04/cm2的細胞密度接種，培養(yǎng)至P2代。
[0036]步驟二:將P2代骨髓間充質干細胞團在次聲波振蕩條件下加入本實施例的保護劑，繼續(xù)在次聲波(頻率為8~13Hz)條件下振蕩30~45s，加入玻璃化液； 步驟三:將步驟二中制得的混合液在真空狀態(tài)下，直接投入液氮中，按照平均600°C /min的降溫速率迅速降溫至_196°C ;
步驟四:存入液氮罐中保存24h ;
步驟五:將凍存液從液氮中取出，投入LNG中升溫lmin ;
步驟六:將凍存液從LNG中取出，在真空狀態(tài)下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升溫速率迅速降溫至3.2-3.9°C ；
步驟七:將凍存液倒入0.9%的鹽水中，維持溫度在3.2-3.9°C的條件下，在次聲波(頻率為8~13Hz)振蕩條件下加入20%的人血清白蛋白，0.8%~1%的單糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β -巰基乙醇，調節(jié)體系的pH為6.8-7.6，加入1.5%的羥乙基哌嗪乙硫磺酸，繼續(xù)在次聲波條件下振蕩30~45s ;
步驟八:將稀釋后的凍存液在400r/min的條件下離心5min，去除上清液，向細胞沉淀中加入0.21%~0.23%的細胞生長因子，重新懸浮細胞。
[0037]測定細胞的復蘇率:將3X 105個復蘇凍存干細胞連續(xù)培養(yǎng)6天，用血球計數板計算出培養(yǎng)后的細胞總數，根據公式:復蘇率=培養(yǎng)后細胞總數+ (3X105X增值率)，得到凍存細胞的復蘇率；同時將3 X 105個P2代干細胞連續(xù)培養(yǎng)6天，用血球計數板計算出培養(yǎng)后的細胞總數，根據公式:增值率=培養(yǎng)后細胞總數+ (3X 105)。
[0038]實驗結果:測得復蘇率為96.8%
實施例3
一種用于玻璃化凍存骨髓間充質干細胞的凍存保護劑，包括8.3%的滲透性保護液，0.9%的單糖，20%的人血清白蛋白，2.2%的Rho抑制劑，其余組分為生理鹽水，Rho抑制劑為羥基法蘇地爾。
[0039]實驗凍存材料:動物，2歲齡比格犬，雄性，體重為22.7kg。
[0040]實驗方法:
步驟一:抽取骨髓，提純分離出單個核細胞，將原代細胞接種培養(yǎng)48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2.16g/L的β -磷酸甘油鈉和37.5mg/L的2-磷酸抗壞血酸的培養(yǎng)液中，5%C02的培養(yǎng)箱中，37°C的溫度下培養(yǎng)8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培養(yǎng)液進行第1次傳代；以1.6X 104/cm2的細胞密度接種，培養(yǎng)至P2代。
[0041]步驟二:將P2代骨髓間充質干細胞團在次聲波振蕩條件下加入本實施例的保護劑，繼續(xù)在次聲波(頻率為8~13Hz)條件下振蕩30~45s，加入玻璃化液；
步驟三:將步驟二中制得的混合液在真空狀態(tài)下，直接投入液氮中，按照平均600°C /min的降溫速率迅速降溫至_196°C ;
步驟四:存入液氮罐中保存24h ;
步驟五:將凍存液從液氮中取出，投入LNG中升溫lmin ;
步驟六:將凍存液從LNG中取出，在真空狀態(tài)下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升溫速率迅速降溫至3.2-3.9°C ；
步驟七:將凍存液倒入0.9%的鹽水中，維持溫度在3.2-3.9°C的條件下，在次聲波(頻率為8~13Hz)振蕩條件下加入20%的人血清白蛋白，0.8%~1%的單糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β -巰基乙醇，調節(jié)體系的pH為6.8-7.6，加入1.5%的羥乙基哌嗪乙硫磺酸，繼續(xù)在次聲波條件下振蕩30~45s ; 步驟八:將稀釋后的凍存液在400r/min的條件下離心5min，去除上清液，向細胞沉淀中加入0.21%~0.23%的細胞生長因子，重新懸浮細胞。
[0042]測定細胞的復蘇率:將3X 105個復蘇凍存干細胞連續(xù)培養(yǎng)6天，用血球計數板計算出培養(yǎng)后的細胞總數，根據公式:復蘇率=培養(yǎng)后細胞總數+ (3X105X增值率)，得到凍存細胞的復蘇率；同時將3 X 105個P2代干細胞連續(xù)培養(yǎng)6天，用血球計數板計算出培養(yǎng)后的細胞總數，根據公式:增值率=培養(yǎng)后細胞總數+ (3X 105)。
[0043]實驗結果:測得復蘇率為97.1%
實施例4
一種用于玻璃化凍存骨髓間充質干細胞的凍存保護劑，包括8.5%的滲透性保護液，1%的單糖，20%的人血清白蛋白，2.1%的Rho抑制劑，其余組分為生理鹽水，Rho抑制劑為Y-27632、法蘇地爾和羥基法蘇地爾1:1:1的混合物。
[0044]實驗凍存材料:動物，2歲齡比格犬，雄性，體重為22.7kg。
[0045]實驗方法:
步驟一:抽取骨髓，提純分離出單個核細胞，將原代細胞接種培養(yǎng)48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2.16g/L的β -磷酸甘油鈉和37.5mg/L的2-磷酸抗壞血酸的培養(yǎng)液中，5%C02的培養(yǎng)箱中，37°C的溫度下培養(yǎng)8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培養(yǎng)液進行第1次傳代；以1.6X 104/cm2的細胞密度接種，培養(yǎng)至P2代。
[0046]步驟二:將P2代骨髓間充質干細胞團在次聲波振蕩條件下加入本實施例的保護劑，繼續(xù)在次聲波(頻率為8~13Hz)條件下振蕩30~45s，加入玻璃化液；
步驟三:將步驟二中制得的混合液在真空狀態(tài)下，直接投入液氮中，按照平均600°C /min的降溫速率迅速降溫至_196°C ;
步驟四:存入液氮罐中保存24h ;
步驟五:將凍存液從液氮中取出，投入LNG中升溫lmin ;
步驟六:將凍存液從LNG中取出，在真空狀態(tài)下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升溫速率迅速降溫至3.2-3.9°C ；
步驟七:將凍存液倒入0.9%的鹽水中，維持溫度在3.2-3.9°C的條件下，在次聲波(頻率為8~13Hz)振蕩條件下加入20%的人血清白蛋白，0.8%~1%的單糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β -巰基乙醇，調節(jié)體系的pH為6.8-7.6，加入1.5%的羥乙基哌嗪乙硫磺酸，繼續(xù)在次聲波條件下振蕩30~45s ;
步驟八:將稀釋后的凍存液在400r/min的條件下離心5min，去除上清液，向細胞沉淀中加入0.21%~0.23%的細胞生長因子，重新懸浮細胞。
[0047]測定細胞的復蘇率:將3X 105個復蘇凍存干細胞連續(xù)培養(yǎng)6天，用血球計數板計算出培養(yǎng)后的細胞總數，根據公式:復蘇率=培養(yǎng)后細胞總數+ (3X105X增值率)，得到凍存細胞的復蘇率；同時將3 X 105個P2代干細胞連續(xù)培養(yǎng)6天，用血球計數板計算出培養(yǎng)后的細胞總數，根據公式:增值率=培養(yǎng)后細胞總數+ (3X 105)。
[0048]實驗結果:測得復蘇率為97.4%
實施例5
一種用于玻璃化凍存骨髓間充質干細胞的凍存保護劑，包括8.4%的滲透性保護液，0.9%的單糖，20%的人血清白蛋白，2.3%的Rho抑制劑，其余組分為生理鹽水，Rho抑制劑為Y-27632和羥基法蘇地爾2:1的混合物。
[0049]實驗凍存材料:動物，2歲齡比格犬，雄性，體重為22.7kg。
[0050]實驗方法:
步驟一:抽取骨髓，提純分離出單個核細胞，將原代細胞接種培養(yǎng)48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2.16g/L的β -磷酸甘油鈉和37.5mg/L的2-磷酸抗壞血酸的培養(yǎng)液中，5%C02的培養(yǎng)箱中，37°C的溫度下培養(yǎng)8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培養(yǎng)液進行第1次傳代；以1.6X 104/cm2的細胞密度接種，培養(yǎng)至P2代。
[0051]步驟二:將P2代骨髓間充質干細胞團在次聲波振蕩條件下加入本實施例的保護劑，繼續(xù)在次聲波(頻率為8~13Hz)條件下振蕩30~45s，加入玻璃化液；
步驟三:將步驟二中制得的混合液在真空狀態(tài)下，直接投入液氮中，按照平均600°C /min的降溫速率迅速降溫至_196°C ;
步驟四:存入液氮罐中保存24h ;
步驟五:將凍存液從液氮中取出，投入LNG中升溫lmin ;
步驟六:將凍存液從LNG中取出，在真空狀態(tài)下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升溫速率迅速降溫至3.2-3.9°C ；
步驟七:將凍存液倒入0.9%的鹽水中，維持溫度在3.2-3.9°C的條件下，在次聲波(頻率為8~13Hz)振蕩條件下加入20%的人血清白