetobacter xyIinum是一種嚴(yán)格的好氧菌,常用于細(xì)菌纖維素的制備,在制備過程發(fā)酵液中acetan的累積,不僅影響了細(xì)胞對(duì)氧氣的攝取,使胞內(nèi)代謝反應(yīng)減緩,同時(shí)作為主要的副產(chǎn)物,消耗了底物,使目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率下降,不利于工業(yè)化生產(chǎn)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是提供了一種構(gòu)建微生物共培養(yǎng)體系產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法。該方法通過利用木醋桿菌在發(fā)酵過程中會(huì)分泌乙酸,衣藻是以乙酸為碳源的微生物,能消耗發(fā)酵液中的乙酸,使環(huán)境pH維持在適宜的水平,兩種微生物共培養(yǎng)能實(shí)現(xiàn)互利共生,解決了發(fā)酵后期粘度過高造成的溶氧問題,同時(shí)能維持發(fā)酵過程中PH穩(wěn)定,提高了細(xì)菌纖維素的產(chǎn)率,產(chǎn)率從3.67g/L提高至IJ 5.21g/L0
[0005]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案為:
[0006]第一步:木醋桿菌與衣藻分別進(jìn)行種子培養(yǎng);
[0007]第二步:將衣藻種子液經(jīng)離心濃縮后,通過控制微流控技術(shù),利用海藻酸鈣固定衣藻,最終制備成線狀凝膠;
[0008]第三步:木醋桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中后,加入第二步中制備的衣藻,進(jìn)行發(fā)酵動(dòng)態(tài)培養(yǎng);
[0009]第四步:發(fā)酵結(jié)束,除去木醋桿菌細(xì)胞和衣藻,獲得純凈的細(xì)菌纖維素。
[0010]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比其顯著優(yōu)點(diǎn)是:
[0011]1、衣藻作為一種產(chǎn)氧的微生物,與木醋桿菌共同培養(yǎng),在發(fā)酵后期,為細(xì)菌產(chǎn)纖維素提供氧氣,能解決粘度帶來的溶氧問題;
[0012]2、木醋桿菌在發(fā)酵過程中會(huì)分泌乙酸,衣藻是以乙酸為碳源的微生物,能消耗發(fā)酵液中的乙酸,使環(huán)境pH維持在適宜的水平,有利于細(xì)菌纖維素的產(chǎn)生積累,兩種微生物共培養(yǎng)能實(shí)現(xiàn)互利共生
[0013]3、本發(fā)明涉及構(gòu)建微生物共培養(yǎng)體系產(chǎn)細(xì)菌纖維的方法,工序簡(jiǎn)便、操作性強(qiáng),可實(shí)現(xiàn)規(guī)?;?、工業(yè)化生產(chǎn),能極大地降低用于提高溶解氧含量而帶來的動(dòng)力消耗,并優(yōu)化了木醋桿菌的生長(zhǎng)條件,有利于縮短其生產(chǎn)周期。
[0014]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
【附圖說明】
[0015]圖1 是本發(fā)明木醋桿菌 Acetobacter xy linum NUST4.2_ 衣藻 Chlamydomonas 共培養(yǎng)體系構(gòu)建的流程圖。
[0016]圖2是對(duì)比例中木醋桿菌單獨(dú)發(fā)酵過程中BC產(chǎn)量與pH隨發(fā)酵時(shí)間變化圖。
[0017]圖3是實(shí)施例3中木醋桿菌-衣藻共培養(yǎng)過程中BC產(chǎn)量與pH隨發(fā)酵時(shí)間變化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]結(jié)合附圖,構(gòu)建木醋桿菌-衣藻共培養(yǎng)體系的方法,步驟如下:
[0019]第一步:木醋桿菌與衣藻分別在不同的生長(zhǎng)條件下進(jìn)行種子培養(yǎng),其中木醋桿菌種子培養(yǎng)條件為:溫度25-32°C,搖床轉(zhuǎn)速90-250rpm,培養(yǎng)時(shí)間6-72h ;衣藻種子培養(yǎng)條件:溫度20-25°C,搖床轉(zhuǎn)速80-270rpm,光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6_48h ;
[0020]第二步:將衣藻種子液經(jīng)離心濃縮后,加入0.3-1.0% (w/v)的海藻酸鈉溶膠中,通過控制微流控技術(shù),利用注射栗注射至濃度為0.3-1.0% (w/v)氯化鈣溶液中進(jìn)行固定化,衣藻固定于線狀凝膠中;
[0021]第三步:木醋桿菌以2-20%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中后,加入第二步中制備的衣藻,在光照條件下進(jìn)行發(fā)酵動(dòng)態(tài)培養(yǎng);
[0022]第四步:發(fā)酵結(jié)束,獲得的產(chǎn)物放入0.8-1.2mol/L pH7左右的磷酸緩沖溶液中震蕩,過濾,棄濾液,除去海藻酸鈣,隨后用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1_10%。(w/v) NaOH、1-10%。卜八)!1202的溶液在70-100°C條件下處理0.5-3.0小時(shí),去離子水洗滌至pH中性,即可獲得純凈的細(xì)菌纖維素。
[0023]為了更好地理解本發(fā)明,下面通過具體的實(shí)施例來具體說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0024]實(shí)施例1:
[0025]本發(fā)明為一種通過構(gòu)建微生物共培養(yǎng)體系提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的方法:
[0026]第一步:將兩種微生物各自在種子液中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。木醋桿菌放在30°C 160rpm搖床培養(yǎng)36h,衣藻放在22°C 160rpm光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h用于制備各微生物種子液;
[0027]第二步:將衣藻種子液經(jīng)離心濃縮后,加入1mL0.8% (w/v)的海藻酸鈉溶膠中,均勻混合后,用注射栗控制流速為200mL/h注射至濃度為1% (w/v)氯化鈣溶液中進(jìn)行固定化,固定化衣藻所用一次性注射器針頭容量10mL,內(nèi)徑為0.4_,衣藻固定于線狀凝膠中;
[0028]第三步:木醋桿菌以8%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中后,搖瓶動(dòng)態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)24h后加入第二步的固定化衣藻,進(jìn)行發(fā)酵動(dòng)態(tài)培養(yǎng);
[0029]第四步:發(fā)酵結(jié)束后,將獲得的產(chǎn)物放入0.lmol/L pH = 7.8磷酸緩沖溶液中震蕩,過濾,棄濾液,除去固定化衣藻凝膠,然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%。(w/v)的NaOH和3%。(v/v)的H2O2在85°C條件下處理I小時(shí),獲得的纖維素用去離子水洗滌至pH中性為止。
[0030]實(shí)施例2:
[0031]本發(fā)明為一種通過構(gòu)建微生物共培養(yǎng)體系提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的方法:
[0032]第一步:將兩種微生物各自在種子液中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。木醋桿菌放在29 °C 150rpm搖床培養(yǎng)36h,衣藻放在23°C 160rpm光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h用于制備各微生物種子液;
[0033]第二步:將衣藻種子液經(jīng)離心濃縮后,加入1mLl.0% (w/v)的海藻酸鈉溶膠中,均勻混合后,用注射栗控制流速為200mL/h注射至濃度為0.8% (w/v)氯化鈣溶液中進(jìn)