增加生物量"指的是增加利用本發(fā)明方法和組合物處理的植物的生物量，其 中生物量的增加數(shù)量大于在不應(yīng)用本發(fā)明方法和組合物的相同條件下生長的相應(yīng)對照組 的生物量數(shù)量。
[0049]生物量增加可為在不應(yīng)用本發(fā)明方法和組合物的相同條件下生長的相應(yīng)對照組 植物生物量的2、4、5、6、8、10、20(或更多)倍。例如，相比在不應(yīng)用本發(fā)明方法和組合物的相 同條件下生長的野生型植物，生物量增加的植物具有比相應(yīng)對照植物多出IO %，15 %， 20%，25%，30%，40%，50%，60%，70%，75%，80%，90%，100%或更大的生物量。
[0050] E.提高耐病性和/或抗病性的方法
[0051 ]仍在另一個方面中，本發(fā)明涉及提高植物的耐病性和/或抗病性的方法。該方法包 括為植物施加有效量的含腸桿菌638分離培養(yǎng)物的組合物。雖然不局限于任何特定理論，但 由于腸桿菌638產(chǎn)生乙偶姻和2,3_ 丁二醇或由于產(chǎn)生抗菌化合物2-苯乙醇和4-羥基苯甲酸 酯，或通過憑借鐵載體（siderophore)腸桿菌素合成的必須營養(yǎng)物質(zhì)的直接競爭，和/或通 過由腸桿菌638對異源產(chǎn)生的鐵-鐵載體復(fù)合物的攝入，所以腸桿菌638可提高植物的耐病 性和/或抗病性。
[0052] 術(shù)語"耐病性"指的是植物忍耐或抵抗疾病的能力并在疾病存在時保持功能和生 產(chǎn)的能力。疾病包括，例如，對植物生存能力產(chǎn)生不利影響的病理狀態(tài)，如，植物中和/或植 物上的病原體(如真菌、病毒或細(xì)菌)感染。
[0053] 術(shù)語"抗病性"指的是植物得病后，在相同條件和相同疾病下生長，相比相應(yīng)的不 顯示抗病性的對照植物，植物產(chǎn)生較少疾病癥狀的能力?？共⌒园▽膊〉耐耆剐院? 或表現(xiàn)為癥狀減輕、較長生存或其他疾病特征如較高的產(chǎn)量、增加生長、增加生物量、加速 果實(shí)成熟等的不同程度的抗性。
[0054] 疾病可以是，例如，真菌感染如殼針孢屬（Septoria)、無柄銹屬(Melampsora)或 septotina，病毒感染如白楊花葉病毒和/或細(xì)菌感染如土壤桿菌感染、立克次氏體感染或 棒狀桿菌感染。
[0055] 術(shù)語"提高"耐病性和/或抗病性指的是提高有病害的借助本發(fā)明的方法或組合物 處理的植物的耐病性和/或抗病性，其中在相同條件和相同疾病下生長時，該耐病性和/或 抗病性大于相應(yīng)對照植物的耐病性和/或抗病性。
[0056] 在相同條件和相同疾病下生長時，耐病性和/或抗病性的提高可為相應(yīng)對照植物 的耐病性和/或抗病性的2、4、5、6、8、10、20 (或更多)倍。例如，相比在不應(yīng)用本發(fā)明方法和 組合物的相同條件下生長的野生型植物，耐病性和/或抗病性提高的植物具有比相應(yīng)對照 植物高出 10%，15%，20%，25%，30%，40%，50%，60%，70%，75%，80%，90%，100%或更 大的耐病性和/或抗病性。
[0057]耐病性和/或抗病性的評估方法是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的。例如，這些方法可包括對比 對照植株，觀察和評定物理表現(xiàn)的疾病癥狀、植物活力的減少或死亡以及特定疾病響應(yīng)基 因的活化。
[0058] F.提高果實(shí)和/或種子生產(chǎn)力的方法
[0059] 仍在進(jìn)一步實(shí)施例中，本發(fā)明涉及提高植物果實(shí)和/或種子生產(chǎn)力的方法。該方法 包括為植物施加有效量的含腸桿菌6 38分離培養(yǎng)物的組合物。
[0060] "提高生產(chǎn)力"指的是提高利用本發(fā)明的方法或組合物處理的植物的果實(shí)和/或種 子的質(zhì)量或數(shù)量，其中生產(chǎn)力的提高量大于在不應(yīng)用本發(fā)明方法和組合物的相同條件下生 長的相應(yīng)對照植物的生產(chǎn)力的量。
[0061] 評估生產(chǎn)力提高的方法可包括，例如，測定植物所結(jié)果實(shí)的數(shù)量、植物所結(jié)的單個 果實(shí)的重量、植物的開花時間、植物果實(shí)的成熟時間和/或植物的單個果實(shí)或花產(chǎn)生的種子 數(shù)量。
[0062] 例如，相比在不應(yīng)用本發(fā)明方法和組合物的相同條件下生長的相應(yīng)對照植物，如 果植物所結(jié)果實(shí)的數(shù)量增加，植物所結(jié)的單個果實(shí)的重量增加，植物的開花時間縮短、植物 果實(shí)的成熟時間縮短和/或植物的單個果實(shí)或花所產(chǎn)生的種子數(shù)量增加，那么植物的生產(chǎn) 力得到提高。
[0063] 植物生產(chǎn)力的提高或降低分別比在不應(yīng)用本發(fā)明方法和組合物的相同條件下生 長的相應(yīng)對照植物多或少2、4、5、6、8、10、20 (或更多)倍。例如，相比在不應(yīng)用本發(fā)明方法和 組合物的相同條件下生長的對照植物，生產(chǎn)力提高的植物具有比相應(yīng)對照植物高出10%， 15%，20%，25%，30%，40%，50%，60%，70%，75%，80%，90%，100%或更大的生產(chǎn)力。 [0064] G.提高耐旱性和/或抗旱性的方法
[0065] 在另一方面，本發(fā)明涉及提高植物耐旱性和/或抗旱性的方法。該方法包括利用含 腸桿菌638分離培養(yǎng)物的組合物處理植物。雖然不局限于任何特定理論，但由于腸桿菌638 產(chǎn)生乙偶姻和2,3_ 丁二醇，所以腸桿菌638可提高植物的耐旱性和/或抗旱性。
[0066] 術(shù)語"耐旱性"指植物忍耐或抵抗干旱條件的能力。"干旱"指的是植物在其中經(jīng)受 滲透脅迫或減少的水勢的環(huán)境。例如，一段時間缺乏可利用水分可導(dǎo)致干旱?？赏ㄟ^植物生 長或成熟所需的水分量與植物可利用的水分量的比較評估干旱條件。例如，相對于植物內(nèi) 部利用或蒸發(fā)的水分量，缺乏降雨或灌溉可導(dǎo)致干旱條件。
[0067] 術(shù)語"抗旱性"指當(dāng)在相同水脅迫的條件下生長時，相比相應(yīng)的對照植物，植物產(chǎn) 生較少水脅迫癥狀的能力?？购敌园▽Ω珊敌?yīng)的完全抗性(不損失生產(chǎn)力)或表現(xiàn)為下 降癥狀、較長生存的不同程度的抗性。
[0068] 癥狀的表型評估可用于測定植物是否遭受干旱以及遭受何種程度的干旱。例如， 通過觀察和評定(評級，rating)植物的萎蔫、生長停滯、死亡、生產(chǎn)力、葉片損失(如，葉片卷 曲、葉片扭曲、葉片脫落、葉片枯萎）、莖或枝條頂梢枯死、光合效率、開花、和產(chǎn)量水平，評估 耐旱性和/或抗旱性。另外，例如可通過生化或核酸檢測來測定植物中的特定響應(yīng)基因的表 達(dá)或活化，評估植物的耐旱性和/或抗旱性。
[0069] 如果植物表現(xiàn)出不太嚴(yán)重的干旱脅迫癥狀，那么植物的耐旱性和/或抗旱性得到 提高。例如，相比在不應(yīng)用本發(fā)明方法和組合物的相同條件下生長的相應(yīng)對照植物，如果植 物的萎蔫、生長停滯、死亡、生產(chǎn)力、葉片損失（如，葉片卷曲、葉片扭曲、葉片脫落、葉片枯 萎）、和/或莖或枝條的頂梢枯死減少，那么植物的耐旱性和/或抗旱性得到提高。其他的耐 旱性和/或抗旱性提高的示例包括相比在不應(yīng)用本發(fā)明方法和組合物的相同條件下生長的 相應(yīng)對照植物，植物的生產(chǎn)力、植物活力、光合效率、開花和/或產(chǎn)量的提高。
[0070]相應(yīng)地，術(shù)語"提高"耐旱性和/或抗旱性指的是提高利用本發(fā)明方法或組合物處 理的植物的耐旱性和/或抗旱性，其中當(dāng)在相同的條件和水脅迫下生長時，該耐性和/或抗 性大于相應(yīng)對照植物的耐旱性和/或抗旱性。
[0071]在相同的環(huán)境和水脅迫下生長時，耐旱性和/或抗旱性的提高可為相應(yīng)對照植物 的耐旱性和/或抗旱性的2、4、5、6、8、10、20 (或更多)倍。例如，相比在不應(yīng)用本發(fā)明方法和 組合物的相同條件下生長的對照植物，耐旱性和/或抗旱性提高的植物具有比相應(yīng)對照植 物高出 10%，15%，20%，25%，30%，40%，50%，60%，70%，75%，80%，90%，100%或更大 的耐旱性和/或抗旱性。
[0072] Η. -般方法
[0073] 任何為植物施加組合物的方法可用于本發(fā)明方法中。在植物上和/或植物中施加 組合物的方法是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的。在一個實(shí)施例中，該組合物可接種至植物的土壤中。在 另一個實(shí)施例中，通過在溶液培養(yǎng)基(hydroponic medium)中生長可將本發(fā)明組合物引入 植物的根或?qū)⑵鋰姙⒃谥参锏娜~片上。
[0074]本發(fā)明組合物可施加至植物的任何部分，包括通過利用合適的涂層機(jī)制(coating mechanism)或粘合劑將其施加至植物的種子。本發(fā)明組合物既可在種植前施加至植物，亦 可在種植期間引入植物的犁溝(furrow)。如另一個示例所示，本發(fā)明組合物可施加至植物 的根。本發(fā)明組合物可借助或不借助載體制備，其作為直接插入種植植物的犁溝中的單獨(dú) 接種物出售。
[0075]按照本發(fā)明的方法，發(fā)明組合物的有效量指足以建立足夠細(xì)菌生長的量，使得處 理過的植物達(dá)到所需結(jié)果。本發(fā)明組合物的有效量可通過本領(lǐng)域內(nèi)針對特定植物物種的已 知方法進(jìn)行測定。例如，接種本發(fā)明組合物可水培6天進(jìn)行，并在接種三天后更新細(xì)菌懸液。
[0076] 在一個實(shí)施例中，例如有效量可為每棵植物約IO1至約IO12個細(xì)胞間的任何量。在 另一個實(shí)施例中，有效量為細(xì)胞濃度約IO5至約1〇1() CFU/ml接種物，較優(yōu)選地為約IO6至IO8 CFU/ml之間，且最優(yōu)選地約為IO8 CFU/ml。仍在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明組合物可與土壤混 合，其量為每克土壤約IO5至IO1t3個細(xì)胞。
[0077]實(shí)施例
[0078]實(shí)施例1:腸桿菌638的分離和鑒定
[0079] 根和芽樣品采自10年（10-year-o Id)的在華盛頓州的實(shí)驗(yàn)場地于存在四氯化碳 (均勻地含12ppm)的環(huán)境下生長8年的雜交楊樹Hll-Il(毛果楊美洲黑楊）。另外，原生柳樹 (Salix gooddingii)材料采自5年的在存在三氯乙稀（18ppm)和四氯化碳（12ppm)的環(huán)境下 生長5年的原生植物。利用剪刀從植物上剪取插條，剪刀在切割時，需利用酒精進(jìn)行清洗，并 將剪刀放置在丙酮漂洗的易揮發(fā)的有機(jī)分析瓶中，為了可從場地裝運(yùn)將分析瓶放置在冰 上。分別對根和芽進(jìn)行處理。在蒸餾水中大力地清洗新鮮的根和芽樣品5min，在每IOOrnl溶 液附加1滴吐溫80的含1 % (重量/體積)活性氯化物(作為次氯酸鈉 [NaOCl ]溶液）的溶液中 表面滅菌5min并在無菌的蒸餾水中漂洗三次。將取自第三次漂洗的100μ1的水樣品平面接 種于869培養(yǎng)基（25)，以驗(yàn)證滅菌效率。滅菌后，利用Polytron PTl200均質(zhì)器(Kinematica A6)將根和芽在IOml的IOmM MgSO4中浸軟。然后進(jìn)行連續(xù)稀釋并將100μ1的樣品平板接種在 非選擇性的培養(yǎng)基上，以便檢驗(yàn)內(nèi)生菌的存在及其特性。
[0080] 在有氧條件下，從取自生長于其下含地下水并分別被四氯化碳或三氯乙烯和四氯 化碳污染的粉砂壤土中的雜交楊樹Hl 1-11和原生柳樹(Salix gooddingii)的表面滅菌的 根和莖樣品中分離出腸桿菌638。提取其全基因組DNA并用于擴(kuò)增16S rRNA基因。16S rRNA 基因利用標(biāo)準(zhǔn)6F-1392R引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增(Amann，1995)。
[0081 ]實(shí)施例2:針對楊樹的植物生長促進(jìn)特性的內(nèi)生細(xì)菌的篩選 [0082]借助30°C旋轉(zhuǎn)搖床上的1/10強(qiáng)度的869培養(yǎng)基(25)上生長的內(nèi)生細(xì)菌制備接種物 (250ml培養(yǎng)），直到細(xì)胞濃度達(dá)到IO 9 CFU/ml(l光密度在660nm[0D660])。通過離心法收集 細(xì)胞，并利用IOmM MgSO4對其沖洗兩遍，然后將其懸浮于1/10的原始體積(在IOmM MgSO4中） 中，從而獲得細(xì)胞濃度為1〇1() CFU/ml的接種物。檢測每個微生物菌株，對來自楊樹(美洲黑 楊X歐亞黑楊)DN-34的大約30cm的七個插條進(jìn)行稱重并將其放置在其中含0.5L半強(qiáng)度無 菌Hoagland營養(yǎng)液(5)的IL燒杯中，該營養(yǎng)液每3天更新一次。插條經(jīng)過約4周的生根后形成 根。隨后，在半強(qiáng)度Hoagland營養(yǎng)液中的最終濃度為IO 8 CFU/ml時向每個杯子加入細(xì)菌接 種物。孵育3天后，對插條進(jìn)行稱重，將其種植在有菌的砂土中并放置于溫度恒定在22°C且 進(jìn)行Hh光照-IOh黑暗循環(huán)的光合有效輻射為165mmol/m2s的溫室中。10周后，收獲植物并 測定其總生物量、其增加的生物量和不同植物組織的生物量。同樣收集未接種的對照植物 的數(shù)據(jù)。接種和未接種內(nèi)生菌的植物生長10周后，其生長指數(shù)計(jì)算為(M t-Mo)/Mo,其中Mo表 示0周時植物的重量(g)且Mt表示10周后植物的重量(g)。利用Dunnett檢驗(yàn)，結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué) 顯著性證實(shí)在5%水平。為了測定內(nèi)生細(xì)菌對楊樹DN-34生根的影響，按上描述除第一天開 始加入內(nèi)生菌接種物外，對插條進(jìn)行處理。
[0083]檢測分離自楊樹的腸桿菌638提高其宿主植物生長的能力以及在楊樹中發(fā)現(xiàn)的其 他內(nèi)生γ變形菌綱（gammaproteobacteria)。將洋蔥伯克霍爾德菌（BurkhoIderia cepacia)Bu72和耐金屬親銅菌（Cupriavidus metallidurans)CH34分別列為陽性和陰性對 照，洋蔥伯克霍爾德菌Bu72是最初從黃色羽扇豆分離出的被發(fā)現(xiàn)可對楊樹產(chǎn)生植物生長促 進(jìn)影響的內(nèi)生菌，耐金屬親銅菌CH34(也稱為Ral stonia metal lidurans CH34)是沒有已知 的植物生長促進(jìn)影響的典型的土壤細(xì)菌。同樣地，將未接種的插條用作對照。
[0084] 在水培條件(hydroponic condition)下形成根和隨后的內(nèi)生菌接種后，將楊樹 DN-34插條種植于邊緣砂土(marginal sandy soil)中，讓其生長10周，然后收獲植物并測