持續(xù)搖動孵育過夜。室溫以約8700 Xg離心10分鐘 沉淀細胞，棄去得到的上清液。將細胞沉淀輕柔重懸于500mL滲透培養(yǎng)基中，所述滲透培養(yǎng) 基含有1/2 XMS鹽/B5維生素、10% (w/v)蔗糖、0.044μΜ芐氨基嘌呤（10yL/L( lmg/mL DMS0中 的原液））和300yL/L Si 1 vet L-77。將約1月齡的植物在培養(yǎng)基中浸泡15秒，確保浸沒最新 的花序。接著將植物側(cè)面放倒并覆蓋(透明或不透明）24小時，接著用水洗滌并豎直放置。在 22°C以16小時光照/8小時黑暗的光周期培養(yǎng)植物。浸泡約4周后收獲種子。
[0180] 將新收獲的(ALT核苷酸序列)子在室溫干燥7天。將種子種在26.5 X51cm萌發(fā) 盤中，每盤接受200mgTi種子(約10000個種子），所述種子事先已懸浮于40mL 0.1 % (w/v)瓊 脂糖溶液并在4°C下保存2天以完成對休眠的需要以保證種子同步萌發(fā)。
[0181] 用蛭石混合馬糞土并用水地下灌溉至濕潤，利用重力排水。用移液管將預(yù)處理后 的種子(每個40mL)均勻地種在土壤混合物上，并用保濕罩覆蓋4-5天。在使用出苗后噴灑草 銨膦(選擇共轉(zhuǎn)化的PAT基因）進行最初轉(zhuǎn)化體選擇前1天移去罩。
[0182] 在7個種植天數(shù)后（DAP)并于11DAP再次使用DeVilbiss壓縮空氣噴嘴以10mL/盤 (703L/ha)的噴灑體積用Liberty除草劑(200g ai/L的草銨膦）的0.2%溶液噴灑!^植物(分 別為子葉期和2-4葉期），以提供每次應(yīng)用280g ai/ha有效量的草銨膦。在最后噴灑后4-7天 鑒定存活株(生長活躍的植物），并分別移植到用馬糞土和蛭石制備的7cm X7cm的方盆中（每 盤3-5棵）。用保濕罩覆蓋移植的植物3-4天，并如前置于22°C培養(yǎng)室中或直接移入溫室。接 著移去罩并在測試ALT基因提供吡嘧磺隆除草劑抗性的能力之前至少1天將植物栽種到溫 室（22 ± 5Γ，50 ± 30%RH，14小時光照：10小時黑暗，最小δΟΟμΕ/ιΑ1天然+補充光）。
[0183] 第四實施例、轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的除草劑耐受性效果檢測
[0184] 首先使用草銨膦選擇方案從未轉(zhuǎn)化種子背景中選擇1\轉(zhuǎn)化體。篩選了約 種子中并鑒定了380株1'1代陽性轉(zhuǎn)化子(PAT基因），約0.95%的轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化重組表達載 體DBN100632的為定位于胞質(zhì)的轉(zhuǎn)入ALT-1-01核苷酸序列的擬南芥植株(At胞質(zhì)ALT-1-01)，轉(zhuǎn)化重組表達載體DBN100631的為定位于葉綠體的轉(zhuǎn)入ALT-1-01核苷酸序列的擬南芥 植株(At葉綠體ALT-1-01);轉(zhuǎn)化重組表達載體DBN100634的為定位于胞質(zhì)的轉(zhuǎn)入ALT-2-01 核苷酸序列的擬南芥植株(At胞質(zhì)ALT-2-01)，轉(zhuǎn)化重組表達載體DBN100633的為定位于葉 綠體的轉(zhuǎn)入ALT-2-01核苷酸序列的擬南芥植株(At葉綠體ALT-2-01);轉(zhuǎn)化重組表達載體 DBN100636的為定位于胞質(zhì)的轉(zhuǎn)入ALT-3-01核苷酸序列的擬南芥植株(At胞質(zhì)ALT-3-01)， 轉(zhuǎn)化重組表達載體DBN100635的為定位于葉綠體的轉(zhuǎn)入ALT-3-01核苷酸序列的擬南芥植株 (At葉綠體ALT-3-01)。將At胞質(zhì)ALT-1-OU^Ti植株、At葉綠體ALT-1-OU^Ti植株、At胞質(zhì) 植株、At葉綠體植株、At胞質(zhì)植株、At葉綠體ALT-植株和野生型擬南芥植株(播種后14天)分別對吡嘧磺隆進行除草劑耐受性效果 檢測。
[0185] 分別將At胞質(zhì)ALT-1-OU^Ti植株、At葉綠體ALT-1-OU^Ti植株、At胞質(zhì)ALT-2-01的 T!植株、At葉綠體植株、At胞質(zhì)植株、At葉綠體ALT-3-01的^植 株和野生型擬南芥植株用吡嘧磺隆（25g ai/ha，1倍大田濃度)和空白溶劑（水)噴灑。噴施 14天后統(tǒng)計植株抗性情況：14天后生長狀況和空白溶劑(水)一致的劃為高抗植株，14天后 抽苔高度為低于1/2空白溶劑(水)抽苔高度的劃為中抗植株，14天后仍不能抽苔的劃為低 抗植株，14天后死亡的劃為不抗植株。由于每株擬南芥^植株是獨立的轉(zhuǎn)化事件，可以預(yù)計 在給定劑量內(nèi)個體!^應(yīng)答的顯著差異。結(jié)果如表1和圖4所示。
[0186] 表1、轉(zhuǎn)基因擬南芥?\植株對吡嘧磺隆除草劑耐受性實驗結(jié)果
[0187]
[0188] 對于擬南芥，25g ai/ha吡嘧磺隆除草劑是將敏感植物與具有平均抗性水平的植 物區(qū)分開來的有效劑量。表1和圖4的結(jié)果表明：噻吩磺隆水解酶(ALT-UALT-2和ALT-3)賦 予個體擬南芥植物吡嘧磺隆除草劑耐受性(有個別植株不具有耐受性的原因是由于Ti代植 物插入位點是隨機的，因而耐受性基因的表達水平有差異，表現(xiàn)出耐受性水平的差異）；相 比于At胞質(zhì)ALT-1-OU^Ti植株、At胞質(zhì)植株和At胞質(zhì)植株，At葉 綠體ALT-1-OU^Ti植株、At葉綠體植株和At葉綠體植株能夠產(chǎn) 生更高的吡嘧磺隆除草劑耐受性，表明所述噻吩磺隆水解酶(ALT-UALT-2和ALT-3)基因定 位于葉綠體中表達可以增強擬南芥植物對吡嘧磺隆除草劑的耐受性;而野生型擬南芥植株 則不具有對吡嘧磺隆除草劑的耐受性。
[0189] 第五實施例、對于不同的磺酰脲類除草劑具有預(yù)料不到的技術(shù)效果
[0190] 所述噻吩磺隆水解酶亦可稱為磺酰脲類除草劑去酯酶，其通過水解酯鍵而使具有 酯鍵的磺酰脲類除草劑(如噻吩磺隆等)降解為無除草劑活性的母酸類物質(zhì)，因而其不能降 解無酯鍵的磺酰脲類除草劑(如煙嘧磺隆、氯磺隆等）?，F(xiàn)有技術(shù)中具有酯鍵且結(jié)構(gòu)相近的 磺酰脲類除草劑很多，如苯磺隆、碘甲磺隆、環(huán)氧嘧磺隆、甲基二磺?。谆前坊锹。?、吡嘧磺 隆、甲嘧磺隆、氯吡嘧磺隆等。
[0191] 將第四實施例中At胞質(zhì)ALT-1-OU^Ti植株、At葉綠體ALT-1-OU^Ti植株、At胞質(zhì) 植株、At葉綠體植株、At胞質(zhì)植株、At葉綠體ALT-3-0^91^植株和野生型擬南芥植株除了用吡嘧磺?。?5g ai/ha，1倍大田濃度)和空白溶劑 (水)噴灑外，也分別用碘甲磺?。╨〇g ai/ha，1倍大田濃度）、甲基二磺隆（14g ai/ha，1倍大 田濃度)和環(huán)氧嘧磺?。?0g ai/ha，l倍大田濃度)噴灑。噴施14天后統(tǒng)計植株抗性情況：14 天后生長狀況和空白溶劑(水)一致的劃為高抗植株，14天后抽苔高度為低于1/2空白溶劑 (水)抽苔高度的劃為中抗植株，14天后仍不能抽苔的劃為低抗植株，14天后死亡的劃為不 抗植株。由于每株擬南芥^植株是獨立的轉(zhuǎn)化事件，可以預(yù)計在給定劑量內(nèi)個體1^應(yīng)答的顯 著差異。結(jié)果如表2和圖4所示。
[0192] 表2、轉(zhuǎn)基因擬南芥?\植株對磺酰脲類除草劑耐受性實驗結(jié)果
[0193]
[0194]
[0195] 表2比較了 ALT-1、ALT-2和ALT-3輸入噻吩磺隆水解酶活性到擬南芥^植株的應(yīng) 答。雖然所有轉(zhuǎn)化的擬南芥Ti植株被賦予了噻吩磺隆水解酶活性，但是在給定的處理(碘甲 磺隆、甲基二磺隆和環(huán)氧嘧磺?。┲?，所有轉(zhuǎn)化的擬南芥Ti植株均未表現(xiàn)出具有降解上述磺 酰脲類除草劑的能力，所有轉(zhuǎn)化的擬南芥Ti植株(ALT-1、ALT-2和ALT-3)的損傷程度和野生 型擬南芥植株之間無任何差異。
[0196] 表2充分說明表1的結(jié)果是預(yù)料不到的。雖然吡嘧磺隆與碘甲磺隆、環(huán)氧嘧磺隆和 甲基二磺隆均為具有酯鍵且化學(xué)結(jié)構(gòu)相近的磺酰脲類除草劑，且給定的處理也是具有可比 性的（1倍大田濃度），同時噻吩磺隆水解酶(ALT-1、ALT-2和ALT-3)在植物個體中已以預(yù)期 水平輸入并表達，然而表達噻吩磺隆水解酶的植物不具有降解碘甲磺隆、甲基二磺隆和環(huán) 氧嘧磺隆的能力，也不能保護其自身免受上述磺酰脲類除草劑的損傷，與野生型植株的表 現(xiàn)無任何差異，這些數(shù)據(jù)足以證實:所述噻吩磺隆水解酶(ALT-UALT-2和ALT-3)賦予植物 對吡嘧磺隆除草劑耐受性是難以預(yù)料的。
[0197] 第六實施例、大豆重組表達載體的構(gòu)建及重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0198] 1、構(gòu)建含有ALT核苷酸序列的大豆重組表達載體
[0199] 用限制性內(nèi)切酶Spel和KasI、NcoI和FspI分別酶切重組克隆載體DBN01-T、DBN04-T和表達載體DBNBC-02(載體骨架:pCAMBIA2301(CAMBIA機構(gòu)可以提供）），將切下的ALT-1-01核苷酸序列和EPSPS核苷酸序列片段分別插到表達載體DBNBC-02的Spel和KasI、NcoI和 FspI位點之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表 達載體DBN100828(定位于胞質(zhì)），其構(gòu)建流程如圖5所示(Spec:壯觀霉素基因；RB:右邊界； prAtUbilO:擬南芥Ubiquitin(泛素）10基因啟動子(SEQ ID N0:12);ALT-1-01:ALT-1-01 核 苷酸序列（SEQ ID N0:2);tN〇S:胭脂堿合成酶基因的終止子（SEQ ID N0:13);prBrCBP:油 菜真核延長因子基因 la(Tsfl)啟動子（SEQ ID N0:18);spAtCTP2:擬南芥葉綠體轉(zhuǎn)運肽 (SEQ ID N0:17);EPSPS:5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因 （SEQ ID N0:ll);tPsE9:豌 豆RbcS基因的終止子(SEQ ID N0:19);LB:左邊界）。
[0200] 按照第二實施例中2的方法將重組表達載體DBN100828用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 T1感受態(tài)細胞，并堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Spel和KasI酶切后鑒定， 并將陽性克隆進行測序鑒定，結(jié)果表明重組表達載體DBN100828在Spel和KasI位點間的核 苷酸序列為序列表中SEQ ID N0:2所示核苷酸序列，即ALT-1-01核苷酸序列。
[0201]按照上述構(gòu)建重組表達載體DBN100828的方法，構(gòu)建含有ALT-1-01核苷酸序列的 重組表達載體DBN100827(定位于葉綠體），其載體結(jié)構(gòu)如圖6所示(載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機構(gòu)可以提供）；Spec:壯觀霉素基因；RB:右邊界;prAtUbilO:擬南芥Ubiquitin(泛 素）1〇基因啟動子（SEQ ID N0:12);spAtCTP2:擬南芥葉綠體轉(zhuǎn)運肽（SEQ ID N0:17);ALT-1-01:ALT-1-01核苷酸序列（SEQ ID N0:2);tNos:胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID NO: 13);prBrCBP:油菜真核延長因子基因 la(Tsfl)啟動子（SEQ ID N0:18);spAtCTP2:擬南芥 葉綠體轉(zhuǎn)運肽(SEQ ID NO: 17) ;EPSPS:5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因 （SEQ ID NO: ll);tPsE9:豌豆RbcS基因的終止子（SEQ ID N0:19);LB:左邊界）。對陽性克隆進行測序驗 證，結(jié)果表明重組表達載體DBN100827中插入的ALT-1-01核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列，即ALT-1-01核苷酸序列正確插入。
[0202] 按照上述構(gòu)建重組表達載體DBN100828的方法，將Spel和KasI、NcoI和FspI酶切重 組克隆載體DBN02-T和DBN04-T切下的所述ALT-2-01核苷酸序列和EPSPS核苷酸序列插入表 達載體DBNBC-02,得到重組表達載體DBN100826。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100826 中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:ll所示核苷酸序列，g卩ALT-2-01核苷酸序列和EPSPS核苷酸序列正確插入。
[0203] 按照上述構(gòu)建重組表達載體DBN100827的方法，將Spel和KasI、NcoI和FspI酶切重 組克隆載體DBN02-T和DBN04-T切下的所述ALT-2-01核苷酸序列和EPSPS核苷酸序列插入表 達載體DBNBC-02,得到重組表達載體DBN100825(含有spAtCTP2,定位于葉綠體）。酶切和測 序驗證重組表達載體DBN100825中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID N0:5和SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列，即ALT-2-01核苷酸序列和EPSPS核苷酸序列正確插入。
[0204] 按照上述構(gòu)建重組表達載體DBN100828的方法，將Spel和KasI、NcoI和FspI酶切重 組克隆載體DBN03-T和DBN04-T切下的所述ALT-3-01核苷酸序列和EPSPS核苷酸序列插入表 達載體DBNBC-02,得到重組表達載體DBN100824。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100824 中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:11所示核苷酸序列，即ALT-3-01 核苷酸序列和 EPSPS 核苷酸序列正確插入。
[0205] 按照上述構(gòu)建重組表達載體DBN100827的方法，將Spel和KasI、NcoI和FspI酶切重 組克隆載體DBN03-T和DBN04-T切下的所述ALT-3-01核苷酸序列和EPSPS核苷酸序列插入表 達載體DBNBC-02,得到重組表達載體DBN100823(含有spAtCTP2,定位于葉綠體）。酶切和測 序驗證重組表達載體DBN100823中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID N0:8和SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列，即ALT-3-01核苷酸序列和EPSPS核苷酸序列正確插入。
[0206] 2、重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0207]對己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達載體 DBN100828、DBN100827、DBN100826、DBN100825、 DBN100824 和 DBN100823 用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌 LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA，CAT: 18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為：100yL農(nóng)桿菌LBA4404、3yL質(zhì)粒DNA(重組表達載體）；置于液 氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28°C、 轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和50mg/L的壯觀霉 素的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶進行 酶切驗證，結(jié)果表明重組表達載體DBN100828、DBN100827、DBN100826、DBN100825、 DBN100824和DBN100823結(jié)構(gòu)完全正確。
[0208]第七實施例、轉(zhuǎn)基因大豆植株的獲得和驗證 [0209] 1、獲得轉(zhuǎn)基因大豆植株
[0210]按照常規(guī)采用的農(nóng)桿菌侵染法，將無菌培養(yǎng)的大豆品種中黃13的子葉節(jié)組織與第 六實施例中2所述的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，以將第六實施例中1構(gòu)建的重組表達載體DBN100828、 DBN100827、DBN100826、DBN100825、DBN100824 和 DBN100823 中的 T-DNA(包括擬南芥 UbiquitinlO基因的啟動子序列、ALT-1-01核苷酸序列、ALT-2-01核苷酸序列、ALT-3-01核 苷酸序列、tNos終止子、油菜真核延長因子基因 Ια啟動子、擬南芥葉綠體轉(zhuǎn)運肽、5-烯醇丙 酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因、豌豆RbcS基因的終止子)轉(zhuǎn)入到大豆染色體組中，獲得了轉(zhuǎn) 化重組表達載體DBN100828的為定位于胞質(zhì)的轉(zhuǎn)入ALT-1-01核苷酸序列的大豆植株(Gm胞 質(zhì)ALT-1-01)，轉(zhuǎn)化重組表達載體DBN100827的為定位于葉綠體的轉(zhuǎn)入ALT-1-01核苷酸序列 的大豆植株(Gm葉綠體ALT-1-01);轉(zhuǎn)化重組表達載體DBN100826的為定位于胞質(zhì)的轉(zhuǎn)入 ALT-2-01核苷酸序列的大豆植株(Gm胞質(zhì)ALT-2-01)，轉(zhuǎn)化重組表達載體DBN100825的為定 位于葉綠體的轉(zhuǎn)入ALT-2-01核苷酸序列的大豆植株(Gm葉綠體ALT-2-01);轉(zhuǎn)化重組表達載 體DBN100824的為定位于胞質(zhì)的轉(zhuǎn)入ALT-3-01核苷酸序列的大豆植株(Gm胞質(zhì)ALT-3-01)， 轉(zhuǎn)化重組表達載體DBN100823的為定位于葉綠體的轉(zhuǎn)入ALT-3-01核苷酸序列的大豆植株 (Gm葉綠體ALT-3-01);同時以野生型大豆植株作為對照。
[0211]對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)化，簡要地，將成熟的大豆種子在大豆萌發(fā)培養(yǎng)基(B5鹽 3. lg/L，B5維他命，鹿糖20g/L，瓊脂8g/L，pH5.6)中進行萌發(fā)，將種子接種于萌發(fā)培養(yǎng)基上， 按以下條件培養(yǎng):溫度25±1°C;光周期(光/暗)為16/8h。萌發(fā)4-6天后取鮮綠的子葉節(jié)處膨 大的大豆無菌苗，在子葉節(jié)下3-4毫米處切去下胚軸，縱向切開子葉，去頂芽、側(cè)芽和種子 根。用解剖刀的刀背在子葉節(jié)處進行創(chuàng)傷，用農(nóng)桿菌懸浮液接觸創(chuàng)傷過的子葉節(jié)組織，其中 農(nóng)桿菌能夠?qū)⑺鯝LT-1-01核苷酸序列、ALT-2-01核苷酸序列、ALT-3-01核苷酸序列傳遞 至創(chuàng)傷過的子葉節(jié)組織(步驟1:侵染步驟)在此步驟中，子葉節(jié)組織優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮 液(0D 66Q = 0 · 5-0 · 8，侵染培養(yǎng)基(MS鹽2 · 15g/L、B5維他命、鹿糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁 香酮(AS)40mg/L、2-嗎啉乙磺酸(MES)4g/L、玉米素(ZT)2mg/L，pH5.3)中以啟動接種。子葉 節(jié)組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時期(3天）（步驟2:共培養(yǎng)步驟）。優(yōu)選地，子葉節(jié)組織在侵染步 驟后在固體培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、B5維他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、2-嗎啉乙磺酸(MES) 4g/L、玉米素2mg/L、瓊脂8g/L，pH5.6)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，可以有一個選擇性的"恢 復(fù)"步驟。在"恢復(fù)"步驟中，恢復(fù)培養(yǎng)基(B5鹽3.1g/L、B5維他命、2-嗎啉乙磺酸(MES)lg/L、 鹿糖30g/L、玉米素（ZT)2mg/L、瓊脂8g/L，頭孢霉素150mg/L，谷氨酸100mg/L，天冬氨酸 100mg/L，pH5.6)中至少存在一種己知抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素(頭孢霉素），不添加植物轉(zhuǎn) 化體的選擇劑(步驟3:恢復(fù)步驟）。優(yōu)選地，子葉節(jié)再生的組織塊在有抗生素但沒有選擇劑 的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細胞提供恢復(fù)期。接著，子葉節(jié)再生的組織塊 在含選擇劑(草甘膦)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長著的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟4:選擇步驟）。優(yōu) 選地，子葉節(jié)再生的組織塊在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基(B5鹽3.1 g/L、B5維他命、2-嗎啉 乙磺酸(MES)lg/L、蔗糖30g/L、6-芐基腺嘌呤（6-BAP)lmg/L、瓊脂8g/L，頭孢霉素150mg/L， 谷氨酸l〇〇mg/L，天冬氨酸100mg/L，N-(膦羧甲基)甘氨酸0.25111〇1/1^!15.6)上培養(yǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn) 化的細胞選擇性生長。然后，轉(zhuǎn)化的細胞再生成植物(步驟5:再生步驟），優(yōu)選地，在含選擇 劑的培養(yǎng)基上生長的子葉節(jié)再生的組織塊在固體培養(yǎng)基(B5分化培養(yǎng)基和B5生根培養(yǎng)基） 上培養(yǎng)以再生植物。
[0212] 篩選得到的抗性組織塊轉(zhuǎn)移到所述B5分化培養(yǎng)基(B5鹽3. lg/L、B5維他命、2-嗎啉 乙磺酸(MES)lg/L、蔗糖30g/L、玉米素（ZT)lmg/L、瓊脂8g/L、頭孢霉素150mg/L、谷氨酸 50mg/L、天冬氨酸50mg/L、赤霉素 lmg/L、生長素 lmg/L、N-(膦羧甲基）甘氨酸0 · 25mol/L， pH5.6)上，25 °C下培養(yǎng)分化。分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到所述B5生根培養(yǎng)基(B5鹽3.1 g/L、B5維 他命、2-嗎啉乙磺酸(MES)lg/L、蔗糖30g/L、瓊脂8g/L、頭孢霉素150mg/L、吲哚-3-丁