除草劑耐受性蛋白質的用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種除草劑耐受性蛋白質的用途，特別是涉及一種噻吩磺隆水解酶降 解吡嘧磺隆除草劑的用途。
【背景技術】
[0002] 雜草可以迅速耗盡土壤中作物和其它目的植物所需要的有價值的養(yǎng)分。目前有許 多類型的除草劑用于控制雜草，一種特別流行的除草劑是草甘膦。已經開發(fā)了對草甘膦具 有抗性的作物，如玉米、大豆、棉花、甜菜、小麥和水稻等。因此可以對種植草甘膦抗性作物 的田地噴灑草甘膦以控制雜草而不顯著損害作物。
[0003] 草甘膦已經在全球廣泛使用超過20年，由此導致對草甘膦和草甘膦耐性作物技術 的過度依賴，并在野生雜草物種中對草甘膦天然更具耐受性或已經發(fā)展出抗草甘膦活性的 植物施加了高選擇壓。已報道有少數雜草已發(fā)展出對草甘膦的抗性，包括闊葉雜草和禾本 科雜草，如瑞士黑麥草、多花黑麥草、牛筋草、豚草、小飛蓬、野塘蒿和長葉車前。此外，在廣 泛使用草甘膦耐性作物之前并不是農業(yè)問題的雜草也逐漸盛行，并且難于用草甘膦耐性作 物控制，這些雜草主要與(但不僅與）難于控制的闊葉雜草一起出現，如莧屬、藜屬、蒲公英 屬和鴨跖草科物種。
[0004] 在草甘膦抗性雜草或難于控制的雜草物種的地區(qū)，種植者可以通過罐混或換用能 控制遺漏雜草的其它除草劑來彌補草甘膦的弱點，如磺酰脲類除草劑。磺酰脲類除草劑已 經成為繼有機磷、乙酰胺類除草劑后的第三大除草劑，全球年銷售額達到30億美元以上，我 國磺酰脲類除草劑每年的應用面積已超過200萬公頃，并仍呈擴大的趨勢。
[0005] 隨著草甘膦抗性雜草的出現和磺酰脲類除草劑的擴大應用，需要對磺酰脲類除草 劑敏感的目的植物中輸入磺酰脲類除草劑耐受性。磺酰脲類除草劑可大致分為含酯鍵的和 不含酯鍵的，其中含酯鍵且化學結構相近的磺酰脲類除草劑至少有十余種。僅已鑒定了噻 吩磺隆水解酶可以降解噻吩磺隆，但和噻吩磺隆一樣，吡嘧磺隆也屬于含酯鍵的磺酰脲類 除草劑，而目前未發(fā)現噻吩磺隆水解酶對吡嘧磺隆除草劑具有耐受性的報道。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種除草劑耐受性蛋白質的用途，首次提供了將含有有效劑 量吡嘧磺隆的除草劑施加到存在至少一種表達噻吩磺隆水解酶的轉基因植物的植物生長 環(huán)境中以控制田間雜草生長的方法，增加了噻吩磺隆水解酶對除草劑的耐受范圍。
[0007] 為實現上述目的，本發(fā)明提供了一種控制雜草的方法，包括將含有有效劑量吡嘧 磺隆的除草劑施加到存在至少一種轉基因植物的植物生長環(huán)境中，所述轉基因植物在其基 因組中包含編碼噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列，所述轉基因植物與其他不具有編碼噻吩磺 隆水解酶的核苷酸序列的植物相比具有減弱的植物損傷和/或具有增加的植物產量。
[0008] 進一步地，所述有效劑量吡嘧磺隆為9_50g ai/ha。
[0009] 更進一步地，所述轉基因植物為單子葉植物或雙子葉植物。
[0010]優(yōu)選地，所述轉基因植物為玉米、大豆、擬南芥、棉花、油菜、水稻、高粱、小麥、大 麥、粟、甘鹿或燕麥。
[0011]在上述技術方案的基礎上，所述噻吩磺隆水解酶的氨基酸序列具有SEQ ID N0:1、 SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
[0012] 優(yōu)選地，所述噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列具有：
[0013] (a)編碼SEQIDN0:l、SEQIDN0:4或SEQIDN0:7所示的氨基酸序列的核苷酸序 列;或
[0014] (b)SEQIDN0:2或SEQIDN0:3所示的核苷酸序列；或
[0015] (c)SEQIDN0:5或SEQIDN0:6所示的核苷酸序列 ；或
[0016] (d)SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。
[0017] 進一步地，所述轉基因植物還可以包括至少一種不同于編碼所述噻吩磺隆水解酶 的核苷酸序列的第二種核苷酸。
[0018] 所述第二種核苷酸編碼選擇標記蛋白質、合成活性蛋白質、分解活性蛋白質、抗生 物脅迫蛋白質、抗非生物脅迫蛋白質、雄性不育蛋白質、影響植物產量的蛋白質和/或影響 植物品質的蛋白質。
[0019] 具體地，所述第二種核苷酸編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦氧化還 原酶、草甘膦-N-乙酰轉移酶、草甘膦脫羧酶、草銨膦乙酰轉移酶、α酮戊二酸依賴性雙加氧 酶、麥草畏單加氧酶、4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶、乙酰乳酸合酶、細胞色素類蛋白質和/或原 卟啉原氧化酶。
[0020] 可選擇地，所述含有有效劑量吡嘧磺隆的除草劑還包括草甘膦除草劑、草銨膦除 草劑、植物生長素類除草劑、禾本科除草劑、發(fā)芽前選擇性除草劑和/或發(fā)芽后選擇性除草 劑。
[0021] 為實現上述目的，本發(fā)明還提供了一種控制草甘膦耐受性雜草的方法，包括將有 效劑量的吡嘧磺隆除草劑和草甘膦除草劑施加到種植至少一種轉基因植物的大田中，所述 大田中包含草甘膦耐受性雜草或其種子，所述轉基因植物在其基因組中包含編碼噻吩磺隆 水解酶的核苷酸序列和編碼草甘膦耐受性蛋白質的核苷酸序列，所述轉基因植物與其他不 具有編碼噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列和/或編碼草甘膦耐受性蛋白質的核苷酸序列的植 物相比具有減弱的植物損傷和/或具有增加的植物產量。
[0022]進一步地，所述有效劑量吡嘧磺隆為9_50g ai/ha。所述有效劑量草甘膦為200-1600g ae/ha〇
[0023]更進一步地，所述轉基因植物為單子葉植物或雙子葉植物。
[0024]優(yōu)選地，所述轉基因植物為玉米、大豆、擬南芥、棉花、油菜、水稻、高粱、小麥、大 麥、粟、甘鹿或燕麥。
[0025]在上述技術方案的基礎上，所述噻吩磺隆水解酶的氨基酸序列具有SEQ ID N0:1、 SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
[0026]優(yōu)選地，所述噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列具有：
[0027] (a)編碼SEQIDN0:l、SEQIDN0:4或SEQIDN0:7所示的氨基酸序列的核苷酸序 列;或
[0028] (b)SEQIDN0:2或SEQIDN0:3所示的核苷酸序列；或
[0029] (c)SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；或
[0030] (d)SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。
[0031] 進一步地，所述草甘膦耐受性蛋白質包括5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘 膦氧化還原酶、草甘膦-N-乙酰轉移酶或草甘膦脫羧酶。
[0032]具體地，所述草甘膦耐受性蛋白質的氨基酸序列具有SEQ ID N0:10所示的氨基酸 序列。
[0033]優(yōu)選地，所述草甘膦耐受性蛋白質的核苷酸序列具有：
[0034] (a)編碼SEQ ID N0:10所示的氨基酸序列的核苷酸序列;或
[0035] (b)SEQ ID N0:11所示的核苷酸序列。
[0036]為實現上述目的，本發(fā)明還提供了一種控制雜草生長的種植系統，包括吡嘧磺隆 除草劑和存在至少一種轉基因植物的植物生長環(huán)境，將含有有效劑量的所述吡嘧磺隆除草 劑施加到所述存在至少一種轉基因植物的植物生長環(huán)境中，所述轉基因植物在其基因組中 包含編碼噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列，所述轉基因植物與其他不具有編碼噻吩磺隆水解 酶的核苷酸序列的植物相比具有減弱的植物損傷和/或具有增加的植物產量。
[0037] 進一步地，所述有效劑量吡啼磺隆為9_50g ai/ha。
[0038]更進一步地，所述轉基因植物為單子葉植物或雙子葉植物。
[0039]優(yōu)選地，所述轉基因植物為玉米、大豆、擬南芥、棉花、油菜、水稻、高粱、小麥、大 麥、粟、甘鹿或燕麥。
[0040]在上述技術方案的基礎上，所述噻吩磺隆水解酶的氨基酸序列具有SEQ ID N0:1、 SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
[0041 ]優(yōu)選地，所述噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列具有：
[0042] (a)編碼SEQIDN0:l、SEQIDN0:4或SEQIDN0:7所示的氨基酸序列的核苷酸序 列;或
[0043] (b)SEQIDN0:2或SEQIDN0:3所示的核苷酸序列；或
[0044] (c)SEQIDN0:5或SEQIDN0:6所示的核苷酸序列；或
[0045] (d)SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。
[0046] 進一步地，所述轉基因植物還可以包括至少一種不同于編碼所述噻吩磺隆水解酶 的核苷酸序列的第二種核苷酸。
[0047] 所述第二種核苷酸編碼選擇標記蛋白質、合成活性蛋白質、分解活性蛋白質、抗生 物脅迫蛋白質、抗非生物脅迫蛋白質、雄性不育蛋白質、影響植物產量的蛋白質和/或影響 植物品質的蛋白質。
[0048] 具體地，所述第二種核苷酸編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦氧化還 原酶、草甘膦-N-乙酰轉移酶、草甘膦脫羧酶、草銨膦乙酰轉移酶、α酮戊二酸依賴性雙加氧 酶、4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶、乙酰乳酸合酶、細胞色素類蛋白質和/或原卟啉原氧化酶。
[0049] 可選擇地，所述含有除草有效劑量吡嘧磺隆的除草劑還包括草甘膦除草劑、草銨 膦除草劑、植物生長素類除草劑、禾本科除草劑、發(fā)芽前選擇性除草劑和/或發(fā)芽后選擇性 除草劑。
[0050] 為實現上述目的，本發(fā)明還提供了一種控制草甘膦耐受性雜草的種植系統，包括 吡嘧磺隆除草劑、草甘膦除草劑和種植至少一種轉基因植物的大田，將有效劑量的所述吡 嘧磺隆除草劑和所述草甘膦除草劑施加到所述種植至少一種轉基因植物的大田中，所述大 田中包含草甘膦耐受性雜草或其種子，所述轉基因植物在其基因組中包含編碼噻吩磺隆水 解酶的核苷酸序列和編碼草甘膦耐受性蛋白質的核苷酸序列，所述轉基因植物與其他不具 有編碼噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列和/或編碼草甘膦耐受性蛋白質的核苷酸序列的植物 相比具有減弱的植物損傷和/或具有增加的植物產量。
[0051 ]進一步地，所述有效劑量吡嘧磺隆為9-50g ai/ha。所述有效劑量草甘膦為200-1600g ae/ha〇
[0052]更進一步地，所述轉基因植物為單子葉植物或雙子葉植物。
[0053]優(yōu)選地，所述轉基因植物為玉米、大豆、擬南芥、棉花、油菜、水稻、高粱、小麥、大 麥、粟、甘鹿或燕麥。
[0054]在上述技術方案的基礎上，所述噻吩磺隆水解酶的氨基酸序列具有SEQ ID N0:1、 SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
[0055]優(yōu)選地，所述噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列具有：
[0056] (a)編碼SEQIDN0:l、SEQIDN0:4或SEQIDN0:7所示的氨基酸序列的核苷酸序 列;或
[0057] (b)SEQIDN0:2或SEQIDN0:3所示的核苷酸序列；或
[0058] (c)SEQIDN0:5或SEQIDN0:6所示的核苷酸序列；或
[0059] (d)SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。
[0060] 進一步地，所述草甘膦耐受性蛋白質包括5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘 膦氧化還原酶、草甘膦-N-乙酰轉移酶或草甘膦脫羧酶。
[0061] 具體地，所述草甘膦耐受性蛋白質的氨基酸序列具有SEQ ID N0:10所示的氨基酸 序列。
[0062] 優(yōu)選地，所述草甘膦耐受性蛋白質的核苷酸序列具有：
[0063] (a)編碼SEQ ID N0:10所示的氨基酸序列的核苷酸序列;或
[0064] (b)SEQ ID N0:11所示的核苷酸序列。
[0065] 為實現上述目的，本發(fā)明還提供了一種產生耐受吡嘧磺隆除草劑的植物的方法， 包括向植物的基因組中引入編碼噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列，當含有有效劑量吡嘧磺隆 的除草劑施加到至少存在所述植物的大田中，所述植物與其他不具有編碼噻吩磺隆水解酶 的核苷酸序列的植物相比具有減弱的植物損傷和/或具有增加的植物產量。
[0066] 為實現上述目的，本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)耐受吡嘧磺隆除草劑的植物的方法， 包括：
[0067] 種植至少一個植物繁殖體，所述植物繁殖體的基因組中包括編碼噻吩磺隆水解酶 的多核苷酸序列；
[0068] 使所述植物繁殖體長成植株；
[0069] 將含有有效劑量吡嘧磺隆的除草劑施加到至少包含所述植株的植物生長環(huán)境中， 收獲與其他不具有編碼噻吩磺隆水解酶的多核苷酸序列的植株相比具有減弱的植物損傷 和/或具有增加的植物產量的植株。
[0070] 為實現上述目的，本發(fā)明還提供了一種保護植物免受由吡嘧磺隆除草劑引起的損 傷的方法，包括將含有有效劑量吡嘧磺隆的除草劑施加到存在至少一種轉基因植物的植物 生長環(huán)境中，所述轉基因植物在其基因組中包含編碼噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列，所述 轉基因植物與其他不具有編碼噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列的植物相比具有減弱的植物 損傷和/或具有增加的植物產量。
[0071] 為實現上述目的，本發(fā)明還提供了一種噻吩磺隆水解酶降解吡嘧磺隆除草劑的方 法，包括將含有有效劑量吡嘧磺隆的除草劑施加到存在至少一種轉基因植物的植物生長環(huán) 境中，所述轉基因植物在其基因組中包含編碼噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列，所述轉基因 植物與其他不具有編碼噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列的植物相比具有減弱的植物損傷和/ 或具有增加的植物產量。
[0072] 為實現上述目的，本發(fā)明還提供了一種噻吩磺隆水解酶降解吡嘧磺隆除草劑的用 途。
[0073] 具體地，所述噻吩磺隆水解酶降解吡嘧磺隆除草劑的用途包括將含有有效劑量吡 嘧磺隆的除草劑施加到存在至少一種轉基因植物的植物生長環(huán)境中，所述轉基因植物在其 基因組中包含編碼噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列，所述轉基因植物與其他不具有編碼噻吩 磺隆水解酶的核苷酸序列的植物相比具有減弱的植物損傷和/或具有增加的植物產量。 [0074]在上述技術方案的基礎上，所述噻吩磺隆水解酶的氨基酸序列具有SEQ ID N0:1、 SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
[0075]優(yōu)選地，所述噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列具有：
[0076] (a)編碼SEQIDN0:l、SEQIDN0:4或SEQIDN0:7所示的氨基酸序列的核苷酸序 列;或
[0077] (b)SEQIDN0:2或SEQIDN0:3所示的核苷酸序列；或
[0078] (c)SEQIDN0:5或SEQIDN0:6所示的核苷酸序列；或
[0079] (d)SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。
[0080] 本發(fā)明中所述轉基因植物在施用所述除草劑的21天內種植在所述植物生長環(huán)境 的土壤中?？蛇x擇地，所述除草劑可以在轉基因植物種植之前、同時或之后施用。具體地，所 述轉基因植物在施用所述除草劑之前12、10、7或3天內種植在土壤內；所述轉基因植物在施 用所述除草劑之后12、10、7或3天內種植在土壤內。所述除草劑還可以對所述轉基因植物進 行第二次處理，所述第二次處理可以為V1-V2和V3-V4階段之間、開花前、開花時、開花后或 種子形成時。
[0081 ] 本發(fā)明中所述吡啼磺隆(？7瓜2〇8111;1^11'〇11-61:1171)是指5-[(4,6-二甲氧基-2-啼啶 基)氨基羰基氨基磺?；鵠-1-甲基吡唑-4-羧酸乙酯，為白色固體。常用劑型為10%可濕性 粉劑，吡嘧磺隆的商業(yè)制劑包括但不限于草克星、水星、韓樂星、草滅星、草威、西力士和一 克凈。
[0082] 本發(fā)明中所述有效劑量吡嘧磺隆是指以9_50g ai/ha使用，包括10_50g ai/ha、 12_48g ai/ha、15_45g ai/ha、18_40g ai/ha、20_35g ai/ha或25_30g ai/ha。
[0083] 本發(fā)明中所述雙子葉植物包括但不限于苜蓿、菜豆、花椰菜、甘藍、胡蘿卜、芹菜、棉 花、黃瓜、茄子、萵苣、甜瓜、豌豆、胡椒、西萌蘆、蘿卜、油菜、菠菜、大豆、南瓜、番茄、擬南芥或 西瓜。優(yōu)選地，所述雙子葉植物是指大豆、擬南芥、棉花或油菜。
[0084] 本發(fā)明中所述單子葉植物包括但不限于玉米、水稻、高粱、小麥、大麥、黑麥、粟、甘 蔗、燕麥或草坪草。優(yōu)選地，所述單子葉植物是指玉米、水稻、高粱、小麥、大麥、粟、甘蔗或燕 麥。
[0085] 本發(fā)明中，所述除草劑耐受性蛋白質為噻吩磺隆水解酶，如序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:7所示。所述除草劑耐受性基因為編碼噻吩磺隆水解酶的核苷 酸序列，如序列表中SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8 和SEQ ID N0:9所示。所述除草劑耐受性基因為用于植物，除了包含噻吩磺隆水解酶的編碼 區(qū)外，也可包含其他元件，例如編碼選擇標記蛋白質、合成活性蛋白質、分解活性蛋白質、抗 生物脅迫蛋白質、抗非生物脅迫蛋白質、雄性不育蛋白質、影響植物產量的蛋白質和/或影 響植物品質的蛋白質，從而獲得既具有除草劑耐受性活性、又具有其它性狀的轉基因植物。
[0086] 本發(fā)明中所述抗生物脅迫蛋白質是指抵抗由其他生物所施加的脅迫的蛋白質，如 昆蟲抗性蛋白質、（病毒、細菌、真菌、線蟲)疾病抗性蛋白質等。
[0087] 本發(fā)明中所述抗非生物脅迫蛋白質是指抵抗外界環(huán)境所施加的脅迫的蛋白質，如 對除草劑、干旱、熱、寒冷、冰凍、鹽脅迫、氧化脅迫等具有耐性的蛋白質。
[0088] 本發(fā)明中所述影響植物品質的蛋白質是指影響植物輸出性狀的蛋白質，如改進淀 粉、油、維生素等質量和含量的蛋白質、提高纖維品質的蛋白質等。
[0089] 此外，包含編碼噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列的表達盒在植物中還可以與至少一 種編碼除草劑耐受性基因的蛋白質一起表達，所述除草劑耐受性基因包括但不限于，5-烯 醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、草甘膦氧化還原酶(G0X)、草甘膦-N-乙酰轉移酶 (GAT)、草甘膦脫羧酶、草銨膦乙酰轉移酶(ΡΑΤ)、α酮戊二酸依賴性雙加氧酶(AAD)、麥草畏 單加氧酶(DM0)、4_羥苯基丙酮酸雙加氧酶(ΗΡΗ))、乙酰乳酸合酶(ALS)、細胞色素類蛋白質 (P450)和/或原卟啉原氧化酶(Protox)。
[0090] 本發(fā)明中所述"草甘膦"是指N-膦酰甲基甘氨酸和它的鹽，用"草甘膦除草劑"處理 是指使用任何一種含有草甘膦的除草劑制劑進行處理。草甘膦的商業(yè)制劑包括但不限于， ROUNDUP? (作為異丙胺鹽的草甘膦）、ROUNDUP?WEATHERMAX(作為鉀鹽的草甘 膦）、ROUNDUP?DRY 和 RIVAL? (作為胺鹽的草甘膦）、R0IMDUP_geoforce(作為 鈉鹽的草甘膦)和TOUCHDOWN? (作為三甲基硫鹽的草甘膦）。
[0091] 本發(fā)明中所述有效劑量草甘膦是指以200-1600g ae/ha使用，包括250-1600g ae/ ha、300_1600g ae/ha、500_1600g ae/ha、800_1500g ae/ha、1000_1500g ae/ha或1200-1500g ae/ha〇
[0092] 本發(fā)明中所述"草銨膦"又名草丁膦，是指2-氨基-4-[羥基（甲基)