病毒檢測(cè)引物序列
[0032]
[0033] 4種病毒的檢測(cè)采用RT-PCR技術(shù)，以cDNA為模板，在Taq酶的催化下，使用正反引物 進(jìn)行雙鏈DNA的擴(kuò)增。4種病毒的PCR反應(yīng)條件分別為ASGV:94°C 45s，58.6°C 45s，72°C lmin；ACLSV：94〇C 45s,59〇C 45s,72〇C lmin；ASPV：94〇C 45s,54.4〇C 45s,72〇C lmin； ASSVd:94°C 45s，58°C 45s，72°C lmin;均循環(huán)35次，最后72°C延伸lOmin。檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)， 帶毒率（％ )=(檢出病毒苗木樹/抽檢苗木總數(shù)）X 100%。
[0034] 對(duì)照組1
[0035] 與實(shí)施例1相比，除操作步驟(2)中采取1月上旬，直接將種子拌沙后，置于背陰處 沙藏。其余(1 )、（3)、（4)操作步驟與實(shí)施例1完全相同。
[0036] 對(duì)照組2
[0037]與實(shí)施例1相比，操作步驟(2)中采取配置10%Na3P〇4,浸種30分鐘，用自來水沖洗2 次，晾干。拌沙后，于背陰處沙藏。其余(1)、（3)、（4)操作步驟與實(shí)施例1完全相同。
[0038] 對(duì)照組3
[0039]與實(shí)施例1相比，操作步驟（2)中采取配置2%NaOH，浸種30分鐘，用自來水沖洗2 次，晾干。拌沙后，于背陰處沙藏。其余(1)、（3)、（4)操作步驟與實(shí)施例1完全相同。效果基礎(chǔ) 試驗(yàn)
[0040]實(shí)驗(yàn)材料:八棱海棠實(shí)生砧木種子。
[0041 ] 試驗(yàn)處理:試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理組，每個(gè)處理組300粒，重復(fù)3次。
[0042] T1處理組使用實(shí)施例1處理方法；
[0043] T2處理組使用對(duì)照組1處理方法；
[0044] T3處理組使用對(duì)照組2處理方法；
[0045] T4處理組使用對(duì)照組3處理方法；
[0046] 1、不同處理對(duì)八棱海棠種子發(fā)芽率和出苗率的影響
[0047] 與對(duì)照（T2)相比較，2%似0!1〇4)、10%似疋〇4〇3)和1%疆11〇4(1'1)均能不同程度 的提高八棱海棠種子的發(fā)芽率和出苗率。以1 % KMn〇4處理30分鐘的種子發(fā)芽率和出苗率均 最高，分別達(dá)到25.6 %和45.7 %。其次為10%Na3P〇4處理30分鐘，種子發(fā)芽率和出苗率分別 達(dá)到24.3%和40.0%。以2%NaOH處理的發(fā)芽率最低，僅為12.5%，低于常規(guī)處理。
[0048]表1、不同處理對(duì)八棱海棠種子發(fā)芽率和出苗率的影響
[0049]
[0050]~2、不同蘋果砧木實(shí)生苗的帶毒情況
[00511 5種蘋果砧木實(shí)生苗的病毒檢測(cè)結(jié)果表明，八棱海棠實(shí)生苗總體帶毒率為26.7%， 其中，蘋果莖溝病毒侵染率為3.3%，蘋果銹果類病毒侵染率為26.7%，2種病毒復(fù)合侵染率 為3.3%，蘋果褪綠葉斑病毒和蘋果莖痘病毒未檢出；福山沙果、平邑甜茶和山定子雖然只 檢測(cè)出蘋果銹果類病毒，但福山沙果和平邑甜茶的感染率均高達(dá)100%，山定子銹果類病毒 攜帶率也達(dá)到30%;楸子同時(shí)被蘋果褪綠葉斑病毒、蘋果莖痘病毒和蘋果銹果類病毒3種病 毒復(fù)合侵染，復(fù)合侵染率達(dá)到53.3%，其中，蘋果褪綠葉斑病毒的侵染率為43.3%，蘋果莖 痘病毒侵染率達(dá)70 %，蘋果銹果類病毒為23.3 %，該砧木總體帶毒率高達(dá)73.3 % (表2)。
[0052] 表2蘋果砧木實(shí)生苗的帶毒率
[0053]
[0054] 3、不同處理對(duì)蘋果病毒脫除效果
[0055] 不同脫毒處理對(duì)蘋果病毒病脫除效果不同。與常規(guī)處理（T2)相比，以2%Na0H (T4)、和1%ΚΜη〇4(Τ1)Τ1和T4處理對(duì)蘋果病毒脫除效果最好，脫除率達(dá)到100%，其次為 10%Na3P〇4(T3)，常規(guī)處理的帶毒率最高。
[0056]表3不同處理對(duì)蘋果病毒脫除效果
[0057]
[0058] 對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在 不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論 從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán) 利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有 變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
[0059] 此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式包含 一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將 說明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以理解的其他實(shí)施方式。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種降低八棱海棠種子病毒帶毒率提高發(fā)芽率的方法，其特征在于:采用1 %高錳酸 鉀水溶液浸泡八棱海棠種子，進(jìn)行沙藏、播種、獲取無病毒苗木繁育的基砧。2. -種權(quán)利要求1所述的降低八棱海棠種子病毒帶毒率提高發(fā)芽率的方法，其特征在 于:包括以下步驟： (1) 種子采集:在健康、無病害的樹上，采收果實(shí)成熟后的八棱海棠種子;將果實(shí)環(huán)狀切 開，取出種子用清水清洗2遍，去除果肉和種子表面的果膠，陰干后，放干燥通風(fēng)處保存； (2) 高錳酸鉀處理:在1月上旬，將種子放入1%高錳酸鉀水溶液浸泡30分鐘，用自來水 沖洗2次，晾干后，放置在背陰處沙藏； (3) 播種:在3月中下旬，在平均氣溫5-7°C時(shí)開始播種;播種量1.5-2. OKg/666.7m2;播種 后，待苗長至2-3片真葉時(shí)，開始澆水，進(jìn)行正常田間管理； (4) 實(shí)生苗優(yōu)選與病毒抽檢:待苗高8-lOcm時(shí)，對(duì)苗圃中生長勢(shì)弱、發(fā)育不正常、有明顯 病害的實(shí)生海棠苗及時(shí)去除，同時(shí)疏除生長過密的苗木，保持通風(fēng)，株距保持在l〇-15cm;8 月中下旬，對(duì)海棠苗木進(jìn)行隨機(jī)選取幼葉進(jìn)行蘋果病毒檢測(cè);抽檢完畢后，所得砧木即可作 為蘋果無病毒苗木繁育的基砧。3. -種權(quán)利要求2所述的降低八棱海棠種子病毒帶毒率提高發(fā)芽率的方法，其特征在 于:在步驟(2)的沙藏中，種子與沙的比例在1:3-1:5之間。4. 一種權(quán)利要求3所述的降低八棱海棠種子病毒帶毒率提高發(fā)芽率的方法，其特征在 于:播種前，用篩子將沙篩出，打畦，畦寬1.6-1.7m，每畦4行點(diǎn)播，播3-4粒種，距離10-12cm， 播種深度3.0-4.0cm 〇5. -種權(quán)利要求4所述的降低八棱海棠種子病毒帶毒率提高發(fā)芽率的方法，其特征在 于:在步驟(3)中，播種后，選取鋪地膜或扣拱棚保溫保濕，選溫和天氣去膜。6. -種權(quán)利要求5所述的降低八棱海棠種子病毒帶毒率提高發(fā)芽率的方法，其特征在 于:在步驟(3)中，田間管理的過程中可噴布36%甲基硫菌靈懸浮劑500倍液。7. -種權(quán)利要求6所述的降低八棱海棠種子病毒帶毒率提高發(fā)芽率的方法，其特征在 于:蘋果病毒為 ASGV、ACLSV、ASPV、ASSVd。8. -種權(quán)利要求7所述的降低八棱海棠種子病毒帶毒率提高發(fā)芽率的方法，其特征在 于:蘋果病毒檢測(cè)采用RT-PCR技術(shù)，以cDNA為模板，在Taq酶的催化下，使用正反引物進(jìn)行雙 鏈DNA的擴(kuò)增。
【專利摘要】本發(fā)明屬于果樹脫毒種苗繁育技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種降低八棱海棠種子病毒帶毒率提高發(fā)芽率的方法。采用1％高錳酸鉀水溶液浸泡八棱海棠種子，進(jìn)行沙藏、播種、獲取無病毒苗木繁育的基砧。包括以下步驟：(1)種子采集；(2)高錳酸鉀處理；(3)播種；(4)實(shí)生苗優(yōu)選與病毒抽檢。使用本發(fā)明的技術(shù)方法，八棱海棠種子出苗率達(dá)到47.6％，病毒脫除率達(dá)到95％，節(jié)省育苗用海棠種子50％，大大節(jié)約了生產(chǎn)成本。
【IPC分類】A01G17/00, A01C1/00
【公開號(hào)】CN105532347
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510896677
【發(fā)明人】姜中武, 趙玲玲, 宋來慶, 郭承華, 郭善利, 孫承鋒
【申請(qǐng)人】煙臺(tái)大學(xué)
【公開日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2015年12月7日