用于檢測(cè)單細(xì)胞中的核酸和蛋白的鄰近測(cè)定的制作方法
【專利說明】用于檢測(cè)單細(xì)胞中的核酸和蛋白的鄰近測(cè)定
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2013年9月4日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/873,820和于2014年5月1 日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/987,401的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，所述申請(qǐng)的每個(gè)通過引用并入本文。 [000；3]背景
[0004] 檢測(cè)和定量來自個(gè)體細(xì)胞的蛋白和核酸是期望的，但由于在單細(xì)胞中存在的物質(zhì) 的微小的量而難W實(shí)現(xiàn)。此外，不像大塊樣品（bulk sample),單細(xì)胞不能被劃分為多個(gè)部 分來分別分析蛋白和核酸。盡管單分子檢測(cè)技術(shù)或質(zhì)譜可提供用于實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分析的方 法，但此類方法是昂貴的。已開發(fā)了鄰近延伸測(cè)定（proximity extension assays,PEA)，其 足夠靈敏^檢測(cè)皮克量的蛋白（參見，例如，山11(比6'旨等，加(31.4(^(13 1?63.2011年8月；39 (15): e 102; epub 2011年6月6日，通過引用并入本文）。在一種方法中，PEA采用一對(duì)抗體，每 個(gè)抗體具有附接至它的寡核巧酸。寡核巧酸包含彼此互補(bǔ)的區(qū)域。當(dāng)抗體結(jié)合至祀蛋白時(shí)， 寡核巧酸足夠緊密鄰近，使得來自每個(gè)寡核巧酸的互補(bǔ)區(qū)域彼此雜交。DNA聚合酶的添加導(dǎo) 致雜交的寡核巧酸的延伸。然后可檢測(cè)或定量延伸產(chǎn)物。
[0005] 本發(fā)明設(shè)及鄰近延伸測(cè)定，所述鄰近延伸測(cè)定被用來檢測(cè)單細(xì)胞中的蛋白、核酸 W及蛋白-蛋白和蛋白-核酸復(fù)合物相互作用。
[0006] 本發(fā)明的方面的簡述
[0007] 在多個(gè)方面，本發(fā)明包括但不限于W下的實(shí)施方案：
[000引在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)單細(xì)胞中的感興趣的分析物的方法，所述方法包 括:a)分離單細(xì)胞;b)在裂解緩沖液中解育單細(xì)胞W獲得細(xì)胞裂解物，所述裂解緩沖液包含 W低于臨界膠束濃度的濃度存在的去垢劑;C)將細(xì)胞裂解物與兩種或更多種鄰近延伸探針 一起在其中鄰近延伸探針與細(xì)胞裂解物中的祀分析物(如果存在)結(jié)合的條件下，在從約15 °C至約5(TC的解育溫度在結(jié)合反應(yīng)物中解育持續(xù)從約5分鐘至約6小時(shí)的時(shí)間長度;d)將結(jié) 合反應(yīng)物與包含聚合酶的延伸混合物一起解育，其中鄰近延伸探針的雜交的寡核巧酸組分 被聚合酶延伸，W產(chǎn)生延伸產(chǎn)物；W及e)檢測(cè)延伸產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，在添加延伸混 合物之前，將結(jié)合反應(yīng)物W例如從約1: 2至約1: 20或從約1:4至約1:10的范圍稀釋。在一些 實(shí)施方案中，鄰近延伸探針的至少一個(gè)包含抗體作為分析物結(jié)合組分。在一些實(shí)施方案中， 鄰近延伸探針的每個(gè)包含抗體作為分析物結(jié)合組分。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)在液滴 (droplet)、孔或者微流體裝置的室或通道中進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)在液滴中進(jìn)行。 在一些實(shí)施方案中，結(jié)合反應(yīng)物的解育時(shí)間少于約3小時(shí)或少于約2小時(shí)或少于約1小時(shí)。在 一些實(shí)施方案中，將結(jié)合反應(yīng)物在從約25°C至約50°C或從約30°C至約45°C的溫度解育。在 一些實(shí)施方案中，鄰近探針W從約lOpM至約50pM的范圍的濃度存在于結(jié)合反應(yīng)物中。在一 些實(shí)施方案中，步驟b至d同時(shí)進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，步驟b至d順序地進(jìn)行。在一些實(shí)施 方案中，步驟b和C同時(shí)進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，步驟C在步驟d之前進(jìn)行。在此類實(shí)施方案 中，步驟C可與步驟b同時(shí)進(jìn)行，或b和C可順序地進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，去垢劑是非離子 去垢劑或兩性離子去垢劑。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括在延伸反應(yīng)之后進(jìn)行的逆轉(zhuǎn) 錄反應(yīng)或全基因組擴(kuò)增反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可與延伸反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。
[0009] 在另外的方面，本發(fā)明提供了一種多重蛋白檢測(cè)方法（multiplex protein detection method)，所述方法包括將測(cè)試樣品與多個(gè)探針一起解育，W檢測(cè)一種或更多種 感興趣的蛋白的存在；W及將包含來自胸腺上皮細(xì)胞的裂解物的陽性對(duì)照樣品與多個(gè)探針 一起解育，其中裂解物包含探針的蛋白結(jié)合部分能夠與其結(jié)合的蛋白，W及檢測(cè)探針與裂 解物中的蛋白的結(jié)合，其中多個(gè)探針與裂解物中的同源（cognate)蛋白的結(jié)合的存在是用 于多重蛋白檢測(cè)測(cè)定的陽性對(duì)照。在一些實(shí)施方案中，胸腺上皮細(xì)胞是人上皮細(xì)胞。在一些 實(shí)施方案中，裂解物來自單細(xì)胞。
[0010] 在另外的方面，本發(fā)明提供了一種為單細(xì)胞多重鄰近延伸測(cè)定控制測(cè)定條件W檢 測(cè)感興趣的樣品中一種或更多種蛋白的存在的方法，所述方法包括分離單個(gè)測(cè)試細(xì)胞和分 離胸腺上皮細(xì)胞，裂解所分離的測(cè)試細(xì)胞和所分離的胸腺上皮細(xì)胞并對(duì)測(cè)試細(xì)胞的裂解物 和胸腺上皮細(xì)胞的裂解物進(jìn)行多重鄰近檢測(cè)測(cè)定；W及檢測(cè)來自胸腺上皮細(xì)胞的裂解物中 鄰近探針對(duì)的雜交的寡核巧酸組分的延伸的產(chǎn)物，從而提供用于單細(xì)胞多重檢測(cè)測(cè)定的測(cè) 定條件的陽性對(duì)照。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定在微流體裝置中進(jìn)行。在一些方面，本發(fā)明另 外提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含鄰近延伸探針組，例如用于多重測(cè)定W鑒定溶液W 及來自胸腺上皮細(xì)胞的裂解物中兩種或更多種感興趣的蛋白的鄰近延伸探針組。
[0011] 在另外的方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)存在于單細(xì)胞的表面上的感興趣的祀分析 物，通常地蛋白的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括a)分離單細(xì)胞;b)將單細(xì)胞與兩 種或更多種鄰近延伸探針一起在結(jié)合反應(yīng)物中在其中鄰近延伸探針與祀分析物（如果存 在)結(jié)合的條件下，例如在從約15Γ至約5(TC的解育溫度解育持續(xù)從約5分鐘至約6小時(shí)的 時(shí)間長度;C)將結(jié)合反應(yīng)物與包含聚合酶的延伸混合物一起解育，其中鄰近延伸探針的雜 交的寡核巧酸組分被聚合酶延伸，W產(chǎn)生延伸產(chǎn)物；W及e)檢測(cè)延伸產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案 中，所述方法還包括裂解細(xì)胞W及利用如本文描述的鄰近延伸測(cè)定檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白的存在 的步驟。
[0012] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)蛋白與單鏈核酸的相互作用的鄰近延伸檢 測(cè)探針組，其中探針組包括第一鄰近探針和第二鄰近探針，所述第一鄰近探針包含:與蛋白 結(jié)合的結(jié)合區(qū)域和包含相互作用區(qū)域的第一寡核巧酸;所述第二鄰近探針包含:包含與單 鏈核酸雜交的區(qū)段和包含與第一鄰近探針的相互作用區(qū)域互補(bǔ)的相互作用區(qū)域的區(qū)段的 寡核巧酸，其中，當(dāng)?shù)鞍着c單鏈核酸結(jié)合時(shí)，第一探針的相互作用區(qū)域與第二探針的互補(bǔ)區(qū) 段雜交。本發(fā)明另外提供了一種檢測(cè)蛋白與單鏈核酸的相互作用的方法，所述方法包括使 用此探針組進(jìn)行鄰近延伸反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)對(duì)從單細(xì)胞獲得的樣品進(jìn)行。 [001引在另外的方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)在來自單細(xì)胞的樣品中抗原，通常地蛋白 抗原的存在的方法，所述方法包括:裂解單細(xì)胞W獲得細(xì)胞裂解物;將裂解物與結(jié)合感興趣 的抗原的抗原結(jié)合部分一起在其中抗原結(jié)合部分與抗原結(jié)合W形成抗原/抗原結(jié)合部分復(fù) 合物的條件下解育，其中，將抗原結(jié)合部分固定至固相;洗涂包含復(fù)合物的固相；W及利用 鄰近延伸測(cè)定檢測(cè)復(fù)合物。在典型的實(shí)施方案中，所述方法在微流體裝置中進(jìn)行。在一些實(shí) 施方案中，將抗原結(jié)合部分固定至珠。在一些實(shí)施方案中，將裂解物與多個(gè)珠和多個(gè)鄰近延 伸探針對(duì)一起解育。在一些實(shí)施方案中，與固相結(jié)合的抗原結(jié)合部分是鄰近延伸對(duì)的組分。 在一些實(shí)施方案中，將抗原/抗原結(jié)合部分復(fù)合物與鄰近探針對(duì)一起解育，所述鄰近探針對(duì) 的每個(gè)包含與抗原上的不同表位結(jié)合的抗原結(jié)合部分。在典型的實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部 分是抗體。
[0014] 在另外的方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣品中抗原，通常地蛋白抗原的存在的方 法，所述方法包括將樣品與包括Ξ種鄰近探針的鄰近延伸探針組一起解育，其中（i)第一探 針包含：（a)與抗原的第一表位結(jié)合的結(jié)合區(qū)域和(b)包含與第二鄰近探針的寡核巧酸的雜 交區(qū)域互補(bǔ)的雜交區(qū)域的寡核巧酸；（ii)第二鄰近探針包含：（a)與抗原上的第二表位結(jié)合 的結(jié)合區(qū)域和(b)包含與第一探針的雜交區(qū)域互補(bǔ)的第一雜交區(qū)域和與第Ξ探針的雜交區(qū) 域互補(bǔ)的第二雜交區(qū)域的寡核巧酸;并且（iii)探針包含：（a)與抗原上的第Ξ表位結(jié)合的 結(jié)合區(qū)域和(b)包含與第二鄰近探針的第二雜交區(qū)域互補(bǔ)的雜交區(qū)域的寡核巧酸；W及檢 測(cè)鄰近探針組的相互作用。在一些實(shí)施方案中，樣品來自單細(xì)胞。在典型的實(shí)施方案中，結(jié) 合區(qū)域的一個(gè)或更多個(gè)是抗體。
[0015] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種鄰近延伸探針組，所述鄰近延伸探針組包括:第 一鄰近探針和第二鄰近探針，其中：鄰近探針對(duì)的第一成員包含連接至包含引物結(jié)合位點(diǎn)、 第一雜交區(qū)域、間隔區(qū)W及第二雜交區(qū)域的寡核巧酸的第一抗體;且鄰近探針對(duì)的第二成 員包含抗體、引物結(jié)合位點(diǎn)、與第一鄰近探針的第一雜交區(qū)域互補(bǔ)的第一雜交區(qū)域、間隔區(qū) W及與第一鄰近探針的第二雜交區(qū)域互補(bǔ)的第二雜交區(qū)域;并且此外，其中引物結(jié)合位點(diǎn) 的長度為16至24個(gè)核巧酸，第一雜交區(qū)域的長度為6至9個(gè)核巧酸，間隔區(qū)的長度為8至15個(gè) 核巧酸，且第二雜交區(qū)域的長度為4至6個(gè)核巧酸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含此 鄰近延伸探針組的鄰近延伸反應(yīng)混合物W及分析樣品用于確定分析物的存在的方法，所述 方法包括使用此探針組檢測(cè)分析物的存在。
[0016] 附圖簡述
[0017] 圖1提供了可用來檢測(cè)與單鏈核酸(例如，RNA)相互作用的蛋白的鄰近探針對(duì)的實(shí) 例的示意圖。在本發(fā)明的實(shí)施方案的該圖示中，蛋白特異性的基于抗體的鄰近探針是鄰近 探針對(duì)的一個(gè)成員。鄰近探針對(duì)的另一成員是包含單鏈核酸特異性的區(qū)域和與基于抗體的 鄰近探針上的互補(bǔ)區(qū)域雜交的區(qū)域的嵌合DNA分子。
[0018] 圖2示出了本發(fā)明的實(shí)施方案，其中在鄰近延伸測(cè)定中采用了Ξ種不同的抗體。
[0019] 圖3示出了本發(fā)明的實(shí)施方案，其中在鄰近延伸測(cè)定中使用了Ξ種不同的鄰近探 針。在該圖示中，兩種Ab結(jié)合寡核巧酸與用于雜交的第Ξ寡核巧酸橋雜交，用于聚合酶延 伸。
[0020] 圖4A和4B.采用兩組互補(bǔ)序列的說明性鄰近延伸探針對(duì)的示意圖（A)w及此探針 對(duì)與祀結(jié)合的圖示(B)。在該實(shí)例中，每個(gè)寡核巧酸的長度為44-nt。
[0021] 圖5提供了來自實(shí)驗(yàn)的顯示背景信號(hào)比較的數(shù)據(jù):標(biāo)準(zhǔn)Proseek陰性對(duì)照(01_NC- 對(duì)照）與1 %NP40細(xì)胞裂解緩沖液(NP40+_NC-對(duì)照）。對(duì)于6種測(cè)試的蛋白祀，裂解緩沖液背 景與試劑盒的陰性對(duì)照相比一般低l-3Cq。
[0022] 圖6示出了來自比較Proseek試劑盒的陰性對(duì)照(01_NC)、0.1%非離子去垢劑緩沖 液(Tw_NC，吐溫-20;NDSB_NC，Triton X-100; NP40_NC，NP40)和 1 % 的NP40之間的背景信號(hào) 水平的實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。較低濃度的非離子去垢劑具有與Proseek試劑盒的陰性對(duì)照相同的背 景Cq水平。
[0023] 圖7A和7B提供了來自評(píng)價(jià)背景Cq的實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。上圖(A)示出了來自評(píng)價(jià)Proseek 試劑盒的陰性對(duì)照與1%的NP40作為陰性對(duì)照的Cq水平的實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，所述實(shí)驗(yàn)對(duì)于解育 步驟使用巧巾不同的探針濃度：100(對(duì)照）、66pM和33pM。對(duì)于Proseek陰性對(duì)照(01_NC)和 NP40兩者，33pM探針濃度顯示出最低的檢測(cè)到的背景信號(hào)。在該實(shí)驗(yàn)中，只有用于檢測(cè) 化CAM蛋白水平的較低的探針濃度成功地對(duì)低至16個(gè)細(xì)胞將真實(shí)信號(hào)與背景區(qū)分開(下圖， B)。運(yùn)些實(shí)驗(yàn)使用K562細(xì)胞溶液的稀釋物W不同的輸入量在板上進(jìn)行。
[0024] 圖8A和8B提供了來自比較在多種解育條件下的背景Cq的實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。
[0025] 圖9A和9B提供了來自評(píng)價(jià)背景Cq的實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。上圖（A)示出了當(dāng)使用Proseek PEA方案和其中將延伸模板的稀釋物用于延伸反應(yīng)的修改的方案時(shí)檢測(cè)到的背景信號(hào)。當(dāng) 包括稀釋步驟時(shí)，在背景信號(hào)上平均存在大致4個(gè)Cq單位的降低。與對(duì)照（原始方案，下圖， B)相比，增加的稀釋步驟允許檢測(cè)低至16個(gè)細(xì)胞的化CAM蛋白水平。
[0026] 圖10A和10B提供了來自評(píng)價(jià)背景Cq的實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。上圖（A)示出了從低至16個(gè)細(xì) 胞的細(xì)胞輸入物的信號(hào)的背景減除。在該實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)方案連同使用較低探針濃度的方案 一起被測(cè)試。對(duì)于脫天蛋白酶-3,甚至當(dāng)較低的探針濃度方案被測(cè)試時(shí)，背景信號(hào)水平不允 許與真實(shí)蛋白信號(hào)清晰地區(qū)分開。下圖（B)示出了當(dāng)根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行增加靈敏度的多種修 改時(shí)的改進(jìn)(不同的曲線顯示所使用的不同裂解緩沖液;所修改的方案不包括延伸模板稀 釋步驟）。在對(duì)于12個(gè)細(xì)胞輸入物的噪音信號(hào)和蛋白信號(hào)之間觀察到超過5個(gè)Cq單位的差 異。運(yùn)些實(shí)驗(yàn)由同一人使用K562細(xì)胞溶液的稀釋物對(duì)不同的輸入量并在不同的實(shí)驗(yàn)日在板 上進(jìn)行。
[0027] 圖11A和11B示出了監(jiān)測(cè)細(xì)胞的裂解的方法。
[0028] 圖12A和示出了Cl?單細(xì)胞自動(dòng)制備系統(tǒng)。Cl?單細(xì)胞自動(dòng)制備系統(tǒng)包括控制儀 器(A)和集成流體通路（IFC，B)，所述集成流體通路（IFC，B)包括96個(gè)單獨(dú)的捕獲位點(diǎn)和用 于下游反應(yīng)的專口的納米室。
[0029] 圖13A-13C示出了 PEA方法。圖13A顯示將每個(gè)祀特異性抗體用A寡核巧酸或B寡核 巧酸(PEA探針)標(biāo)記。在解育步驟期間，PEA探針與樣品中的特異性蛋白結(jié)合，使A寡核巧酸 和B寡核巧酸更緊密鄰近。在A寡核巧酸和B寡核巧酸內(nèi)的互補(bǔ)區(qū)域發(fā)生雜交，隨后是在隨后 的步驟中在DNA聚合酶的存在下報(bào)告物寡核巧酸延伸并擴(kuò)增。報(bào)告物寡核巧酸的檢測(cè)在 BioMark?系統(tǒng)上通過qPCR來完成。所擴(kuò)增的報(bào)告物寡核巧酸的循環(huán)闊值反映了在解育步驟 期間的祀蛋白豐度。圖13B表示連接至Cl? IFC中的4.5nL單細(xì)胞捕獲位點(diǎn)的獨(dú)立的室和閥 的系統(tǒng)。96個(gè)捕獲位點(diǎn)的每一個(gè)具有其自身的室和閥的?？谙到y(tǒng)，允許在單次運(yùn)行中對(duì)96 個(gè)單細(xì)胞并行地發(fā)生所有的PEA步驟。圖13C提供了對(duì)于所使用的Proseek Multiplex Oncology 試劑盒中包含的PEA探針組的蛋白祀的列表。在92個(gè)蛋白祀中，25個(gè)(大約 30%)被嚴(yán)格分泌，且當(dāng)進(jìn)行單細(xì)胞分析時(shí)預(yù)期不生成信號(hào)。圖13D示出了該系統(tǒng)的單細(xì)胞 至結(jié)果（single-cel 1-to-result)的周轉(zhuǎn)時(shí)間。
[0030] 圖14示出了使用該系統(tǒng)鑒定的示例性特征性蛋白表達(dá)特征。
[0031] 圖15A-1加示出了橫跨兩個(gè)獨(dú)立的Cl? PEA實(shí)驗(yàn)在特定的細(xì)胞系（（A)CR1^-7163、 (B)MDA-MB-231、（C)HL60和(D化562)中檢測(cè)到的祀。（左柱，實(shí)驗(yàn)1;右柱，實(shí)驗(yàn)2)
[0032] 圖16示出了來自對(duì)板分選的（plate-sorted)細(xì)胞進(jìn)行的PEA和對(duì)化60單細(xì)胞進(jìn)行 的兩個(gè)獨(dú)立的Cl?陽A的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0033] 圖17A-17C示出了流式細(xì)胞術(shù)和免疫巧光結(jié)果與Cl? PEA結(jié)果一致。圖17A示出了 兩個(gè)特定的祀的Cl?陽A結(jié)果使用正交方法用化60細(xì)胞和K562細(xì)胞來驗(yàn)證。圖17A提供了顯 示針對(duì)化CAM,Cl?陽A和IF的蛋白表達(dá)結(jié)果的熱圖的圖（紅色指示高表達(dá)）。圖17C提供了在 Cl? IFC室中被捕獲的兩個(gè)細(xì)胞的圖像。
[0034] 圖18提供了來自在針對(duì)K562細(xì)胞的單細(xì)胞Ci?-PEA的解育中，針對(duì)六種不同濃度 的探針的屯種祀的結(jié)果。Y軸示出了對(duì)于示例性的屯種祀的每一種的活細(xì)胞(如用活/死染 色檢測(cè)的；藍(lán)色，較下的線)或空Cl?位置（即背景;紅色，較上的線）的平均Ct值。給出了用來 計(jì)算平均Ct的活細(xì)胞或空位置的數(shù)目。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)誤差也被示出。
[0035] 圖19提供了 W下結(jié)果：顯示4°C的條件持續(xù)12-16小時(shí)的解育與37°C解育化相比產(chǎn) 生最低的Cq。
[0036] 圖20A和20B提供了來自內(nèi)部PEA對(duì)照(寡核巧酸參考）的結(jié)果，顯示在忍片上的位 置和PEA性能之間存在聯(lián)系（圖A)，運(yùn)通過轉(zhuǎn)換PEA混合物（即酶和PEA溶液）的入口來解決 (圖B)。對(duì)于兩幅圖，Ct值在Y軸上顯示且位置數(shù)目在X軸上顯示。在X軸上，反斜線左側(cè)是在 忍片的左側(cè)的位置數(shù)目（在左側(cè)的柱，藍(lán)色)且反斜線右側(cè)是忍片的右側(cè)的位置數(shù)目（在右 側(cè)的柱，紅色）。兩幅圖中的箭頭示出了最接近進(jìn)入Cl? IFC的試劑入口點(diǎn)至距離該入口最 遠(yuǎn)的點(diǎn)的位置。
[0037] 圖21.圖A示出了Cl?忍片上的入口編號(hào)。圖B示出了裝載至Cl?忍片載體的陽A試劑 的說明性最終配置。
[003引圖22提供了描述忍片上的說明性Ci?-PEA反應(yīng)。
[0039] 詳述
[0040] 定義和術(shù)語
[0041] 除非另外指明，術(shù)語"一 (a)"、"一 (an)"或"該（the)"通常意在意指"一個(gè)或更多 個(gè)'。
[0042] 在提供值的范圍處，理解為在該范圍的上限和下限之間至下限的單位的十分之一 的每個(gè)中間值，和在該規(guī)定的范圍內(nèi)的任何其他規(guī)定值或中間值被包括在本發(fā)明內(nèi)，除非 上下文另外明確地規(guī)定。運(yùn)些較小的范圍的上限和下限可W被獨(dú)立地包括在較小的范圍 內(nèi)，且也被包括在本發(fā)明內(nèi)，受制于所規(guī)定的范圍中的任何特別地排除的限制。前面有術(shù)語 "約"的數(shù)值范圍或量明確地包括精確的范圍或精確的數(shù)值量。
[0043] 如本文所用，核酸"序列"意指多核巧酸的核酸堿基序列。除非另外指明或根據(jù)上 下文是明顯的，當(dāng)堿基或序列元件在多核巧酸中出現(xiàn)時(shí)，其W5'至3'的順序呈現(xiàn)。
[0044] "多核巧酸"或"核酸"包括任何形式的RNA或DNA，包括例如，基因組DNA;互補(bǔ)DNA (cDNA)，其是信使RNA(mRNA)的DNA表示，通常通過mRNA的逆轉(zhuǎn)錄獲得；W及合成地或通過擴(kuò) 增產(chǎn)生的DNA分子。多核巧酸包括包含非標(biāo)準(zhǔn)堿基(例如，肌巧）的核酸。根據(jù)本發(fā)明的多核 巧酸通常會(huì)包含憐酸二醋鍵，盡管在一些情況中，可使用核酸類似物，其可具有替代性骨 架，包括，例如，亞憐酷胺鍵合、硫代憐酸醋鍵合、二硫代憐酸醋鍵合或0-甲基亞憐酷胺鍵合 (參見Eckstein、01 igonucleotides和Analogues : A Practical Approach , Oxford University Press);正向骨架(positive baclcbones);非離子骨架和非核糖骨架。多核巧 酸可W是單鏈的或雙鏈的。
[0045] 術(shù)語"寡核巧酸"在本文中用來指相對(duì)短、通常短于200個(gè)核巧酸、更特別地短于 100個(gè)核巧酸或短于70個(gè)核巧酸的核酸。通常，寡核巧酸是單鏈DNA分子。
[0046] 術(shù)語"區(qū)段"指多核巧酸中的序列或亞序列，諸如具有特定功能的區(qū)段，例如，探針 結(jié)合區(qū)段、引物結(jié)合區(qū)段、在本文中也被稱為"zip碼序列（zip code sequence)"的條形碼 序列W及本文中列出的其他區(qū)段。獨(dú)特的區(qū)段可具有與其預(yù)期功能一致的任何長度，諸如， 但不限于，在4-30個(gè)核巧酸的范圍內(nèi)的長度。
[0047] 如本文所用，術(shù)語"互補(bǔ)"指兩個(gè)核巧酸之間精確配對(duì)的能力。即，如果核酸的給定 位置處的核巧酸能夠與另一個(gè)核酸的核巧酸氨鍵鍵合，則運(yùn)兩個(gè)核酸被認(rèn)為在該位置處彼 此互補(bǔ)。"互補(bǔ)物"可W是精確地互補(bǔ)或部分地互補(bǔ)的序列。當(dāng)存在足夠互補(bǔ)性使得序列在 測(cè)定條件下雜交(形成部分雙鏈區(qū)域)時(shí)，認(rèn)為兩個(gè)寡核巧酸具有"互補(bǔ)的"序列。
[0048] 提及兩個(gè)多核巧酸序列、區(qū)段或鏈，術(shù)語"退火"、"雜交"或"結(jié)合"可互換使用，并 具有本領(lǐng)域中的通常含義。兩個(gè)互補(bǔ)序列(例如，DNA和/或RNA)通過與互補(bǔ)堿基形成氨鍵來 退火或雜交，W產(chǎn)生雙鏈多核巧酸或多核巧酸的雙鏈區(qū)域。
[0049] 如果不存在分隔開多核巧酸中的兩個(gè)序列或區(qū)段的間插序列或非核巧酸連接體， 則該兩個(gè)序列或區(qū)段是"相鄰的(adjacent)"或"鄰接的（contiguousΓ。
[0050] "引物"是包含與祀序列或其互補(bǔ)物互補(bǔ)并能夠與祀序列或其互補(bǔ)物雜交的序列 的寡核巧酸或多核巧酸。通常，"引物"意指可引發(fā)模板依賴的DNA合成的"可延伸引物"。
[0051] 術(shù)語"多重的"和"多重"指其中在相同的反應(yīng)混合物中評(píng)價(jià)兩種或更多種分析物 的測(cè)定。例如，多重測(cè)定可包括多個(gè)鄰近延伸組，W使得可在相同的反應(yīng)混合物中檢測(cè)多種 分析物，例如多種蛋白。
[0052] 如本文所用，核酸序列的"擴(kuò)增"具有其通常的含義，并且指用于酶促增加祀序列 的拷貝數(shù)的體外技術(shù)。擴(kuò)增方法包括不對(duì)稱方法(其中主要產(chǎn)物是單鏈的）和常規(guī)方法(其 中主要產(chǎn)物是雙鏈的)兩者。
[0053] 術(shù)語"擴(kuò)增子"和"擴(kuò)增產(chǎn)物'可互換使用，并具有其在本領(lǐng)域中的常規(guī)含義。語法 上的單數(shù)術(shù)語"擴(kuò)增子"，可指擴(kuò)增產(chǎn)物的許多相同拷貝。此外，提及"擴(kuò)增子"包括在擴(kuò)增步 驟中產(chǎn)生的分子和在隨后的擴(kuò)增步驟中產(chǎn)生的相同分子(諸如，但不限于，在隨后幾輪PCR 擴(kuò)增中產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物佩者。此外，術(shù)語"擴(kuò)增"可指變性、退火和延伸的循環(huán)，而不要求序 列的幾何或指數(shù)增加。
[0054] "擴(kuò)增反應(yīng)混合物"是在其中發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)的溶液，并可包括W下中的一個(gè)或更多 個(gè):祀多核巧酸、引物、聚合酶、擴(kuò)增子、擴(kuò)增試劑，所述擴(kuò)增試劑例如緩沖劑、核酸酶抑制 劑、二價(jià)陽離子、dNTP、和/或本領(lǐng)域已知的用于擴(kuò)增的其他組分。
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