一種用于豬?？谔阋咭呙绲碾p相納米乳佐劑及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種疫苗納米乳佐劑及其制備方法和用途，特別涉及一種用于豬?？?蹄疫疫苗的雙相納米乳佐劑及其制備方法和用途，本發(fā)明屬于獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 納米科技是20世紀(jì)80年代末期誕生并正在迅速崛起的新興邊緣學(xué)科，由于納米微 粒具有小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等特點(diǎn)，能產(chǎn)生許多不同 于常規(guī)物態(tài)所具有的新奇特性，顯示出非常廣闊的應(yīng)用前景。因此，應(yīng)用納米技術(shù)和材料開 發(fā)靶向、控釋藥物，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物制品學(xué)的研究熱點(diǎn)。近年來，納米材料在醫(yī)學(xué)免疫領(lǐng) 域，特別在疫苗佐劑方面受到了極大的重視，與傳統(tǒng)油佐劑、氫氧化鋁佐劑相比，納米化佐 劑與抗原物質(zhì)結(jié)合具有更大的結(jié)合表面積，可在同等體積下容納更多的抗原，并借助其在 水相中的均勻性，可使抗原更不易被降解破壞，提高了接種抗原的利用率。其次，由于納米 佐劑的均質(zhì)性優(yōu)于傳統(tǒng)佐劑，可將具有抗原遞呈能力的巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等集中在一 定區(qū)域，使包裹、吸附或結(jié)合有抗原表位的納米微粒更有效地被抗原遞呈細(xì)胞吞噬、加工、 遞呈，在短時間內(nèi)激活免疫應(yīng)答，顯著提高機(jī)體免疫反應(yīng)的水平。在副作用方面，因納米微 粒的利用率極高，使其使用劑量及其副作用顯著降低。更重要的是由于納米佐劑是將抗原 包裹于納米粒子內(nèi)部或吸附在其表面，或通過化學(xué)連接作用與納米粒子結(jié)合，從而可持久 地釋放被包裹的抗原，其控制釋放效果更為理想。
[0003] 我國在獸類疫苗生產(chǎn)佐劑使用方面，最常用的是礦物油佐劑蒙特耐得 (Montnanide) ISA 206，因?yàn)樗娜缦聝?yōu)越性:第一內(nèi)溶成分比較特殊，在與水相的混和乳 化中不需再添加其他乳化劑即可與水相結(jié)合成穩(wěn)定的乳劑;第二在油水相混和乳化過程中 對硬件設(shè)備要求較低。但隨著疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的不斷提高，其缺點(diǎn)不斷突顯，在動物體內(nèi)不能 被代謝，毒性較大，注射到動物體內(nèi)會在注射部位局部形成小結(jié)、肉芽腫，有些動物甚至?xí)?形成無菌性化膿性炎癥反應(yīng)，而且不能實(shí)現(xiàn)隔離、保護(hù)、控制釋放、靶向釋放等多種功能的 作用，因此本發(fā)明針對上述問題將納米科技和W/0/W技術(shù)相結(jié)合研制獲得一種新型佐劑，主 要目的是研究一種穩(wěn)定性良好、安全性高、成本低且易產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的新型納米乳佐劑來替 代傳統(tǒng)佐劑，為提高防控豬牛等家畜口蹄疫疾病的水平和效率提供新的技術(shù)手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 面對當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)特別是豬、牛等家畜口蹄疫疫病暴發(fā)和流行以及疫苗免疫持續(xù)期 短，過敏反應(yīng)等難以控制的嚴(yán)峻形勢，本發(fā)明提出了一種適用于豬?？谔阋咭呙绲男滦退?包油包水型(W/0/W)雙相納米乳佐劑，其具有安全性高、疫苗副作用小，抗原緩釋能力強(qiáng)等 特點(diǎn)，本發(fā)明的提出為提高防控豬牛等家畜口蹄疫疫病的水平和效率提供了新的技術(shù)手 段。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0006] 1、納米乳佐劑配方的篩選
[0007] 通過繪制偽三元相圖及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出空白納米乳配方。
[0008] 2、口蹄疫納米乳佐劑疫苗的制備
[0009] 在15~25°C條件下，按照篩選的空白納米乳配方，用該佐劑與口蹄疫滅活抗原乳 化配制疫苗。
[0010] 3、口蹄疫納米乳佐劑疫苗的質(zhì)量評價
[0011] (1)微觀形態(tài):在透射電鏡下觀察口蹄疫納米乳佐劑疫苗的微觀形態(tài)。
[0012] (2)粒徑分布:用激光粒度分析儀測定其平均粒徑及強(qiáng)度粒徑分布。
[0013] (3)黏度測定：
[0014] 方法一:取出lml玻璃吸管（下口內(nèi)徑為1.2mm，上口內(nèi)徑為2.7mm)，在25°C環(huán)境中 吸取納米乳劑lml，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需時間，測定三次，取平均值。
[0015]方法二:轉(zhuǎn)子型黏度計(jì)法:動力黏度n(Pas) = κ (Τ/ ω )，其中κ表示已知黏度的標(biāo)準(zhǔn) 液測得的旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)常數(shù)，Τ為扭力矩，ω為角速度。
[0016] (4)離心檢測：吸取口蹄疫納米乳佐劑疫苗10ml加入離心管中，以3000r/min離心 30min，觀察是否有水相析出及分層現(xiàn)象出現(xiàn)。
[0017] (5)穩(wěn)定性檢測：取3批制備好的□蹄疫納米乳佐劑疫苗分別在4°C放置1年、20°C 放置6個月、37°C放置1個月，觀察納米乳佐劑疫苗的外觀。
[0018] 4、安全性試驗(yàn)
[0019] 5、納米乳佐劑疫苗對小鼠的免疫效力試驗(yàn)
[0020] 6、納米乳佐劑疫苗對豬的免疫效力試驗(yàn) [0021] 7、納米乳佐劑疫苗對牛的免疫效力試驗(yàn) [0022] 8、該納米乳疫苗1000L體系的工藝放大
[0023]在上述研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明最終篩選得到了一種用于豬?？谔阋咭呙绲碾p相納 米乳佐劑，所述的雙相納米乳佐劑由表面活性劑、助表面活性劑以及油相組成；
[0024]其中，所述的表面活性劑選自TweenSO、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯雙油酸酯、 Span80中的一種或兩種以上的組合；
[0025]其中，所述的助表面活性劑選自聚丙醇、PEG 400或二者的組合；
[0026] 其中，所述的油相選自麥芽油、液體石蠟、花生油中的一種或兩種以上的組合；
[0027] 其中，所述的表面活性劑與助表面活性劑的質(zhì)量比為7:1-4,表面活性劑與助表面 活性劑的混合物與油相的質(zhì)量比為1 -1 〇: 〇. 1 -1 〇。
[0028]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的表面活性劑為TweenSO、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯雙 油酸酯以及SpanSO的混合物，其中TweenSO、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯雙油酸酯以及 Span80的質(zhì)量比為3:1-3:1:1;所述的助表面活性劑為聚丙醇以及PEG400的混合物，其中聚 丙醇以及PEG 400的質(zhì)量比為1:1;所述的油相為液體石蠟。
[0029] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的表面活性劑與助表面活性劑的質(zhì)量比為7:1-4,所述 的表面活性劑與助表面活性劑的混合物與油相的質(zhì)量比為3-5:5-7。
[0030] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的表面活性劑為TweenSO、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯雙 油酸酯以及SpanSO的混合物，其中TweenSO、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯雙油酸酯以及 Span80的質(zhì)量比為3: 2:1:1;所述的助表面活性劑為聚丙醇以及PEG 400的混合物，其中聚 丙醇以及PEG 400的質(zhì)量比為1:1;所述的油相為液體石蠟，其中，表面活性劑與助表面活性 劑的質(zhì)量比為7:1，表面活性劑和助表面活性劑混合物與油相的質(zhì)量比為4:6。
[0031] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的雙相納米乳佐劑在制備豬牛口蹄疫納米乳佐劑 疫苗中的用途。
[0032] 再進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種豬?？谔阋呒{米乳佐劑疫苗及其制備方法，所 述的納米乳佐劑疫苗含有本發(fā)明所述的雙相納米乳佐劑以及口蹄疫病毒抗原液，其由以下 步驟制備得到：
[0033] (1)將本發(fā)明任一項(xiàng)所述的雙相納米乳佐劑采用121°C高溫高壓滅菌30min，冷卻；
[0034] (2)在300-400rpm的轉(zhuǎn)速下，將口蹄疫病毒抗原液以10-20g/min的流速加入到步 驟(1)的佐劑中；
[0035] (3)15-25Γ下，乳化15-25min即得。
[0036] 其中，優(yōu)選的，口蹄疫病毒抗原液與雙相納米乳佐劑的質(zhì)量百分比分別為45%和 55%〇
[0037] 相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有