用于制備視網(wǎng)膜組織和視網(wǎng)膜相關(guān)細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及制備視網(wǎng)膜組織和視網(wǎng)膜相關(guān)細(xì)胞如視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞和視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞等的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]作為由多能干細(xì)胞制備三維視網(wǎng)膜組織的方法，被證明的是通過在無血清培養(yǎng)基中形成均質(zhì)的多能干細(xì)胞的團(tuán)聚體，將其在基底膜制劑存在下進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，并且在器官培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)來獲得多層視網(wǎng)膜組織的方法(非專利文獻(xiàn)I和專利文獻(xiàn)I )，以及通過在含有抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中形成均質(zhì)的多能干細(xì)胞的團(tuán)聚體，將其在基底膜制劑存在下進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，并且在含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)來獲得多層視網(wǎng)膜組織的方法(非專利文獻(xiàn)2和專利文獻(xiàn)2)。
[0003][文獻(xiàn)列表]
[0004]專利文獻(xiàn)
[0005]專利文獻(xiàn)1:W0 2011/055855
[0006]專利文獻(xiàn)2:WO2013/077425
[0007]非專利文獻(xiàn)
[0008]非專利文獻(xiàn)1:恥忉代，472，51-56(2011)
[0009]非專利文獻(xiàn)2:CellStem Cell ,10(6) ,771-785(2012)
[0010]發(fā)明概述
[0011]發(fā)明要解決的問題
[0012]需要開發(fā)由多能干細(xì)胞制備視網(wǎng)膜組織的方法。
[0013]解決問題的手段
[0014]本發(fā)明提供由多能干細(xì)胞制備視網(wǎng)膜組織和視網(wǎng)膜相關(guān)細(xì)胞如視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞和視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞等的方法。
[0015]因此，本發(fā)明提供:
[0016][ I ]用于制備視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的方法，所述方法包括
[0017](I)第一步，在無血清培養(yǎng)基中對多能干細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)以形成多能干細(xì)胞的團(tuán)聚體，和
[0018](2)第二步，在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中對步驟(I)中形成的團(tuán)聚體進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，所述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)，由此獲得含視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的團(tuán)聚體(下文中有時被稱為本發(fā)明的制備方法I);
[0019][2]用于制備視網(wǎng)膜組織的方法，所述方法包括
[0020](I)第一步，在無血清培養(yǎng)基中對多能干細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)以形成多能干細(xì)胞的團(tuán)聚體，
[0021](2)第二步，在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中對步驟(I)中形成的團(tuán)聚體進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，所述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)，由此獲得含視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的團(tuán)聚體，和
[0022](3)第三步，在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中對步驟(2)中形成的團(tuán)聚體進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，所述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種，由此獲得含有視網(wǎng)膜組織并且基本上不含非神經(jīng)頭部外胚層的團(tuán)聚體(下文中有時被稱為本發(fā)明的制備方法2)；
[0023][3]用于制備視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞的方法，所述方法包括
[0024](I)第一步，在無血清培養(yǎng)基中對多能干細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)以形成多能干細(xì)胞的團(tuán)聚體，
[0025](2)第二步，在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中對步驟(I)中形成的團(tuán)聚體進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，所述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)，由此獲得含視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的團(tuán)聚體，和
[0026](3)第三步，在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中對步驟(2)中形成的團(tuán)聚體進(jìn)行懸浮培養(yǎng)直至目標(biāo)視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)，所述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種，由此獲得含有含目標(biāo)視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞的視網(wǎng)膜組織并且基本上不含非神經(jīng)頭部外胚層的團(tuán)聚體(下文中有時被稱為本發(fā)明的制備方法3)；
[0027][4]前述[I]至[3]中任一項的方法，其中所述多能干細(xì)胞是靈長類動物多能干細(xì)胞；
[0028][5]前述[I]至[4]中任一項所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞是人多能干細(xì)胞；
[0029][6]前述[I]至[5]中任一項所述的方法，其中所述步驟(I)和步驟(2)在血清代替物存在下進(jìn)行；
[0030][7]前述[I]至[6]中任一項所述的方法，其中所述懸浮培養(yǎng)在不存在基底膜制劑的情況下進(jìn)行；
[0031][8]前述[I]至[7]中任一項所述的方法，其中所述作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)是一個或多個選自由以下各項組成的組的蛋白質(zhì):BMP2、BMP4、BMP7和⑶F7;
[0032][9]前述[I]至[8]中任一項所述的方法，其中所述作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)在自步驟(I)中的懸浮培養(yǎng)開始起的第I天至第15天之間被添加到所述培養(yǎng)基；
[0033][10]用于評估毒性或藥物效力的試劑，所述試劑包含視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞、視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞，所述細(xì)胞或組織是通過前述[I]至[9]中任一項所述的方法制備的；
[0034][11]評估測試物質(zhì)的毒性或藥物效力的方法，所述方法包括將視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞、視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞與所述測試物質(zhì)接觸，并且檢測所述物質(zhì)對所述細(xì)胞或組織的影響，所述細(xì)胞或組織是通過前述[I ]至[9]中任一項所述的方法制備的；
[0035][12]用于由視網(wǎng)膜組織的紊亂所致的疾病的治療劑，所述治療劑包含視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞、視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞，所述細(xì)胞或組織是通過前述[I]至[9]中任一項所述的方法制備的；
[0036][13]治療由視網(wǎng)膜組織的紊亂所致的疾病的方法，所述方法包括移植有效量的視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞、視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞至需要所述移植的受試者，所述細(xì)胞或組織是通過前述[I]至[9]中任一項所述的方法制備的；
[0037][14]視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞、視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞，其用于治療由視網(wǎng)膜組織的紊亂所致的疾病，所述細(xì)胞或組織是通過前述[I]至[9]中任一項所述的方法制備的；
[0038]等等。
[0039]發(fā)明效果
[0040]根據(jù)本發(fā)明的制備方法，可以高效制備視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞、視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞。在本發(fā)明的制備方法中，因為視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞、視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞可以通過在不向培養(yǎng)基添加基底膜制劑的情況下(即，在不存在基底膜制劑的情況下)對團(tuán)聚體進(jìn)行懸浮培養(yǎng)來獲得，獲得的細(xì)胞或組織被來源于異源物種的組分污染的風(fēng)險降低。根據(jù)本發(fā)明的制備方法，可以有效提供視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜相關(guān)細(xì)胞如視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞和視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞以用于化學(xué)物質(zhì)等的毒性或效力評估、移植治療等目的。
[0041 ] 附圖簡述
[0042]圖1顯示在不向培養(yǎng)基添加作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的情況下，來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第18天的光場圖像(A)和熒光圖像(B)，在開始懸浮培養(yǎng)起的第3天補充有100ng/ml的BMP2的培養(yǎng)基中的、來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第18天的光場圖像(C)和熒光圖像(D)，在開始懸浮培養(yǎng)起的第3天補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中的、來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第18天的光場圖像(E)和熒光圖像(F)，在開始懸浮培養(yǎng)起的第3天補充有100ng/ml的BMP7的培養(yǎng)基中的、來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第18天的光場圖像(G)和熒光圖像(H)，以及在開始懸浮培養(yǎng)起的第3天補充有100ng/ml的⑶F7的培養(yǎng)基中的、來源于dRAX::GFP敲入的人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第18天的光場圖像(I)和熒光圖像(J)。
[0043]圖2顯示在不向培養(yǎng)基添加作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的情況下，來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第26天的光場圖像(A)、熒光圖像(B)和FACS柱狀圖(C)，在開始懸浮培養(yǎng)的同時(第O天)補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中的、來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第26天的光場圖像(D)和熒光圖像(E)和FACS柱狀圖(F)，在開始懸浮培養(yǎng)起的第I天補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中的、來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第26天的光場圖像(G)、熒光圖像(H)和FACS柱狀圖(I)，在開始懸浮培養(yǎng)起的第2天補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中的、來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第26天的光場圖像(J)、熒光圖像(K)和FACS柱狀圖(L)，以及在開始懸浮培養(yǎng)起的第3天補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中的、來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第26天的光場圖像(M)、熒光圖像(N)和FACS柱狀圖(O)。
[0044]圖3顯示在不向培養(yǎng)基添加作用于BMP4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的情況下，來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第24天的光場圖像(A)和熒光圖像(B)，在開始懸浮培養(yǎng)起的第6天補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中的、來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第24天的光場圖像(C)和熒光圖像(D)，在開始懸浮培養(yǎng)起的第9天補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中的、來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第24天的光場圖像(E)和熒光圖像(F)，在開始懸浮培養(yǎng)起的第12天補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中的、來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第24天的光場圖像(G)和熒光圖像(H)，以及在開始懸浮培養(yǎng)起的第15天補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中的、來源于dRAX::GFP敲入的人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第24天的光場圖像(I)和熒光圖像(J)。
[0045]圖4顯示在于開始懸浮培養(yǎng)起的第3天補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)直至懸浮培養(yǎng)開始起的第26天的來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體的冷凍切片的GFP熒光圖像(A)、使用抗-ChxlO抗體的熒光免疫染色圖像(B)和Hoechst染色圖像
(C)。
[0046]圖5顯示在于開始懸浮培養(yǎng)起的第3天補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)直至懸浮培養(yǎng)開始起的第117天的來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體的冷凍切片的使用抗-恢復(fù)蛋白(Recoverin)抗體的免疫染色圖像(A)、使用抗-NrI抗體的免疫染色圖像(B)、使用抗-RXR-γ抗體的免疫染色圖像(C)、使用抗-ChxlO抗體的免疫染色圖像
(D)、使用抗-鈣視網(wǎng)膜蛋白(Calretinin)抗體的免疫染色圖像(E)和使用抗-鈣結(jié)合蛋白(Calbindin)抗體的免疫染色圖像(F)。
[0047]圖6顯示在于開始懸浮培養(yǎng)起的第6天補充有1.5ηΜ的ΒΜΡ4的培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)直至懸浮培養(yǎng)開始起的第50天的來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體的冷凍切片的使用抗-ChxlO抗體的免疫染色圖像(A)、使用抗-Pax6抗體的免疫染色圖像(B)、使用抗-Crx抗體的免疫染色圖像(C)和使用抗-Brn3b抗體的免疫染色圖像(D)。
[0048]實施方案描述
[0049]以下詳細(xì)說明用于實施本發(fā)明的方案。
[0050]本發(fā)明中的“載體”表示能夠?qū)⑺璧亩嗪塑账嵝蛄修D(zhuǎn)移到目標(biāo)細(xì)胞中的載體。此種載體的實例包括能夠在宿主細(xì)胞如原核細(xì)胞，酵母，動物細(xì)胞，植物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，動物個體和植物個體中自發(fā)復(fù)制的載體，能夠被整合到宿主細(xì)胞的染色體中的載體，在適于多核苷酸轉(zhuǎn)錄的位置處含有啟動子的載體等。
[0051]在這些載體中，適于克隆的載體有時被稱為“克隆載體”?？寺≥d體的實例包括通常具有包含多個限制酶位點的多個克隆位點的載體。例如，可以提及的是SambrookJ和Russell^D-WjauMolecular Cloning(第3版)，，，Appendix 3(Volume 3) ,Vectors andBacterial strains.A3.2(Cold Spring Harbor USA，2