CTC計數(shù)還可用于評估治療效果，而且對活的CTC的研究有助于理解復(fù)雜的癌癥轉(zhuǎn)移過程。 也就是說，對主要負責(zé)轉(zhuǎn)移的循環(huán)腫瘤細胞(CTC)的檢測可提供有關(guān)于疾病階段和癌癥進 程的有價值的見解。此外，CTC計數(shù)還有助于治療響應(yīng)的臨床評價和監(jiān)測。由于CTC極其稀 少，少至數(shù)毫升內(nèi)的1〇 7~1〇9個血液細胞中才存在一個，而且其形貌和分子特征具有高度異 構(gòu)性，因此血液中CTC的分離一直是一項技術(shù)難題。
[0027] 因此，在一個方面，本發(fā)明還涉及從個人樣本中檢測一種或多種循環(huán)腫瘤細胞的 方法。該方法包括將所述樣本引入微流體裝置的至少一個入口內(nèi)，所述微流體裝置包括一 個或多個螺旋形通道，其中，每個通道具有長度和截面，所述截面的高度和寬度定義了適于 根據(jù)細胞大小沿所述通道截面各部分分離循環(huán)腫瘤細胞的高寬比;所述循環(huán)腫瘤細胞沿所 述通道的徑向最內(nèi)部分流至第一出口，而所述樣本中的其他細胞沿所述通道的另一部分流 至第二出口。該方法還可包括從所述第一出口收集循環(huán)腫瘤細胞，以及通過分析所述循環(huán) 腫瘤細胞，評估治療效果。其中，所述樣本可以為血樣。
[0028] 本文描述了一種利用微流體從血液中分揀循環(huán)腫瘤細胞(CTC)的高處理量細胞分 離技術(shù)。在一個方面，上述設(shè)計由經(jīng)聚二甲基硅氧烷(PDMS)制造的低高寬比螺旋形微通道 構(gòu)成。所述分離過程依靠較大細胞尺寸導(dǎo)致的慣性升力與螺旋幾何形狀導(dǎo)致的迪恩拖曳力 之間的相互作用，使細胞在所述微通道截面內(nèi)的不同位置處達到平衡。如此，通過設(shè)計合適 的二叉出口，便可根據(jù)細胞大小對細胞進行單獨收集。此技術(shù)用于從血液細胞(RBC約8μπι， 白細胞(WBC)約8~12μπι)中分離尺寸更大的CTC(直徑通常約15~20μπι)，以進行早期癌癥檢 測及治療效率監(jiān)測。
[0029]在螺旋形微通道內(nèi)流動時，細胞承受慣性升力以及離心加速度引起的迪恩拖曳力 的合力。所述慣性升力隨細胞大小的四次方變化，而且用于將細胞聚集于所述微通道截面 內(nèi)的多個不同平衡位置上。通過設(shè)計螺旋形微通道而增加迪恩拖曳分力后，可將上述多個 平衡位置減少至僅一個靠近微通道壁內(nèi)側(cè)壁的平衡位置。由于升力與迪恩拖曳力的比值隨 細胞大小的變化而變化，各細胞可根據(jù)其尺寸平衡于沿所述微通道截面的不同位置處，其 中，最大的細胞在最靠近微通道壁的位置達到平衡。如此，便可演化出不同的細胞流，通過 設(shè)計合適的出口，可實現(xiàn)這些細胞流的分別單獨收集。
[0030] 因此，通過在所述微流體裝置的至少一個入口處將細胞懸浮液限制于所述截面的 內(nèi)半部分，并確保只有較大細胞受慣性力影響，而較小細胞僅受迪恩拖曳力影響，便可實現(xiàn) 高分辨率細胞分離。所述微通道的設(shè)計參數(shù)可易于通過下文所述數(shù)值模型調(diào)整，以變更臨 界尺寸（即尺寸大于所述臨界尺寸的細胞因慣性力聚集，而尺寸小于所述臨界尺寸的細胞 則不因慣性力聚集），從而為任何類型的細胞/顆?；旌衔镙p易地設(shè)計及配置出所需的通 道。
[0031] 所述裝置由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成，并且結(jié)合至顯微鏡載玻片上（圖1Α和圖 1Β)。所述微通道設(shè)計由具有一外擴8等分出口系統(tǒng)的500Χ100μπι(寬X高)微通道組成。所 述入口處樣本由含不同CTC濃度的稀釋全血(0.1%紅細胞比容)構(gòu)成。當(dāng)樣本流經(jīng)所述微通 道時，正常RBC、白細胞和CTC根據(jù)其尺寸在微通道截面上達到平衡。CTC因尺寸較大（約15~ 20μπι)而主要受慣性升力影響，從而在靠近通道內(nèi)側(cè)壁處達到平衡。相對于CTC而言較小的 RBC(約8μπι)和白細胞（約8-12μπι)因更多受迪恩拖曳力影響而聚集于離所述微通道內(nèi)側(cè)壁 更遠的位置，從而實現(xiàn)分離。如圖2所示，通過設(shè)計低高寬比的微通道，可將上述平衡位置差 異放大，以便于在出口 1處收集罕量CTC，同時使其他出口處含有其余血細胞，從而實現(xiàn)基于 尺寸的持續(xù)高處理量的分離。在本技術(shù)的另一實施方式中，所述分離技術(shù)還可用于分離其 它罕量細胞，包括從腹水中分離基質(zhì)細胞，從血液中分離白血病細胞，以及從母體血中分離 胎兒有核紅細胞。
[0032] 在一些實施方式中，所述通道的高寬比處于約1和約5之間的范圍內(nèi)，例如為約 3.75。在某些實施方式中，所述方法可包括，根據(jù)細胞直徑，將混合細胞類型細胞群內(nèi)的干 細胞或前驅(qū)細胞分離為功能相異的子群。其后，可從所述裝置中收集上述子群并分析其特 有的新陳代謝功能，例如，對可能具有更高增值、分化、或響應(yīng)特定藥物的能力的特定子群 進行分離和富集。在某些實施方式中，所述通道寬度可以為約500μπι，所述通道高度可以為 約 100μL?ο
[0033] 本文描述了一種基于尺寸的高處理量細胞分離技術(shù)，該技術(shù)利用螺旋形微通道幾 何形狀從全血中分揀循環(huán)腫瘤細胞(CTC)。該設(shè)計利用作用于各種尺寸細胞上的慣性升力 和粘滯拖曳力實現(xiàn)差速迀移。起主要作用的慣性力以及螺旋形微通道幾何形狀引起的迪恩 旋轉(zhuǎn)力使得較大的CTC聚集并占據(jù)靠近所述微通道內(nèi)側(cè)壁的單個平衡位置。較小的血液成 分(RBC和白細胞)在迪恩力的影響下迀移至通道的外半部分，從而形成兩個不同的細胞流， 該細胞流隨后在不同出口處被收集。利用其全血處理能力，本發(fā)明技術(shù)在處理1毫升全血時 只需花費不到10分鐘的時間，同時可以將99%的血液細胞移除，并在內(nèi)側(cè)出口處回收90% 的 CTC。
[0034] 當(dāng)流體流經(jīng)曲線形通道時，將承受徑向向外的離心加速度，從而在通道頂半部和 底半部形成兩個反向旋轉(zhuǎn)渦流，稱為迪恩渦。這些次級流的大小由無量綱參數(shù)一一迪恩數(shù) (De)量化，迪恩數(shù)如下式所示：
[0035]
[0036]其中，P為流體密度(kg/m3)，Uf為平均流速(m/s)，μ為流體粘度(kg/ms)，R。為通道 路徑的曲率半徑(m)，DH為通道液壓直徑(m)，Re為流動雷諾數(shù)(慣性力與粘性力之比）。所述 流速通過改變流量或栗壓單元(如注射栗)所受壓力的方式得到調(diào)整。因此，在上述橫向迪 恩流的作用下，流動于曲線形通道內(nèi)的顆粒承受拖曳力，該拖曳力沿所述旋渦內(nèi)流動方向 挾裹并驅(qū)動所述顆粒。當(dāng)從頂部或底部觀察時，上述運動體現(xiàn)為所述顆粒沿通道寬度在內(nèi) 外側(cè)壁之間所作的前后運動，而且越處于下游，所述前后運動的距離越大。在通道內(nèi)流動 時，細胞的橫向迀移速度取決于迪恩數(shù)，并可通過下式計算：
[0037]
[0038]其中，P為流體密度(kg/m3)，μ為流體粘度(kg/ms)，Dh為通道液壓直徑(m)，k為針對 此類曲線通道確定的經(jīng)驗比例系數(shù)，其值約為0.01，而且已利用此類通道的C0MS0L模型對 其進行了驗證。
[0039] 顆粒沿迪恩渦的橫向經(jīng)過距離可根據(jù)"迪恩周期"進行定義。舉例而言，初始位置 靠近微通道內(nèi)而且在給定下游距離處迀移至通道外側(cè)壁的顆粒定義為完成1/2個迪恩周 期。而且，當(dāng)顆粒返回微通道內(nèi)側(cè)壁附近的原始位置時，則完成整個迪恩周期。因此，對于給 定的微通道長度，在流量(Re)增大的條件下，顆?？山?jīng)歷多個迪恩周期的迀移。一個完整迪 恩周期的迀移長度可計算為：
[0040] Ldc ~2w+h(m) (3)
[0041] 其中，W為微通道寬度(m)，h為微通道高度(m)。因此。迪恩迀移所需的微通道總長 度表示為：
[0042]
[0043] 應(yīng)當(dāng)理解的是，迪恩拖曳力的大小由斯托克斯定律給出：
[0044] FD = 33iyUDeanac(N) (5)
[0045] 其中，a。為細胞直徑(m)。
[0046] 除了迪恩拖曳力之外，直徑與微通道尺寸相當(dāng)?shù)妮^大細胞還承受較大的慣性升力 (凡）（由剪切和壁面兩者所致），該慣性升力使得所述細胞發(fā)生聚集并達到平衡。泊肅葉流 中的拋物線速度剖面產(chǎn)生剪切所致慣性升力F IL，該力作用于顆粒并使其具有從微通道中心 向通道壁移動的趨勢。當(dāng)這些顆粒移動至通道壁近處時，通道壁的突然出現(xiàn)打亂了形成于 顆粒周圍的旋轉(zhuǎn)尾流，從而產(chǎn)生使該顆粒具有從通道壁向微通道中心移動的趨勢的升力 (F?〇。在這兩種相反的升力作用下，顆粒沿微通道周邊平衡(聚集)于不同的可預(yù)測位置上。 當(dāng)顆粒大小與微通道尺寸相當(dāng)，即a c/h約0.1，上述效應(yīng)起主要作用。具體而言，所述慣性升 力(Fl)的大小如下式所示：
[0047]
[0048] 其中，α為升力系數(shù)，其為顆粒在通道截面內(nèi)位置的函數(shù)且平均值為0.5，G為流體 的剪切速率（Ι/s)。對于泊肅葉流，G的平均值表示為G = Umax/DH，其中，Umax為最大流速(m/ s)，且可近似為2XUf。相應(yīng)地，上式(6)中的慣性升力(Fl)則可重新表示為：
[0049]
[0050]在具有曲線幾何形狀的微通道中，所述慣性升力(Fl)與迪恩拖曳力(Fd)之間的相 互作用使得所述平衡位置減少至僅兩個靠近通道內(nèi)側(cè)壁的位置，這兩個位置分別位于頂部 和底部迪恩渦中。所述兩個平衡位置在微通道高度方向上彼此重疊，而且對于給定顆粒尺 寸，位于距微通道內(nèi)側(cè)壁相同距離處，即在微通道寬度方向上看，處于同一位置。
[0051] 利用迪恩迀移和慣性聚集這兩種現(xiàn)象，即可實現(xiàn)不同大小顆粒和細胞混合物的分 離。按照上述數(shù)學(xué)模型選擇微通道參數(shù)（即寬度、高度、長度、曲率半徑以及流量)大小，可保 證較大細胞/顆粒受慣性聚集影響，而較小細胞/顆粒(小于臨界尺寸)則不受此聚集效應(yīng)影 響。在入口處，所述細胞/顆?；旌衔锉幌拗朴谒鑫⑼ǖ纼?nèi)側(cè)壁近處，而且隨著這些細胞/ 顆粒向下游移動，較小顆粒在迪恩拖曳力的影響下迀移至通道截面的另半部分。另一方面， 大于臨界尺寸的細胞/顆粒因承受強大的慣性升力而仍然聚集于通道內(nèi)側(cè)壁附近。因此，在 出口處，可在小細胞出口處收集所述較小細胞/顆粒，而在大細胞出口處收集所述較大細 胞/顆粒，從而實現(xiàn)分離離析。如下式所示，所述臨界尺寸可由上述兩種力（即慣性升力(fl) 和迪恩拖曳力(Fd))的施力比進行估算：
[0052]
[0053] 其中，iF即為所述施力比，而其余參數(shù)可參考上式（1)、式(5)和式(6)中的定義。所 述流體密度(P)和流體粘度(μ)是指總密度和總粘度。我們可通過改變鞘液或樣本而對最終 的流體密度和粘度進行調(diào)節(jié)。根據(jù)所獲實驗數(shù)據(jù)，為實現(xiàn)顆粒/細胞的慣性聚集，i F的閾值 約為2。在iF小于2的試驗條件下，顆粒/細胞僅受迪恩拖曳力影響，因此隨迪恩流作環(huán)流運 動。也就是說，為了使顆粒/細胞發(fā)生慣性聚集，i F須大于或等于2(即iF2 2)。由此可見，所述 施力比iF為決定顆粒/細胞是否