一種蔥屬植物鱗莖盤快速繁殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蔥屬植物鱗莖盤快速繁殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蔥屬植物在生產(chǎn)上多采用蘗生小鱗莖進(jìn)行繁殖，屬于無性繁殖。長期進(jìn)行無性繁 殖，導(dǎo)致一種病毒單獨(dú)感染或幾種病毒復(fù)合感染所引發(fā)的病毒病十分嚴(yán)重。植株感病后，生 長勢弱，植株矮小，分蘗減少，植株因退化變小，致使產(chǎn)量和品質(zhì)大幅度降低，給生產(chǎn)消費(fèi)和 出口創(chuàng)匯帶來了嚴(yán)重的障礙。蔥屬植物脫毒技術(shù)大多采用莖尖培養(yǎng)，取得了良好的效果，但 繁殖率不高，很難用于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0003] 分蘗洋蔥屬于百合科蔥屬植物，有保健食品的美稱，是目前所知唯一含有前列腺 素 A的植物。這種物質(zhì)是一種較強(qiáng)的血管擴(kuò)張劑，能舒張血管，降低血液的粘度，增加冠狀 動(dòng)脈血流量，還具有降低和預(yù)防血栓形成的作用，并可對抗體內(nèi)兒茶酚胺的升壓作用，從而 穩(wěn)定血壓。但是，分蘗洋蔥極少抽薹開花結(jié)實(shí)，在生產(chǎn)上只能用蘗生小鱗莖進(jìn)行繁殖，繁殖 系數(shù)較低，而且其鱗莖屬于短縮莖，快速繁育體系的建立存在一定的困難。目前關(guān)于分蘗洋 蔥快繁的相關(guān)報(bào)道并不多見，徐啟江剝?nèi)?.3 - 0.5_莖尖進(jìn)行誘導(dǎo)，再經(jīng)啟動(dòng)培養(yǎng)、生根 培養(yǎng)即可獲得分蘗洋蔥莖尖脫毒苗。姜玉東認(rèn)為多效唑具有很強(qiáng)的促進(jìn)試管鱗莖形成的作 用。陳典和徐啟江以分蘗洋蔥莖尖為外植體經(jīng)不同發(fā)生途徑獲得再生植株，其中，以分蘗洋 蔥莖尖為外植體經(jīng)啟始培養(yǎng)培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基中，獲得試管苗。王勇、劉照坤、相元 萍等均嘗試通過愈傷組織誘導(dǎo)及再分化途徑獲得分蘗洋蔥再生植株，但分化率不高，且通 過愈傷組織培養(yǎng)很容易產(chǎn)生變異，難以實(shí)現(xiàn)分蘗洋蔥的工廠化生產(chǎn)。
[0004] 茗蔥，又名寒蔥，為百合科蔥屬植物，多年生草本。近年來，國內(nèi)外許多學(xué)者從茗蔥 中分離出許多化學(xué)成分，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證了其中一些化學(xué)成分對預(yù)防血栓、動(dòng)脈硬化、腦梗塞有 良好的作用效果。并且，由于茗蔥蔥香味濃，略帶爽口野味，口感極佳。但是，目前我國關(guān)于 茗蔥的引種馴化還鮮有報(bào)道。茗蔥的繁殖較難，同大多數(shù)蔥屬植物相同，其繁殖方式也可分 為有性繁殖與無性繁殖。研究表明，用鱗莖種植要比用種子繁殖好，因?yàn)橛梅N子繁殖需要 3-5年才能成熟，并且種子的生命活力降低很快，發(fā)芽困難、發(fā)芽率較低，而用鱗莖繁殖可以 提高鱗莖產(chǎn)量。目前國外學(xué)者提出了用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行繁殖，并且研究得較為深入，但 因其費(fèi)用較高，還不能在生產(chǎn)上大量應(yīng)用。因此，如何短時(shí)間內(nèi)快速大量繁殖茗蔥成為茗蔥 產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。
[0005] 大蒜為百合科蔥屬多年生草本植物，大田種植的大蒜為無性繁殖作物，只能通過 分瓣或形成氣生鱗莖的方法進(jìn)行繁殖。長期進(jìn)行無性繁殖，會(huì)使感染病毒的大蒜不斷積累 病毒且傳遞給后代，使大蒜的品質(zhì)和產(chǎn)量下降，難以滿足外商對出口大蒜的品質(zhì)及規(guī)格要 求。同時(shí)因種蒜感染病毒，大蒜一般減廣30% -60%，極大地影響了農(nóng)民的收入。因此，需要 定期對大蒜進(jìn)行脫毒復(fù)壯才能保證產(chǎn)量。但是，大蒜在大田生產(chǎn)中是利用分瓣方法進(jìn)行增 殖的，這就導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室脫毒后的大蒜在大田中一年內(nèi)只能增殖幾倍或者十幾倍，繁殖系數(shù) 較低，并且在繁殖中容易再度侵染大蒜病毒。目前，對如何快速的獲得大量的脫毒試管苗， 增加脫毒大蒜繁殖系數(shù)，縮短生產(chǎn)周期，降低脫毒大蒜種苗生產(chǎn)成本等方面，進(jìn)行更為詳細(xì) 的研究，是推動(dòng)大蒜脫毒生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。
[0006] 植物組織培養(yǎng)技術(shù)是以植物生理學(xué)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的一門新興技術(shù)，是指在無菌 條件下，將離體的植物器官、組織、細(xì)胞、原生質(zhì)體在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的條件 進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織或不定芽等，或者長成完整植株的過程。該技術(shù)自20世紀(jì)初 建立以來，在理論研究和應(yīng)用技術(shù)上不斷發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于植物的快速繁殖、品種改良、 基因工程育種、種質(zhì)資源保存、次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)等方面，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效 益，對現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域產(chǎn)生了深刻影響。蔥屬植物的組培快繁能夠?qū)崿F(xiàn)蔥屬植物在 短時(shí)間內(nèi)的快速增殖，但是增殖率的高低一直是決定蔥屬植物能否通過組培快繁途徑進(jìn)行 工廠化生產(chǎn)的瓶頸，因此發(fā)明一種蔥屬植物快速繁殖的方法是解決上述問題的有效途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了解決蔥屬植物組培快繁增殖率不高，難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的 問題，而提供一種蔥屬植物鱗莖盤快速繁殖方法。
[0008] 蔥屬植物鱗莖盤快速繁殖方法，它包括： 1) 取蔥屬植物鱗莖，去除蔥屬植物須根，剝除外層鱗片，保留以中心生長點(diǎn)為中心，直 徑為0. 4-lcm的鱗莖盤及其上部包裹的鱗片，獲得蔥屬植物的中心部位；清洗、消毒； 2) 在中心部位距底端3 - 5mm處橫切并去除上部鱗片，沿主生長點(diǎn)垂直切線縱向分割 成4份，去除主生長點(diǎn)及主生長點(diǎn)所在的鱗莖盤，接種于PH 5. 8, MS+6-BA 0. 1-2. Omg/L、 NAA 0. 05-1. Omg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)叢生芽； 3) 繼續(xù)培養(yǎng)成苗； 所述的，MS+6-BA 0· 1-lmg/L、NAA 0· 05-0. 10mg/L ; 所述的清洗、消毒為流水沖洗〇. 5 h，用75%酒精浸泡消毒I min后，再用I % NaClO溶 液浸泡消毒15- 20 min，無菌水沖洗3- 5次以清除殘余的NaCIO,用濾紙吸干水分； 所述的蔥屬植物鱗莖盤為實(shí)驗(yàn)室試管微鱗莖盤； 所述的試管苗結(jié)球的誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為6周； 所述的切割成4份，是以主生長點(diǎn)兩條垂直的切線為切口，縱向進(jìn)行切割，切成4份，其 中只有一個(gè)1/4份切塊帶有主生長點(diǎn)鱗莖盤，剝掉主生長點(diǎn)及主生長點(diǎn)所在的鱗莖盤； 所述的1/4份鱗莖盤上部的鱗片基部再進(jìn)行切割，至遠(yuǎn)主生長點(diǎn)端高，近主生長點(diǎn)端 低的斜面。
[0009] 本發(fā)明提供了一種蔥屬植物鱗莖盤快速繁殖方法，將蔥屬植物中心部位清洗、消 毒，在中心部位距底端3 - 5mm處橫切后去除上部鱗片，沿主生長點(diǎn)垂直切線縱向分割成4 份，去除主生長點(diǎn)及主生長點(diǎn)所在的鱗莖盤，誘導(dǎo)叢生芽，并培養(yǎng)成苗。通過上述培養(yǎng)過程 的優(yōu)化建立了蔥屬植物鱗莖盤快速繁殖體系，獲得了大量的脫毒試管苗，該體系增殖時(shí)間 短，增殖系數(shù)大，遺傳穩(wěn)定性高，通過該體系能夠?qū)崿F(xiàn)蔥屬植物的快速繁育。可以為蔥屬植 物脫毒種苗的工廠化生產(chǎn)提供低價(jià)格成本、低時(shí)間成本的有力保障，促進(jìn)蔥屬植物產(chǎn)業(yè)的 發(fā)展。
【附圖說明】
[0010] 圖1不同激素組合對分蘗洋蔥莖尖增殖的影響（a :分蘗洋蔥莖尖；b :莖尖在 6-BA、NAA組合中的增殖情況；c :莖尖在6-BA、IAA中的增殖情況）； 圖2分蘗洋蔥鱗莖盤的獲得； 圖3分蘗洋蔥試管微鱗莖盤切割步驟流程； 圖4分蘗洋蔥試管微鱗莖盤切割步驟流程示意圖； 圖5分蘗洋蔥試管鱗莖盤增殖（a :分蘗洋蔥試管微鱗莖盤；b :第2周顯微鏡下觀察到 的增殖情況；c :第3周叢生芽增殖、生長情況；d :第4周叢生芽增殖、生長情況）； 圖6分蘗洋蔥試管苗壯苗培養(yǎng)（a :分蘗洋蔥試管增殖叢生苗；b :單株分蘗洋蔥試管 苗；c :壯苗培養(yǎng)后的試管苗）； 圖7茗蔥中心部位的獲得； 圖8茗蔥鱗莖盤的獲得； 圖9茗蔥鱗莖盤增殖苗的獲得； 圖10茗蔥增殖苗生根； 圖11大蒜鱗莖盤的獲得； 圖12大蒜鱗莖盤接種； 圖13.大蒜鱗莖盤增殖。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 實(shí)施例1分蘗洋蔥莖尖增殖 將分蘗洋蔥莖尖分別接種于不同濃度的6-BA、NAA組合，6-BA、IAA組合培養(yǎng)基中（表 1 )，兩種激素組合均能夠獲得分蘗洋蔥試管增殖苗，但相同濃度的IAA和NAA在進(jìn)行增殖誘 導(dǎo)時(shí)，差異很大。其中在6-BA、NAA激素組合中誘導(dǎo)的增殖苗長勢較好，且分化系數(shù)較高，在 培養(yǎng)4周時(shí)，平均增殖系數(shù)可達(dá)3. 87 ;6-BA、IAA激素組合雖然也能夠?qū)崿F(xiàn)莖尖增殖，但所獲 得的增殖苗細(xì)、弱，分化系數(shù)低，且有白化苗出現(xiàn)(如圖1)?？梢姡琁AA的作用效果不如NAA。 因此確定MS+6-BA0. 3mg/L+NAA0. lmg/L培養(yǎng)基為莖尖增殖最佳培養(yǎng)基。
[0012]
注：MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0013] 實(shí)施例2分蘗洋蔥鱗莖盤增殖 取分蘗洋蔥一枚，去除分蘗洋蔥鱗莖盤木栓化的部位，保留以中心生長點(diǎn)為中心，直徑 為0. 4-lcm的鱗莖盤及其上部包裹的鱗莖，得到分蘗洋蔥中心部位。將分蘗洋蔥中心部位 用流水沖洗0. 5 h，用75%酒精浸泡消毒I min后，隨后用1% NaClO溶液浸泡消毒15-20 min，無菌水沖洗3-5次以清除殘余的NaCIO,用濾紙吸干水分備用（如圖2)。
[0014] 然后去除上部鱗莖，保留包含主生長點(diǎn)在內(nèi)的鱗莖盤，將鱗莖盤切割成4份后去 除主生長點(diǎn)及主生長點(diǎn)鱗莖盤，分別接種于以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加6-BA (0. 2-0. 8 mg/ L)、NAA (0. 1-2. Omg/L)，PH調(diào)節(jié)至5. 8的增值培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)叢生芽。在25°C、光照 時(shí)間為16h、光照強(qiáng)度為25001ux條件下，經(jīng)過4周的誘導(dǎo)，以6-BA、NAA組合誘導(dǎo)效果最好； 6-BA、IAA組合也能誘導(dǎo)出叢生芽，但增殖系數(shù)低，再生苗存在畸形苗。其中鱗莖盤在添加 6-BAO. 6mg/L、NAAO. lmg/L的培養(yǎng)基中，4周后，分化數(shù)達(dá)到最大值，每個(gè)鱗莖盤最大增殖系 數(shù)(增殖系數(shù)=分化芽總數(shù)/接種數(shù))可達(dá)20 (見表2)。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，鱗莖盤分化 數(shù)增加，但在誘導(dǎo)第4周后鱗莖盤分化數(shù)不再增加，鱗莖盤的分化率達(dá)最大值(見表3)。
[0015]
注：MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
注：MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0017] 實(shí)施例3分蘗洋蔥脫毒苗試管結(jié)球 取分蘗洋蔥莖尖部位，流水沖洗半小時(shí)，用75%酒精浸泡消毒Imin后，隨后用1% NaClO溶液浸泡消毒15-20min，無菌水沖洗3-5次以清除殘余的NaCIO,用濾紙吸干水分 備用，顯微鏡下剝離分蘗洋蔥莖尖生長點(diǎn)〈0. 3mm部分，在以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加6-BA、 IAA的啟動(dòng)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)成苗。
[0018] 莖尖成苗后，分別以蔗糖為基礎(chǔ)碳源設(shè)置30mg/L、45mg/L、60mg/L、75mg/L、90mg/ L共5個(gè)碳源糖濃度，探討不同糖濃度對分蘗洋蔥試管苗結(jié)球的影響，篩選最佳結(jié)球培養(yǎng)基 中糖濃度，通過培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，隨著糖濃度的增加鱗莖結(jié)球直徑、鮮重增加。當(dāng)糖濃度高于75 mg/L時(shí)，結(jié)球速度加快但影響根的生長，導(dǎo)致最終鱗莖平均直徑、鮮重降低(見表4)。<