種到12孔板中，分別加入5μΜ的伊曲康唑，0. 25%DMS0 (對(duì) 照），并在lh、16h收集裂解液進(jìn)行檢測(cè)。加藥組與對(duì)照組的熒光酶活性通過two-wayAN0VA 進(jìn)行比較（***Ρ〈〇.〇〇1)。轉(zhuǎn)染后lh代表了病毒蛋白翻譯階段，16h代表病毒RNA合成階 段，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明lh的熒光素酶活性各組之間沒有區(qū)別，但是在轉(zhuǎn)染后16h，伊曲康唑處理 組顯著抑制了熒光素酶活性，證明伊曲康唑抑制了RNA的合成。
[0118] 實(shí)施例4伊曲康唑通過抑制病毒3A蛋白的合成來發(fā)揮抗病毒活性
[0119] 本發(fā)明中在Vero細(xì)胞上在逐步提高伊曲康唑濃度下傳16代獲得了EV71耐藥 株，全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)耐藥株的突變位于3A蛋白（G5213U，3AVal51Leu和U5286C，3A Val75Ala)，提示3A蛋白和/或其前體蛋白3AB是伊曲康唑的作用靶點(diǎn)。
[0120] 圖4A伊曲康唑耐藥株的篩選方案。耐藥株是通過在EV71病毒盲傳過程中逐步增 加藥物濃度來篩選獲得的。病毒分別在終濃度為〇. 3,0. 6,1. 2, 2. 4,4. 8,9. 6,19. 2和25μΜ 的伊曲康唑中傳2代，總共16代。盲傳采用在傳代培養(yǎng)過程中每天觀察細(xì)胞病變情況的方 式，決定病毒培養(yǎng)的最佳時(shí)間。同時(shí)以野生型病毒在不加伊曲康唑的培養(yǎng)基中平行傳代作 為對(duì)照。平行篩選了3株耐藥株。
[0121] 圖4Β3株耐藥株的耐藥性比較。用感染復(fù)數(shù)（Μ0Ι)為0. 1的3株耐藥株（篩選系 1、2、3)與平行傳代的野生型病毒感染Vero細(xì)胞，一組加入25μΜ的伊曲康唑，另一組加入DMS0作為對(duì)照，感染42小時(shí)后收取上清，用空斑試驗(yàn)測(cè)病毒滴度。
[0122] 圖4C3株耐藥株抑制倍數(shù)與野生型比較。抑制倍數(shù)等于各組病毒用DMS0處理的 病毒滴度除以25μΜ伊曲康唑處理的病毒滴度。與野生型比抑制倍數(shù)比值等于野生型抑制 倍數(shù)除以各篩選系的抑制倍數(shù)。從圖4C中可以看出，與野生型相比，3Α蛋白突變的突變株 其耐藥性提高了 10倍以上，說明伊曲康唑或其類似物的作用靶點(diǎn)為病毒的3Α蛋白，3Α蛋白 突變以后導(dǎo)致耐藥性顯著增強(qiáng)。
[0123] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 伊曲康唑、和/或伊曲康唑類似物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備試劑或藥物中的用 途，其特征在于，所述試劑或藥物用于 ⑴抑制RNA的合成；和/或 (ii) 抑制病毒的生長(zhǎng)或繁殖；和/或 (iii) 抑制病毒的3A蛋白的活性。2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述藥物還用于治療或預(yù)防腸道病毒感染引起的 疾?。粌?yōu)選地，所述腸道病毒感染引起的疾病包括但不限于由腸道病毒感染引起的：手足 口病、無菌性腦膜炎、腦膜炎、脊髓灰質(zhì)炎、急性呼吸道疾病、急性心肌炎、新生兒多器官衰 竭和急性弛緩性麻痹。3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述伊曲康唑類似物選自下組：泊沙康唑、美國(guó)專 利申請(qǐng)公開號(hào)US4267179A中描述的伊曲康唑類似物。4. 如權(quán)利要求2所述的用途，其中，所述腸道病毒包括：人腸道病毒A、人腸道病毒B、 人腸道病毒C、和/或人腸道病毒D。5. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述RNA選自：病毒RNA、原核細(xì)胞RNA和真核細(xì)胞 RNA〇6. -種腸道病毒的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑通過抑制腸道病毒的RNA合成和/ 或通過抑制病毒3A蛋白的活性來抑制所述腸道病毒的生長(zhǎng)或繁殖；優(yōu)選地，所述抑制劑選 自下組中的一種或多種： ⑴伊曲康唑；和/或 (2)伊曲康唑類似物。7. -種藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物含有權(quán)利要求6所述的抑制劑或 其藥學(xué)上可接受的鹽以及藥學(xué)上可接受的載體。8. -種體外非治療性地抑制腸道病毒生長(zhǎng)或者殺滅腸道病毒的方法，其特征在于，包 括步驟：在需要處理的場(chǎng)所施用權(quán)利6所述的抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。9. 一種復(fù)合物，其特征在于，所述復(fù)合物如式III所示 A-BIII 其中，A為伊曲康唑或其類似物；B為腸道病毒的3A蛋白。10. -種篩選藥物的方法，其特征在于，所述方法包括：將待篩選藥物與腸道病毒或者 腸道病毒的3A蛋白接觸，并檢測(cè)是否形成權(quán)利要求9所述的復(fù)合物。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種腸道病毒的小分子化合物抑制劑及其應(yīng)用，具體地，本發(fā)明提供了伊曲康唑、伊曲康唑類似物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備試劑中的用途，用于抑制腸道病毒的生長(zhǎng)或繁殖；和/或抑制腸道病毒RNA的合成。本發(fā)明還提供了包含伊曲康唑、伊曲康唑類似物的腸道病毒的抑制劑及藥物組合物，以及體外非治療性地抑制腸道病毒生長(zhǎng)或者殺滅腸道病毒的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，伊曲康唑及其類似物對(duì)多種腸道病毒均有良好的抑制作用。
【IPC分類】G01N33/15, A61P31/14, A01P1/00, A61K31/496, A01N43/653
【公開號(hào)】CN105394045
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410448946
【發(fā)明人】鄒罡, 艾德銘, 高倩倩
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院上海巴斯德研究所
【公開日】2016年3月16日
【申請(qǐng)日】2014年9月4日