蛋白，0.8%~1%的單糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β -巰基乙醇，調(diào)節(jié)體系的pH為6.8-7.6，加入1.5%的羥乙基哌嗪乙硫磺酸，繼續(xù)在次聲波條件下振蕩30~45s ;
步驟八:將稀釋后的凍存液在400r/min的條件下離心5min，去除上清液，向細(xì)胞沉淀中加入0.21%~0.23%的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，重新懸浮細(xì)胞。
[0052]測(cè)定細(xì)胞的復(fù)蘇率:將3X 105個(gè)復(fù)蘇凍存干細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)6天，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算出培養(yǎng)后的細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)公式:復(fù)蘇率=培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)+ (3X105X增值率)，得到凍存細(xì)胞的復(fù)蘇率；同時(shí)將3 X 105個(gè)P2代干細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)6天，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算出培養(yǎng)后的細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)公式:增值率=培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)+ (3X 105)。
[0053]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:測(cè)得復(fù)蘇率為96.6%
實(shí)施例6
一種用于玻璃化凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)劑，包括3.4%的DMS0，5.2%的聚乙二醇，0.3%的葡萄糖，0.5%的果糖，20%的人血清白蛋白，2.1%的Rho抑制劑，0.6%的NaCl和67.9%的去離子水，Rho抑制劑為Y-27632、法蘇地爾和羥基法蘇地爾1:1:1的混合物。
[0054]實(shí)驗(yàn)凍存材料:動(dòng)物，2歲齡比格犬，雄性，體重為22.7kg。
[0055]實(shí)驗(yàn)方法:
步驟一:抽取骨髓，提純分離出單個(gè)核細(xì)胞，將原代細(xì)胞接種培養(yǎng)48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2.16g/L的β -磷酸甘油鈉和37.5mg/L的2-磷酸抗壞血酸的培養(yǎng)液中，5%C02的培養(yǎng)箱中，37°C的溫度下培養(yǎng)8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培養(yǎng)液進(jìn)行第1次傳代；以1.6X 104/cm2的細(xì)胞密度接種，培養(yǎng)至P2代。
[0056]步驟二:將P2代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)在次聲波振蕩條件下加入本實(shí)施例的保護(hù)劑，繼續(xù)在次聲波(頻率為8~13Hz)條件下振蕩30~45s，加入玻璃化液；
步驟三:將步驟二中制得的混合液在真空狀態(tài)下，直接投入液氮中，按照平均600°C /min的降溫速率迅速降溫至_196°C ;
步驟四:存入液氮罐中保存24h ;
步驟五:將凍存液從液氮中取出，投入LNG中升溫lmin ;
步驟六:將凍存液從LNG中取出，在真空狀態(tài)下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升溫速率迅速降溫至3.2-3.9°C ；
步驟七:將凍存液倒入0.9%的鹽水中，維持溫度在3.2-3.9°C的條件下，在次聲波(頻率為8~13Hz)振蕩條件下加入20%的人血清白蛋白，0.8%~1%的單糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β -巰基乙醇，調(diào)節(jié)體系的pH為6.8-7.6，加入1.5%的羥乙基哌嗪乙硫磺酸，繼續(xù)在次聲波條件下振蕩30~45s ;
步驟八:將稀釋后的凍存液在400r/min的條件下離心5min，去除上清液，向細(xì)胞沉淀中加入0.21%~0.23%的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，重新懸浮細(xì)胞。
[0057]測(cè)定細(xì)胞的復(fù)蘇率:將3X 105個(gè)復(fù)蘇凍存干細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)6天，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算出培養(yǎng)后的細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)公式:復(fù)蘇率=培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)+ (3X105X增值率)，得到凍存細(xì)胞的復(fù)蘇率；同時(shí)將3 X 105個(gè)P2代干細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)6天，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算出培養(yǎng)后的細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)公式:增值率=培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)+ (3X 105)。
[0058]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:測(cè)得復(fù)蘇率為97.6%
實(shí)施例7
一種用于玻璃化凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)劑，包括3.2%的DMS0，5%的聚乙二醇，0.5%的葡萄糖，0.7%的果糖，20%的人血清白蛋白，2.3%的Rho抑制劑，0.6%的NaCl和67.9%的去離子水，DMS0的濃度為0.34g/mL，聚乙二醇的濃度為0.53g/mL，Rho抑制劑為Y-27632。
[0059]實(shí)驗(yàn)凍存材料:動(dòng)物，2歲齡比格犬，雄性，體重為22.7kg。
[0060]實(shí)驗(yàn)方法:
步驟一:抽取骨髓，提純分離出單個(gè)核細(xì)胞，將原代細(xì)胞接種培養(yǎng)48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2.16g/L的β -磷酸甘油鈉和37.5mg/L的2-磷酸抗壞血酸的培養(yǎng)液中，5%C02的培養(yǎng)箱中，37°C的溫度下培養(yǎng)8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培養(yǎng)液進(jìn)行第1次傳代；以1.6X 104/cm2的細(xì)胞密度接種，培養(yǎng)至P2代。
[0061]步驟二:將P2代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)在次聲波振蕩條件下加入本實(shí)施例的保護(hù)劑，繼續(xù)在次聲波(頻率為8~13Hz)條件下振蕩30~45s，加入玻璃化液；
步驟三:將步驟二中制得的混合液在真空狀態(tài)下，直接投入液氮中，按照平均600°C /min的降溫速率迅速降溫至_196°C ;
步驟四:存入液氮罐中保存24h ;
步驟五:將凍存液從液氮中取出，投入LNG中升溫lmin ;
步驟六:將凍存液從LNG中取出，在真空狀態(tài)下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升溫速率迅速降溫至3.2-3.9°C ；
步驟七:將凍存液倒入0.9%的鹽水中，維持溫度在3.2-3.9°C的條件下，在次聲波(頻率為8~13Hz)振蕩條件下加入20%的人血清白蛋白，0.8%~1%的單糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β -巰基乙醇，調(diào)節(jié)體系的pH為6.8-7.6，加入1.5%的羥乙基哌嗪乙硫磺酸，繼續(xù)在次聲波條件下振蕩30~45s ; 步驟八:將稀釋后的凍存液在400r/min的條件下離心5min，去除上清液，向細(xì)胞沉淀中加入0.21%~0.23%的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，重新懸浮細(xì)胞。
[0062]測(cè)定細(xì)胞的復(fù)蘇率:將3X 105個(gè)復(fù)蘇凍存干細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)6天，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算出培養(yǎng)后的細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)公式:復(fù)蘇率=培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)+ (3X105X增值率)，得到凍存細(xì)胞的復(fù)蘇率；同時(shí)將3 X 105個(gè)P2代干細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)6天，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算出培養(yǎng)后的細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)公式:增值率=培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)+ (3X 105)。
[0063]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:測(cè)得復(fù)蘇率為96.9%
實(shí)施例8
一種用于玻璃化凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存保護(hù)劑，包括8.4%的滲透性保護(hù)液，0.35%的葡萄糖，0.55%的果糖，20%的人血清白蛋白，2.2%的Rho抑制劑，0.6%的NaCl和67.9%的去離子水，DMS0的濃度為0.35g/mL，聚乙二醇的濃度為0.54g/mL，Rho抑制劑為法蘇地爾和羥基法蘇地爾的混合溶液。
[0064]實(shí)驗(yàn)凍存材料:動(dòng)物，2歲齡比格犬，雄性，體重為22.7kg。
[0065]實(shí)驗(yàn)方法:
步驟一:抽取骨髓，提純分離出單個(gè)核細(xì)胞，將原代細(xì)胞接種培養(yǎng)48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2.16g/L的β -磷酸甘油鈉和37.5mg/L的2-磷酸抗壞血酸的培養(yǎng)液中，5%C02的培養(yǎng)箱中，37°C的溫度下培養(yǎng)8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培養(yǎng)液進(jìn)行第1次傳代；以1.6X 104/cm2的細(xì)胞密度接種，培養(yǎng)至P2代。
[0066]步驟二:將P2代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)在次聲波振蕩條件下加入本實(shí)施例的保護(hù)劑，繼續(xù)在次聲波(頻率為8~13Hz)條件下振蕩30~45s，加入玻璃化液；
步驟三:將步驟二中制得的混合液在真空狀態(tài)下，直接投入液氮中，按照平均600°C /min的降溫速率迅速降溫至_196°C ;
步驟四:存入液氮罐中保存24h ;
步驟五:將凍存液從液氮中取出，投入LNG中升溫lmin ;
步驟六:將凍存液從LNG中取出，在真空狀態(tài)下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升溫速率迅速降溫至3.2-3.9°C ；
步驟七:將凍存液倒入0.9%的鹽水中，維持溫度在3.2-3.9°C的條件下，在次聲波(頻率為8~13Hz)振蕩條件下加入20%的人血清白蛋白，0.8%~1%的單糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β -巰基乙醇，調(diào)節(jié)體系的pH為6.8-7.6，加入1.5%的羥乙基哌嗪乙硫磺酸，繼續(xù)在次聲波條件下振蕩30~45s ;
步驟八:將稀釋后的凍存液在400r/min的條件下離心5min，去除上清液，向細(xì)胞沉淀中加入0.21%~0.23%的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，重新懸浮細(xì)胞。
[0067]測(cè)定細(xì)胞的復(fù)蘇率:將3X 105個(gè)復(fù)蘇凍存干細(xì)