本發(fā)明屬于水產食品精深加工領域，涉及鮑魚內臟有效成分的提取，特別涉及一種高壓脈沖電場偶聯生物酶解制備鮑魚內臟磷脂的方法，同時得到蛋白、多糖和色素。

背景技術：

鮑魚（abalone）又名鰒、鰒魚，是種單殼軟體具有很高營養(yǎng)價值的海洋貝類。每1000 g新鮮鮑肉中含蛋白質350~500 g、碳水化合物240~380 g、脂質80~220 g，并含有多種的維生素與微量元素?！侗静菥V目》中記載，鮑魚性平，味甘、咸，有明目補虛、清熱滋陰、養(yǎng)血益胃、滋補肝腎的作用，是一種具有較高營養(yǎng)價值與藥用價值的海產品之一。

2011年我國的鮑魚年產量達到6.5萬噸，2015年達到12.8萬噸，鮑魚產業(yè)增長迅猛。長期以來，我國的鮑魚深加工與使用大部分以腹足為主，在加工過程中，占鮑魚總重量約25%左右的內臟被丟棄，極少部分被加工成飼料。鮑魚內臟中含有豐富的蛋白質、脂質、碳水化合物和維生素等營養(yǎng)素及一些生物活性物質，大量的鮑魚內臟被丟棄，得不到充分利用，不僅造成經濟損失，而且給環(huán)境帶來污染。

目前對鮑魚內臟的研究主要集中在牲畜飼料的加工，對其營養(yǎng)價值與藥用價值的開發(fā)較少。鮑魚內臟中含較多磷脂，能顯著提高人體免疫力、提高大腦活力，并且能有效防治高血脂、高血壓等心腦血管疾??；鮑魚內臟中的多糖具有抗氧化、抗腫瘤、增強機體免疫等活性；鮑魚內臟中的膠原蛋白具有良好的降血壓功能、預防關節(jié)炎功能、保護胃粘膜以及促進皮膚膠原代謝等功能；因此，鮑魚內臟具有很強的營養(yǎng)、藥用開發(fā)價值與潛力。

公開號為CN 101912027A的發(fā)明專利“一種復合酶解鮑魚內臟制備蛋白水解液的方法”公開了一種以鮑魚內臟為原料，通過堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的復合酶解、乙基麥芽酚屏蔽苦味等技術制備了蛋白水解液。該發(fā)明制備的蛋白質水解液富含氨基酸、營養(yǎng)豐富、風味鮮美，但僅對鮑魚內臟中單一成分進行利用，未能顯著提高鮑魚內臟的經濟價值。公開號為CN 103255186A的發(fā)明專利“鮑魚多糖、脂質和蛋白肽的聯產制備方法”，是以鮑魚內臟為原料，通過復合酶解、膜分離、醇沉等手段提取制備鮑魚多糖、脂質和蛋白肽，改進了傳統(tǒng)技術對原料利用不充分的缺點，但制備得到的組分較為單一，純度不高，脂質與蛋白多肽尚未完全分離，制備效率低，且未能充分利用鮑魚內臟殘渣，不足以最大化實現鮑魚內臟的高值化利用，造成一定程度的資源浪費。

高壓脈沖電場（Pulsed Electric Field，簡稱PEF），PEF技術能增加細胞滲透性，提高被提取物質的溶出，偶聯生物酶解可有效提高鮑魚內臟有效成分溶物，增加其有效利用率。因此，PEF偶聯生物酶解技術開發(fā)一種鮑魚內臟磷脂提取與綜合利用的方法，不僅能制備鮑魚內臟磷脂，同時得到鮑魚內臟中性磷脂、糖脂、色素、蛋白、粗多糖等單一成分，且有效解決鮑魚內臟殘渣的問題，提高鮑魚內臟活性成分的制備率，實現鮑魚內臟的高值化利用，減少環(huán)境污染、節(jié)約加工成本，同時實現鮑魚內臟的回收利用，大大提高鮑魚加工業(yè)的產值，從而帶動與促進海產品加工業(yè)的發(fā)展。

技術實現要素：

本發(fā)明目的在于針對現有技術存在的問題提供一種鮑魚內臟磷脂提取和綜合利用的方法，本方法以鮑魚加工過程中的副產物——鮑魚內臟為原料，主要通過PEF偶聯生物酶解技術制備鮑魚內臟中磷脂，同時得到蛋白、多糖和糖脂等單一組分，并解決鮑魚殘渣的問題。以解決上述技術存在的問題并實現鮑魚產業(yè)的高值化利用，從而減少鮑魚副產物的資源浪費，提高鮑魚加工業(yè)的附加值，實現資源的回收利用。

為實現上述目的，本發(fā)明提供一種鮑魚內臟磷脂提取與綜合利用的方法，主要包括以下步驟：

1）原理預處理：將清洗干凈的鮑魚內臟按固液重量比1：5~1：10加入蒸餾水，并用高速組織搗碎機，轉速10000r/min將其打漿；

2）PEF與酶解：絞成漿后的鮑魚內臟置于配料缸，進行15~20 min的高壓脈沖電場處理；用0.2 M PBS緩沖溶液調pH至5.5~8.0，加入復合蛋白酶，40~55 ℃酶解1~3 h，90℃滅酶10~20 min；4000 rpm離心10~20 min收集鮑魚內臟提取物的上清液A，不溶物經60~70 ℃的熱風干燥加工成適宜牲畜飼料；

3）脂質提?。河谜和榻?）收集到的上清液A，萃取得到鮑魚總脂和水溶液B；總脂用3~6倍體積丙酮洗滌，得到丙酮不溶物用少量甲醇溶解，-20 ℃?zhèn)溆茫?/p>

4）磷脂分離：將3）提取到的丙酮不溶物裝入制備硅膠層析柱，分別用8~12倍體積的氯仿、丙酮和甲醇沖洗，收集洗脫液，進行旋蒸；

5）蛋白分離：調節(jié)步驟3）收集到的水溶液B的pH至5.0~5.5，4000 rpm離心10-20 min沉淀蛋白，冷凍干燥，備用；收集上清液C；

6）鮑魚多糖提取：將步驟5）獲得的上清液C濃縮，按3-8倍體積加入95wt%乙醇，4 ℃下沉淀10~12 h，4000 rpm離心10~20 min獲得多糖沉淀；將多糖重新溶解于蒸餾水，95wt%乙醇反復醇沉3-5次，收集沉淀物，冷凍干燥得到鮑魚多糖；

所述PEF處理參數：電場強度20~40 KV/cm，脈沖時間350~450μS，脈沖頻率200-400Hz；

所述復合蛋白酶：AS.1398中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的一種或多種組合，總添加量為原料重量的0.1~1%；

所述磷脂分離是在步驟3）中經萃取得到鮑魚內臟總脂，以甲醇為洗脫液經硅膠柱層析分離得到磷脂，同時使用氯仿、丙酮作為洗脫液，得到中性脂肪、糖脂和色素；

所述工藝步驟在PEF處理后，鮑魚內臟遭到不可逆破壞，細胞通透性增大，內容物溶出；經蛋白生物酶解，硅膠柱層析技術可得到純度較高的磷脂，同時還制備得到鮑魚內臟的中性脂肪、糖脂和色素；經過蛋白析出、多糖醇沉可分離得到鮑魚內臟粗蛋白和多糖，有效提高鮑魚內臟提取物得率；

所述工藝步驟制備得到鮑魚內臟磷脂、糖脂、色素蛋白、多糖和磷脂或其中的任意一個產品，并將鮑魚內臟殘渣加工成適宜牲畜食用的飼料。

上述分步制備鮑魚內臟磷脂與鮑魚內臟的綜合利用，采用PEF偶聯生物酶解技術，通過硅膠柱層析制備鮑魚內臟磷脂，同時得到糖脂和色素等；鮑魚蛋白通過等電點沉淀析出、多糖醇沉得到鮑魚內臟蛋白、粗多糖，相比于現有鮑魚加工業(yè)技術至少具有下列有點：

1. 該發(fā)明利用PEF偶聯生物酶解技術、硅膠柱層析制備技術等實現了鮑魚內臟中磷脂、蛋白和多糖等多種單一組分的高效提取，減少鮑魚加工過程中副產物的排放，提高制備效率，實現節(jié)約成本、節(jié)省能耗，提高鮑魚的附加值；

2. 該發(fā)明綠色加工技術，制備得到的鮑魚內臟磷脂、蛋白、多糖和色素等來源安全、無毒，無化學試劑的污染，符合國家食品安全標準，可廣泛應用于食品加工中的功能性食品以及藥用加工等領域；

3. 該發(fā)明不僅解決鮑魚內臟中營養(yǎng)與藥用成分的提取，且將鮑魚不溶物經60~70 ℃熱風干燥加工成適宜牲畜食用的飼料，形成較為完整的生產體系，易產業(yè)化；

4. 該發(fā)明可有效應用于鮑魚加工業(yè)中副產物的回收利用，可形成鮑魚內臟副產物的加工生產線，提高產業(yè)附加值，帶動海產品加工業(yè)大發(fā)展；

5. 該發(fā)明實現副產物鮑魚內臟廢物資源化，設備簡單，操作簡便，生產工藝條件較易控制，具有良好的實用性和應用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明PEF與生物酶解偶聯方法制備鮑魚內臟磷脂的工藝流程圖。

具體實施方式

為更好地理解本發(fā)明，以下結合具體實施例來進一步說明本發(fā)明的技術方案，但以下實施例僅屬于本發(fā)明范疇，卻并不局限于此。

實施例1

一種PEF與生物酶解偶聯制備鮑魚內臟磷脂的方法包括以下步驟：

1）原理預處理：將500 g清洗干凈的鮑魚內臟按1：5的固液重量比比加入蒸餾水，并用高速組織搗碎機，轉速10000r/min將其打漿；

2）PEF與酶解：絞成漿后的鮑魚內臟置于配料缸，進行17 min的高壓脈沖電場處理，電場強度30 KV/cm，脈沖時間378 μS，脈沖頻率296 Hz；然后用0.2 M PBS緩沖溶液調pH至6.8，加入比例為AS.1398中性蛋白酶：木瓜蛋白酶：胰蛋白酶=1：1：1的復合蛋白酶3 g，在45 ℃下酶解2 h，90 ℃滅酶15 min；4000 rpm離心13 min收集鮑魚內臟提取物的上清液A 2255 mL，不溶物經65 ℃的熱風干燥加工成適宜牲畜食用的飼料 251 g；

3）磷脂提取：將步驟2）收集到的上清液A靜置12 h，萃取上層油狀液體，得到鮑魚總脂質83 g；用200 mL丙酮洗滌得到丙酮不溶物43 g，用10ml甲醇溶解丙酮不溶物，然后分別以100 mL甲醇、100 mL氯仿、100 mL丙酮為洗脫液通過硅膠層析柱制備得到16.6 g磷脂、19.1 g糖脂和0.92 g色素；

4）蛋白質分離：將步驟3）萃取去總脂質后的水溶液B調節(jié)pH至5.17，4000 rpm離心15 min收集上清液C 1762 mL；沉淀通過冷凍干燥，得到白色蛋白118 g；

5）鮑魚多糖提取：將步驟4）獲得的上清液C濃縮至500 mL，按4倍體積加入95wt%乙醇，4 ℃下沉淀11 h，4000 rpm離心15 min獲得多糖沉淀，將初次醇沉得到的多糖重新溶解于200 mL蒸餾水，加入500 mL 95wt%乙醇反復醇沉3次，收集沉淀物，冷凍干燥得到鮑魚多糖103 g；

鮑魚內臟含有約蛋白350~500 g、碳水化合物240~380 g、脂質80~220 g。通過PEF偶聯生物酶解技術提取鮑魚內臟活性成分，可依次提取到磷脂16.6 g，19.1 g糖脂和0.92 g色素，蛋白118 g，多糖103 g，說明一種鮑魚內臟磷脂提取與綜合利用的方法能有效提取鮑魚內臟活性成分。

實施例2

一種PEF與生物酶解偶聯制備鮑魚內臟磷脂的方法包括以下步驟：

1）原理預處理：將500 g清洗干凈的鮑魚內臟按加入4000 mL蒸餾水，并用高速組織搗碎機，轉速10000r/min將其打漿；

2）PEF與酶解：絞成漿后的鮑魚內臟置于配料缸，進行20 min的高壓脈沖電場處理，電場強度34 KV/cm，脈沖時間450 μS，脈沖頻率312 Hz；然后用0.2 M PBS緩沖溶液調pH至6.3，加入比例為AS.1398中性蛋白酶：木瓜蛋白酶：胰蛋白酶=1：0.5：0.8的復合蛋白酶5 g，在45 ℃下酶解2.5 h，90 ℃滅酶15 min；4000 rpm離心15 min收集鮑魚內臟提取物的上清液A 3180 mL，不溶物經65 ℃的熱風干燥加工成適宜牲畜食用的飼料 293 g；

3）磷脂提?。簩⒉襟E2）收集的上清液A靜置15 h，萃取上層油狀液體，得到鮑魚總脂質76.5 g；用350 mL丙酮洗滌得到丙酮不溶物41.6 g，用15ml甲醇溶解丙酮不溶物，然后分別以150 mL甲醇、150 mL氯仿、150 mL丙酮為洗脫液通過硅膠層析柱制備得到16.1 g磷脂、17.8 g糖脂和0.85 g色素；

4）蛋白質分離：將步驟3）萃取去總脂質的上清液B調節(jié)pH至5.17，4000 rpm離心15 min收集上清液C 3310 mL；沉淀通過冷凍干燥，得到白色蛋白112 g；

5）鮑魚多糖提?。簩⒉襟E4）獲得的上清液C濃縮至500 mL，加入3000 mL 95wt%乙醇，4 ℃下沉淀13 h，4000 rpm離心15 min獲得鮑魚內臟粗多糖；將初次醇沉得到的粗多糖重新溶解于150 mL蒸餾水，加入450 mL 95wt%乙醇反復醇沉5次，收集沉淀物，冷凍干燥得到鮑魚多糖107 g；

分別稱取500 g清洗干凈的鮑魚內臟按加入4000 mL蒸餾水，并用高速組織搗碎機，轉速10000r/min將其打漿。① 將漿體靜置2.5 h，抽濾除去鮑魚內臟水不溶物，并將其進行熱風干燥；濾液操作與本實施例2的步驟（3）~（5）一致；② 將漿體置于功率350 W、頻率28 KHz、溫度45 ℃下超聲輔助提取10 min，并靜置2.67 h，抽濾除去鮑魚內臟水不溶物，并將其進行熱風干燥；濾液操作與本實施例2的步驟（3）~（5）一致；③ 將漿體靜置十分鐘，然后用0.2 M PBS緩沖溶液調pH至6.3，加入比例為AS.1398中性蛋白酶：木瓜蛋白酶：胰蛋白酶=1：0.5：0.8的復合蛋白酶6 g，45 ℃酶解2.5 h，90 ℃滅酶15 min；濾液操作與本實施例2的步驟（3）~（5）一致。分別根據①②③和PEF偶聯生物復合酶解技術提取鮑魚內臟活性成分與鮑魚內臟水不溶物，結果如表1所示。

表1 不同方法制備鮑魚內臟活性成分對比

由表1可知，溶劑提取、超聲輔助提取以及生物酶解均能制備得到鮑魚內臟活性成分。其中溶劑靜置提取磷脂、蛋白、多糖、糖脂和色素等提取率較低，大多只被加工成適宜牲畜食用的飼料；超聲輔助提取與生物酶解是提取工藝中常用方法，能在單一溶劑提取的基礎上顯著提高提取物質的提取率，一定程度上解決鮑魚內臟廢棄的問題，節(jié)約了能耗。相比于單一的活性成分制備技術，PEF偶聯生物酶解技術最大程度利用了鮑魚內臟的回收問題，不僅提取到含量較多的鮑魚內臟磷脂、蛋白、多糖、糖脂和色素，且對鮑魚內臟水不溶物加工成適宜牲畜食用的飼料，既節(jié)省了能耗、實現資源的再度分配，且制備得到安全、無毒的鮑魚內臟蛋白、多糖和磷脂等活性成分可應用于食品、醫(yī)藥等領域的生產加工中，如作為添加劑應用于功能性食品加工，藥用物質的開發(fā)等，極大提高鮑魚加工業(yè)的附加值，帶動海產品加工的發(fā)展。

上述僅為本發(fā)明的較佳實施例，但本發(fā)明的設計與構思并不局限于此。凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆屬于侵犯本發(fā)明范疇的行為。