一種腸道病毒的小分子化合物抑制劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種腸道病毒的小分子化合物 抑制劑及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸道病毒，顆粒小，呈20面體，直徑24~30nm，不含類脂體，核心有單鏈核糖核 酸，耐乙醚和其它脂溶劑，耐酸，對(duì)各種抗生素、抗病毒藥、去污劑有抵抗作用。多數(shù)病毒 在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生細(xì)胞病變。屬于小RNA病毒科，為裸露病毒，不同腸道病毒可引起相同的 癥狀，同一種病毒可引起不同臨床表現(xiàn)。腸道病毒多見隱性感染，可引起輕微上感、腹部不 適和腹瀉等癥狀。偶爾侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起弛緩型麻痹。
[0003] 腸道病毒71型（EV71)和柯薩奇病毒A16(CVA16)是引起亞太地區(qū)嬰幼兒手足口 病的主要病原體。從2008年1月到2013年12月間，僅中國大陸地區(qū)就有九百多萬的兒童 被確診為手足口病，并有2700多的死亡病例。手足口病的常見癥狀包括發(fā)熱，局部出疹等， 但也有些病人會(huì)發(fā)展成中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)疾病，如無菌性腦膜炎，致死性腦炎。EV71是 引起重癥手足口病的主要病原體（Huangetal.，1999;Komatsuetal.，1999;McMinnet al.，2001)。手足口病目前仍然是非常嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題，但迄今為止尚無有效的預(yù)防措 施及治療方法，因此尋找抗病毒藥物迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種腸道病毒的小分子化合物抑制劑及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的第一方面，提供了伊曲康唑、和/或伊曲康唑類似物或其藥學(xué)上可接受 的鹽在制備試劑或藥物中的用途，所述試劑或藥物用于
[0006] ⑴抑制RNA的合成；和/或
[0007] (ii)抑制病毒的生長或繁殖；和/或
[0008] (iii)抑制病毒的3A蛋白的活性。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述RNA選自：病毒RNA、原核細(xì)胞RNA和真核細(xì)胞RNA。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述病毒為RNA病毒，優(yōu)選地，所述RNA病毒為腸道病毒。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述藥物還用于治療或預(yù)防腸道病毒感染引起的疾病。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述腸道病毒感染引起的疾病包括但不限于由腸道病毒感染引 起的：手足口病、無菌性腦膜炎、腦膜炎、脊髓灰質(zhì)炎、急性呼吸道疾病、急性心肌炎、新生兒 多器官衰竭和急性弛緩性麻痹。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述伊曲康唑類似物選自下組：泊沙康唑、美國專利申請(qǐng)公開號(hào) US4267179A中描述的伊曲康唑類似物。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述伊曲康唑的結(jié)構(gòu)如式I所示，
[0015]
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述泊沙康唑的結(jié)構(gòu)如式II所示，
[0017]
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述腸道病毒包括：人腸道病毒A、人腸道病毒B、人腸道病毒C、 和/或人腸道病毒D。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述新型腸道病毒包括：人腸道病毒EV71型、CVA16型、CVB3型、 PV1型或EV68型。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述藥物包括口服制劑。
[0021] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種腸道病毒的抑制劑，所述抑制劑通過抑制腸道病 毒的RNA合成和/或通過抑制病毒3A蛋白的活性來抑制所述腸道病毒的生長或繁殖；優(yōu)選 地，所述抑制劑選自下組中的一種或多種：
[0022] (1)伊曲康唑；和/或
[0023] (2)伊曲康唑類似物。
[0024] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物含有本發(fā)明第二 方面所述的抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物的劑型選自下組：口服制劑。
[0026] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種體外非治療性地抑制腸道病毒生長或者殺滅腸道 病毒的方法，包括步驟：在需要處理的場所施用本發(fā)明第二方面所述的抑制劑或其藥學(xué)上 可接受的鹽。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述方法中，所述伊曲康唑或伊曲康唑類似物的施用濃度為 彡ΙμΜ，優(yōu)選地，彡ΙΟμΜ;可以為 5μΜ,ΙΟμΜ, 15μΜ,20μΜ,50μΜ〇
[0028] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種復(fù)合物，所述復(fù)合物如式III所示
[0029]A-BIII
[0030] 其中，A為伊曲康唑或其類似物；B為腸道病毒的3A蛋白。
[0031] 本發(fā)明的第六方面，提供了一種篩選藥物的方法，所述方法包括：將待篩選藥物與 腸道病毒或者腸道病毒的3A蛋白接觸，并檢測是否形成本發(fā)明第五方面所述的所述的復(fù) 合物。
[0032] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0033] 圖1.伊曲康唑和泊沙康唑抑制EV71的感染。圖1A顯示了RD細(xì)胞中加入3倍倍比 稀釋的伊曲康唑，加入病毒或培養(yǎng)基培養(yǎng)96h后利用CellTiter-Glo試劑盒檢測細(xì)胞活力， 檢測伊曲康唑?qū)V71的抑制效果及對(duì)細(xì)胞的作用。結(jié)果使用GraphpadPrism5進(jìn)行處理。 圖1B顯示了用感染復(fù)數(shù)（Multipleofinfections,Μ0Ι)為0.1的EV71感染RD細(xì)胞，并且 加入3倍倍比稀釋的伊曲康唑，培養(yǎng)42h后收集上清液，用空斑形成實(shí)驗(yàn)測定病毒滴度。圖 中的數(shù)據(jù)來自兩個(gè)獨(dú)立的平行實(shí)驗(yàn)，誤差線代表兩組平行實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。圖1C顯示了RD細(xì) 胞中加入3倍倍比稀釋的泊沙康唑，加入病毒或培養(yǎng)基培養(yǎng)96h后利用CellTiter-Glo試 劑盒檢測細(xì)胞活力，檢測泊沙康唑?qū)V71的抑制效果及對(duì)細(xì)胞的作用。結(jié)果使用Graphpad Prism5進(jìn)行處理。圖ID顯示了氟康唑?qū)V71病毒的抑制活性。圖1E顯示了伏立康唑?qū)?EV71病毒的抑制活性。
[0034] 圖2.伊曲康唑的抗病毒譜研究。圖2A顯示了分別用EV71SH036株（Μ0Ι= 0. 1)， CVA16 (Μ0Ι= 0· 01)，CVB3 (Μ0Ι= 0· 001)，PV1 (Μ0Ι= 0· 01)，EV68 (Μ0Ι= 0· 1)感染RD細(xì) 胞，并加入3倍倍比稀釋的伊曲康唑，分別在感染48、42、24、42、48h后收集上清液，測定病 毒的滴度。圖2B顯示了用GraphpadPrism處理數(shù)據(jù)，計(jì)算得出伊曲康唑抑制病毒的EC5。。
[0035] 圖3.伊曲康唑抑制病毒的機(jī)制研究。圖3A顯示了不同時(shí)點(diǎn)加藥實(shí)驗(yàn)。Μ0Ι為5的 EV71在4°C感染Vero細(xì)胞lh，用預(yù)冷的培養(yǎng)基洗三遍，然后在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)加入5μΜ的伊 曲康唑，20h后收集上清液測病毒滴度。對(duì)照組是在感染0、10、16h時(shí)加入0. 25%DMS0。圖 3B顯示了瞬時(shí)復(fù)制子實(shí)驗(yàn)。lyg含螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因（F-Luc)的復(fù)制子轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種到12孔板中，分別加入5μΜ的伊曲康唑，0. 25%DMS0 (對(duì)照），并 在lh、16h收集裂解液進(jìn)行檢測。加藥組與對(duì)照組的熒光酶活性通過two-wayAN0VA進(jìn)行 比較（***ρ〈〇· 001)。
[0036] 圖4.伊曲康唑通過抑制病毒3Α蛋白的合成來發(fā)揮抗病毒活性。圖4Α顯示了伊 曲康唑耐藥株的篩選方案。圖4Β顯示了 3株耐藥株的耐藥性比較。圖4C顯示了 3株耐藥 株抑制倍數(shù)與野生型比較。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)了伊曲康唑及其類似物對(duì)腸道病毒 的抑制活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，伊曲康唑及其類似物對(duì)多種腸道病毒均有良好的抑制作用。在 此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0038] 腸道病毒
[0039] 腸道病毒（enterovirus)在分類上屬于小核糖核酸（RNA)病毒科 (picomaviridae)，人腸道病毒至少由100個(gè)血清型組成，其代表性的種類包括（但并不限 于）：
[0040] 人腸道病毒A，包括21種血清型：柯薩奇病毒coxsackievirusA2 (CV-A2)，CV-A3, CV-A4,CV-A5,CV-A6,CV-A7,CV-A8,CV-A10,CV-A12,CV-A14,CV-A16,腸道病毒enterovirus A71(EV-A71),EV-A76,EV-A89,EV-A90,EV-A91,EV-A92,EV-A114,EV-A119,EV-A120,EV- A121 ；
[0041] 人腸道病毒B，包括 59 種血清型：coxsackievirusB1(CV-B1)，CV-B2，CV-B3，CV-B 4,CV_B5(incl.swinevesiculardiseasevirus[SVDV])，CV-B6，CV_A9，?？刹《緀chovir usl(E-l)，E-2,E-3,E-4,E-5,E-6,E-7,E-9 (包括CV-A23)，E-ll,E-12,E-13,E-14,E-15,E-l 6,E-17,E-18,E-19,E-20,E-21,E-24,E-25,E-26,E-27,E-29,E-30,E-31,E-32,E-33,enter ovirusB69(EV-B69)，EV-B73,EV-B74,EV-B75,EV-B77,EV-B78,EV-B79,EV-B80,EV-B81，EV -B82,EV-B83,EV-B84,EV-B85,EV-B86,EV-B87,EV-B88,EV-B93,EV-B97,EV-B98,EV-B100,E V-B101,EV-B106,EV-B107,EV-B111 ；
[0042] 人腸道病毒C，包括23種血清型：人脊髓灰質(zhì)炎病毒？〇1丨〇￥化1^(?￥)1，？￥-2，卩￥-3,coxsackievirusA1(CV-A1)，CV-A11，CV-A13,CV-A17,CV-A19,CV-A20,CV-A21，CV-A22,C V-A24,EV-C95,EV-C96,EV-C99,EV-C102,EV-C104,EV-C105,EV-C109,EV-C113,EV-C116,EV -C117andEV-C118 ;
[0043] 人腸道病毒D，包括 4 種血清型：EV-D68,EV-D70,EV-D94,EV-D111。
[0044] 腸道病毒感染的臨床表現(xiàn)多樣，除無癥狀感染外，還有廣泛的急性疾病，包括急性 呼吸道疾病、無菌性腦