腸桿菌638及其應(yīng)用方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[00011本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2011年3月10日的題為"腸桿菌638及其應(yīng)用方法"的中國(guó)專(zhuān)利 申請(qǐng)No .201180023739.9的分案申請(qǐng)。
[0002]相關(guān)申請(qǐng)的參考
[0003] 本申請(qǐng)要求于2010年3月12日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)NO. 61/313,415的權(quán)益，該 專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖巳恳米鳛閰⒖肌?br>[0004] 本發(fā)明在政府的支持下完成，合同號(hào)DE-AC02-98CH10886，其由美國(guó)能源部頒發(fā)。 政府具有本發(fā)明中的某些權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明涉及一種新型腸桿菌物種，尤其涉及其與植物生長(zhǎng)和發(fā)育相關(guān)的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0006] 可以預(yù)料地球的氣候變化會(huì)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力產(chǎn)生很大影響。例如，化石燃料燃燒造 成排放物增加，影響地球氣候，這就更需要生產(chǎn)源自可再生資源的生物燃料。氣候改變會(huì)影 響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的另一個(gè)方面是其造成溫度升高并對(duì)降雨模式造成影響。
[0007] 雖然期望增加用于生產(chǎn)生物燃料的原料生產(chǎn)中的農(nóng)業(yè)資源需求，但是該增加的需 求需與同時(shí)增加的用于養(yǎng)活仍在增長(zhǎng)的世界人口的食物需求相平衡。
[0008] 因此，需要實(shí)現(xiàn)用于優(yōu)化糧食生產(chǎn)和生物燃料原料生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。通過(guò)可持 續(xù)方式最佳地提高總植物生產(chǎn)力，提高植物的抗旱性，使得農(nóng)作物和原料可承受較大波動(dòng) 的降雨模式，并增加植物的耐病原體感染性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] -方面，本發(fā)明涉及腸桿菌638(楊樹(shù)內(nèi)生菌，Enterobacter sp.638)的分離培養(yǎng) 物（isolated culture)。
[0010] 另一方面，本發(fā)明涉及用于植物的接種物。該接種物包括腸桿菌638的分離培養(yǎng)物 和生物學(xué)可接受的基質(zhì)(medium) 〇
[0011] 仍在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于增加植物生長(zhǎng)的方法。該方法包括為植物施加 (應(yīng)用，apply)可有效增加植物生長(zhǎng)的量的組合物，其中該組合物包括腸桿菌638的分離培 養(yǎng)物。
[0012] 在進(jìn)一步方面，本發(fā)明涉及用于增加植物中的生物量(biomass)的方法。該方法包 括為植物施加可有效增加植物中生物量的量的組合物，其中該組合物包括腸桿菌638的分 離培養(yǎng)物。
[0013] 仍在進(jìn)一步方面，本發(fā)明涉及用于提高植物的果實(shí)和/或種子生產(chǎn)力 (productivity)的方法。該方法包括為植物施加可有效提高植物的果實(shí)和/或種子生產(chǎn)力 的量的組合物。該組合物包括腸桿菌638的分離培養(yǎng)物。
[0014] 在其他方面，本發(fā)明涉及提高植物抗病性(耐病性，disease tolerance)的方法。 該方法包括為植物施加可有效提高植物抗病性的量的組合物。該組合物包括腸桿菌638的 分尚培養(yǎng)物。
[0015] 仍在其他方面，本發(fā)明涉及提高植物耐旱性的方法。該方法包括為植物施加可有 效提高植物抗病性的量的組合物。該組合物包括腸桿菌638的分離培養(yǎng)物。
[0016] 從以下詳述和附圖可了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)和方面。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1表示關(guān)于接種不同內(nèi)生細(xì)菌的楊樹(shù)插條(cutting)的生長(zhǎng)指數(shù)。在砂土中接種 和種植插條的10周后測(cè)定生長(zhǎng)指數(shù)。每個(gè)條件使用7個(gè)植物。植物生長(zhǎng)于溫室中。未接種的 植物用作對(duì)照(參考）。棒表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。接種和未接種的植物生長(zhǎng)10周后，其生長(zhǎng)指數(shù)計(jì)算 為(Mt-Md/M^Mo表示0周時(shí)植物的重量(g) ;Mt表示10周后植物的重量(g)。利用Dunnett檢 驗(yàn)，相比未接種的對(duì)照植物，接種植物中產(chǎn)生的增加生物量的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性證實(shí)在5%水平 (林)。
[0018] 圖2示出腸桿菌638對(duì)楊樹(shù)DN-34的芽（shoot)和根形成的影響。植物水培于不存在 株638(對(duì)照)或存在株638的半強(qiáng)度的Hoagland溶液中。在I(A)和10(B)周后出現(xiàn)芽和根的 生長(zhǎng)。
[0019] 圖3示出經(jīng)4個(gè)月生長(zhǎng)期收獲的西紅柿（番茄）的總重量。相比未接種的對(duì)照植物， 接種腸桿菌638的植物產(chǎn)量高出10 %。
[0020] 圖4顯示相比作為對(duì)照的未接種向日葵，接種腸桿菌638的向日葵植物接種后縮短 了開(kāi)花時(shí)間。
[0021] 圖5示出在不存在(頂部色譜)或存在(底部色譜)植物提取物時(shí)生長(zhǎng)的腸桿菌638 提取物的色譜比較。當(dāng)存在植物提取物時(shí)，注意乙偶姻和2,3_ 丁二醇的產(chǎn)生。結(jié)果從包含蔗 糖的確定培養(yǎng)基(definite medium)中獲得。
[0022]圖6示出來(lái)自根據(jù)其不同基因定位:染色體或質(zhì)粒pENT638-l的特定COG類(lèi)的基因 的百分比。C 〇 g類(lèi)圖例：D細(xì)胞周期控制，細(xì)胞分裂，染色體分離；M細(xì)胞壁/膜/包膜 (envelope)的生物合成;N細(xì)胞活動(dòng)性;0翻譯后修飾，蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)，伴侶;T信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制;U 細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和膜泡運(yùn)輸;V防御機(jī)制;W胞外結(jié)構(gòu);J翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成;K轉(zhuǎn) 錄;L復(fù)制，重組和修復(fù);C能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換;E氨基酸的運(yùn)輸和代謝;F核苷酸的運(yùn)輸和代 謝;G碳水化合物的運(yùn)輸和代謝;H輔酶的運(yùn)輸和代謝；I脂質(zhì)的運(yùn)輸和代謝;P無(wú)機(jī)離子的運(yùn) 輸和代謝;Q次生代謝產(chǎn)物的生物合成，運(yùn)輸和分解代謝;R僅一般功能預(yù)測(cè);S功能未知。 [0023]圖7示出當(dāng)接種腸桿菌638后煙草中產(chǎn)生的增加的生物量。為了比較，包括未接種 的對(duì)照植物和接種惡臭假單胞菌W619(Pseudomonas putida)的植物。接種腸桿菌638的煙 草植物不僅生長(zhǎng)最多，而且和向日葵一樣，其開(kāi)花較早。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的腸桿菌638于2011年3月4日生物保藏于ATCC專(zhuān)利保藏機(jī)構(gòu)，10801 University Blvd.，馬納薩斯，VA 20110。
[0025] A ·腸桿菌638的培養(yǎng)
[0026] 一方面，本發(fā)明涉及腸桿菌638的分離培養(yǎng)物。腸桿菌638為非植物病原細(xì)菌菌株。 在有氧條件下，從表面滅菌的根和莖樣品中分離出腸桿菌638菌株，所述根和莖樣品取自生 長(zhǎng)于其下含地下水并被四氯化碳或三氯乙烯污染的粉砂壤土(silty loam soil)中的雜交 楊樹(shù) Hl 1-11。
[0027] 腸桿菌638菌株包括4，518，712bp的單環(huán)染色體，其總G+C含量為52.98%，且其穩(wěn) 定地包括157,749bp的質(zhì)粒pENT638-l，其總G+C含量為50.57%。根據(jù)GC含量，pENT638-l質(zhì) 粒至少顯示四個(gè)不同區(qū)域。PENT638-1質(zhì)粒與發(fā)現(xiàn)于其他腸桿菌科中的F質(zhì)粒有關(guān)。該類(lèi)質(zhì) 粒涉及宿主的相互作用和毒性，例如，鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)的pFra質(zhì)粒。然 而，在PENT638-1中，pFra致病島被獨(dú)特的23kb假定基因組島（側(cè)接整合酶基因且其GC含量 與其余質(zhì)粒的GC含量顯著不同）取代。
[0028] "分離培養(yǎng)物"指的是不包含其他物質(zhì)的微生物培養(yǎng)物，其他物質(zhì)包括（i)在微生 物生長(zhǎng)的土壤中通常發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)，和/或（ii)在微生物從中分離的物質(zhì)。另外，該培養(yǎng)物可 以是不包含其他的其數(shù)量足以干擾復(fù)制培養(yǎng)物或足以通過(guò)正規(guī)的細(xì)菌學(xué)、分子生物學(xué)和/ 或化學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的生物、微生物和/或細(xì)菌物種的培養(yǎng)物。
[0029] B.植物接種物
[0030] 另一方面，本發(fā)明涉及植物接種物。接種物包括腸桿菌638的分離培養(yǎng)物和生物學(xué) 上可接受的基質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"微生物接種物"或"接種物"指的是包含腸桿菌638分離培養(yǎng)物的制 劑。
[0031] 為了促進(jìn)腸桿菌638的培養(yǎng)物，例如可利用合適的培養(yǎng)基或載體對(duì)該培養(yǎng)物進(jìn)行 稀釋。"生物學(xué)上可接受的基質(zhì)"指的是不干擾腸桿菌638生物活力有效性且對(duì)腸桿菌638沒(méi) 有毒性的基質(zhì)。
[0032] 示例性的生物學(xué)上可接受的基質(zhì)包括含葡糖酸鹽的最低鹽基質(zhì)和稀釋的富集基 質(zhì)（1/100 LB)。生物學(xué)上可接受的基質(zhì)可包括碳源，如下面示例的化合物:D-甘露糖醇、乳 糖、蔗糖、熊果苷、水楊苷、海藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、麥芽糖、纖維二糖、木糖、葡糖酸 鹽和葡萄糖。優(yōu)選地，該基質(zhì)包括葡萄糖，蔗糖，其他的植物中提取的糖和/或引起促進(jìn)植物 生長(zhǎng)的植物激素誘導(dǎo)的楊樹(shù)提取物(乙偶姻，2，3-丁二醇，見(jiàn)圖5)。
[0033]在一個(gè)實(shí)施例中，接種物進(jìn)一步包括促植物生長(zhǎng)微生物（plant-growth promoting microorganism)，例如包括促進(jìn)植物生長(zhǎng)的內(nèi)生細(xì)菌、真菌、根際細(xì)菌 (rhizosphere bacterium)和/或菌根真菌。具體示例性的促植物生長(zhǎng)微生物包括但不局限 于放線(xiàn)菌(Act inobacter)、產(chǎn)喊桿菌(Alcaligenes)、芽抱桿菌（Bacillus)、伯克氏菌 (Burkholderia)、布丘氏菌（Buttiauxella)、腸桿菌（Enterobacter)、克雷伯氏菌 (Klebsiella)、克呂沃爾氏菌(Kluyvera)、假單胞菌(Pseudomonas)、拉恩氏菌(Rahnella)、 青枯菌（Ralstonia)、根瘤菌（Rhizobium)、沙雷氏菌（Serratia)、寡養(yǎng)單胞菌 (Stenotrophomonas)屬中的成員。
[0034] C.增加生長(zhǎng)的方法
[0035] 另一方面，本發(fā)明涉及用于增加植物生長(zhǎng)的方法。該方法包括為植物施加有效量 的含腸桿菌638分離培養(yǎng)物的組合物。
[0036] 這里使用的"植物"指的是任何類(lèi)型的植物，例如樹(shù)(喬木，tree)、灌木、花、草本植 物、藤本植物或草。術(shù)語(yǔ)"植物"還指植物的任何部分，例如，指整個(gè)植物、植物的部分、植物 細(xì)胞或植物細(xì)胞群如植物組織、或其后代。幼苗也可包含于"植物"含義中。植物包括，例如， 任何裸子植物和被子植物，單子葉植物和雙子葉植物以及樹(shù)。
[0037] 示例性的單子葉被子植物包括但不局限于蘆筍、野生甜玉米（field and sweet corn)、大麥、小麥、大米(稻，rice)、高粱、洋蔥、御谷(pearl millet)、黑麥和燕麥以及其他 的糧谷（cereal grain)、甘鹿、象草（elephant grass)、柳枝稷（switch grass)和芒草 (miscanthus)〇
[0038] 示例性的雙子葉被子植物包括但不局限于西紅柿、煙草、棉花、油菜籽、野生豆、大 豆（soybean )、辣椒、萬(wàn)苣、豌豆、紫花苜蓿(alfalfa )、三葉草、油菜作物或甘藍(lán)(Brassi ca oleracea)(如，卷心菜、花椰菜、菜花、球芽甘藍(lán)）、蘿卜、胡蘿卜、甜菜、茄子、菠菜、黃瓜、南瓜、 甜瓜、哈密瓜、向日葵和各種觀賞植物(ornamental)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該植物為西紅 柿。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該植物為向日葵。仍在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該植物為煙草。
[0039] 植物的示例性木本物種包括楊樹(shù)、松樹(shù)、紅杉、雪松、櫟樹(shù)等。樹(shù)種進(jìn)一步包括，例 如，冷杉、松樹(shù)、云杉、落葉松、雪松、鐵杉、洋槐、赤楊、山楊、山毛櫸、樺樹(shù)、膠皮糖香樹(shù) (sweet gum)、楓樹(shù)、楊樹(shù)、柳樹(shù)和諸如此類(lèi)的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該植物為楊樹(shù)。
[0040] 這里使用的術(shù)語(yǔ)"增加"生長(zhǎng)指的是增加利用本發(fā)明的方法或組合物處理的植物 的生長(zhǎng)特性，其中該生長(zhǎng)特性的增加大于在不應(yīng)用本發(fā)明方法和組合物的相同條件下生長(zhǎng) 的相應(yīng)對(duì)照植物的生長(zhǎng)。"相應(yīng)的"對(duì)照植物指的是與利用本發(fā)明的方法和組合物處理的植 物相同類(lèi)型和物種的野生型植物。
[0041 ]生長(zhǎng)增加可為植物特定部分的生長(zhǎng)增加，例如根、芽、葉片、花、果實(shí)和/或種子，或 者生長(zhǎng)可分布于整個(gè)植物。生長(zhǎng)的測(cè)定方法是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的。
[0042] 生長(zhǎng)增加可包括，例如，植物和/或植物的部分的以下特性:高度、寬度、質(zhì)量、放射 性碳的累積的一種或其組合的增加，干重的增加，鮮重的增加和/或特定時(shí)期的這些增加的 速率的提高。
[0043] 生長(zhǎng)增加還可包括，例如，產(chǎn)生的果實(shí)數(shù)量的增加，開(kāi)花時(shí)間的縮短和/或起有益 作用的營(yíng)養(yǎng)器官的質(zhì)量的增加，如植物的根或塊莖，其中這些部分是食物來(lái)源。
[0044] 生長(zhǎng)增加可為在不應(yīng)用本發(fā)明方法和組合物的相同條件下生長(zhǎng)的相應(yīng)對(duì)照植物 生長(zhǎng)的2、4、5、6、8、10、20(或更多)倍。例如，相比在不應(yīng)用本發(fā)明方法和組合物的相同條件 下生長(zhǎng)的對(duì)照植物，生長(zhǎng)增加的植物具有比相應(yīng)對(duì)照植物多出10 %，15 %，20 %，25 %， 30%，40%，50%，60%，70%，75%，80%，90%，100%或更大的生長(zhǎng)。
[0045] D.增加生物量的方法
[0046] 在進(jìn)一步方面，本發(fā)明涉及增加植物生物量的方法。該方法包括為植物施加有效 量的含腸桿菌6 38分離培養(yǎng)物的組合物。
[0047] 術(shù)語(yǔ)"生物量"指的是植物的干重或鮮重。例如，生物量包括除另外規(guī)定之外的所 有植物的部分，如有關(guān)芽生物量(所有地面以上的植物部分）、葉生物量和根生物量。術(shù)語(yǔ) "干重"指的是已除去大多數(shù)細(xì)胞水的干燥植物的重量。術(shù)語(yǔ)"鮮重"指的是未干燥至除去大 多數(shù)細(xì)胞水的植物的重量。生物量的測(cè)量方法是本領(lǐng)域所熟知的。
[0048]術(shù)語(yǔ)"