本發(fā)明涉及一種利用具有調(diào)節(jié)腸道菌群能力的高產(chǎn)gaba短乳桿菌菌株在生產(chǎn)植物基發(fā)酵乳中的應用，屬于食品生物。

背景技術：

1、近年來，人們生活水平日益改善，肉、蛋、乳類等動物源食物在膳食結構中占比越來越大，由此導致的諸多慢性疾病如高血壓、肥胖等的發(fā)病率也在逐年上升。而植物來源的食物不含有飽和脂肪酸、膽固醇等對上述慢性疾病有促進作用的物質，且富含諸多具有抗氧化活性的生物活性物質如多酚、黃酮等，也符合目前全球范圍內(nèi)的素食潮流。因此，植物源食物正逐漸成為人們向健康膳食結構調(diào)整的重要選擇。

2、由于植物基基質通常具有一些不良的風味如苦味和豆腥味等，而且營養(yǎng)較為單一。而植物基基質通過乳酸菌發(fā)酵后不僅能消除令人不愉快的氣味物質，還會進一步豐富口感和營養(yǎng)，因此用乳酸菌發(fā)酵植物基飲料逐漸成為當前植物基飲料里的研究熱點。目前，市面上的全植物基乳酸菌發(fā)酵飲料尚不多，多是以燕麥制品為主，銷售市場主要在歐美、日本等發(fā)達地區(qū)，國內(nèi)這一產(chǎn)業(yè)尚處于起步階段。應用于全植物基發(fā)酵的乳酸菌包括乳制品來源乳酸菌，如保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、副干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌，以及植物來源乳酸菌如植物乳桿菌。

3、由于乳酸菌對大多數(shù)氨基酸具有營養(yǎng)缺陷型，乳酸菌對生長所需要的營養(yǎng)環(huán)境較高。植物基基質大多營養(yǎng)較為單一且不能直接提供乳酸菌生長繁殖所需的某些氨基酸、維生素和其它生長因子。因此，對乳酸菌特別是短乳桿菌這種小基因組乳酸菌，可能會缺乏很多編碼水解植物基基質中蛋白的酶的基因，對營養(yǎng)的要求就更高，對發(fā)酵植物基充滿了困難與挑戰(zhàn)。

4、課題組前期研究中已從白酒酸性發(fā)酵酒醅中篩選得到一株高產(chǎn)γ-氨基丁酸(gaba)的短乳桿菌d17(保藏編號：cgmcc?no.14385)，在不控ph發(fā)酵條件下能產(chǎn)26.1g/l的gaba，高于典型菌株短乳桿菌atcc?367的2.3倍；在控制ph條件下，gaba產(chǎn)量高達177.74g/l。gaba是一種重要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制性神經(jīng)遞質，具有抗肥胖、抗驚厥、降血壓、改善大腦機能和安定精神等多種生理功能。而且，白酒釀造系統(tǒng)的乳酸菌在高淀粉、高酸度環(huán)境下被長期馴化，使其具有高淀粉基質生長適應性和高耐酸性特征?；谏鲜鎏卣鳎拙漆勗煜到y(tǒng)來源產(chǎn)gaba的短乳桿菌具有良好的植物基發(fā)酵與益生特性。

5、短乳桿菌是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中本身存在的常見乳酸菌，如短乳桿菌是白酒釀造前期的優(yōu)勢乳桿菌(喬美玲等，傳統(tǒng)清香型白酒發(fā)酵過程中細菌群落演替及自組裝機理[j].食品科學,2023,44(22):139-148)，也是泡菜腌制后期的優(yōu)勢乳桿菌(liu,et?al.isolationand?characterization?of?bacteria?that?produce?quorum?sensing?molecules?duringthe?fermentation?and?deterioration?of?pickles[j].international?journal?offood?microbiology,2022,379:109869)。除此之外，短乳桿菌也已被列入美國食品藥物監(jiān)督局gras認證名錄和歐洲食品安全局qps認證名錄。在食品發(fā)酵領域，短乳桿菌常被用來發(fā)酵乳制品(seo,et?al.γ-aminobutyric?acid?production?in?skim?milk?co-fermentedwith?lactobacillus?brevis?877g?and?lactobacillus?sakei?795[j].food?scienceand?biotechnology,2013,22(3):751-755)、面團(郭小雨等，富集γ-氨基丁酸鷹嘴豆酸面團的工藝及其流變特性[j].食品與發(fā)酵工業(yè),2023,49(15):215-220)、腐乳(bao,etal.influence?of?lactobacillus?brevis?on?metabolite?changes?in?bacteria-fermented?sufu[j].journal?of?food?science,2020,85(1):165-172)、蔬菜和水果(楊汝德，現(xiàn)代工業(yè)微生物學[m].廣州:華南理工大學出版社，2001：337-340.)等，以達到增強營養(yǎng)和改善風味的目的。綜上，這些研究表明了短乳桿菌是長久以來存在于傳統(tǒng)發(fā)酵食品，且一直沿用的發(fā)酵菌株，可以用于食品生產(chǎn)中。

6、但在植物基發(fā)酵領域，短乳桿菌是少見的植物基發(fā)酵用乳酸菌，目前只有少數(shù)的文獻涉及短乳桿菌發(fā)酵植物基，具體為：短乳桿菌jcm?1059發(fā)酵椰棗渣(hasegawa?m,etal.gamma-aminobutyric?acid?fermentation?with?date?residue?by?a?lactic?acidbacterium,lactobacillus?brevis[j].journal?of?bioscience?and?bioengineering,2018,125(3):316-319)、短乳桿菌fpa3709發(fā)酵黑豆(ko?c?y,et?al.gamma-aminobutyricacid?production?in?black?soybean?milk?by?lactobacillus?brevis?fpa3709and?theantidepressant?effect?of?the?fermented?product?on?a?forced?swimming?rat?model[j].process?biochemistry,2013,48(4):559-568)、短乳桿菌grx-sos04發(fā)酵大豆(cn116536186?a)、短乳桿菌atcc?14869發(fā)酵麩皮和豆類(xie?c,et?al.fermentation?ofcereal,pseudo-cereal?and?legume?materials?with?propionibacteriumfreudenreichii?and?levilactobacillus?brevis?for?vitamin?b12?fortification[j].lwt-food?science?and?technology,2021,137:9)、短乳桿菌tr055發(fā)酵藜麥(jeske?s,etal.polyol-producing?lactic?acid?bacteria?isolated?from?sourdough?and?theirapplication?to?reduce?sugar?in?a?quinoa-based?milk?substitute[j].international?journal?of?food?microbiology,2018,286:31-36)。其中只有短乳桿菌jcm?1059、短乳桿菌fpa3709的植物基發(fā)酵乳涉及gaba含量的檢測，短乳桿菌jcm?1059在發(fā)酵酶解椰棗渣的gaba產(chǎn)量僅為103mg/l；短乳桿菌fpa3709發(fā)酵黑豆的gaba產(chǎn)量較高，能達到1g/l以上，但是是在外源添加了培養(yǎng)基組分(谷氨酸鈉)的前提下才能有這么高的gaba產(chǎn)量。因此，研發(fā)一款不外源添加輔助生長劑和谷氨酸及谷氨酸鹽情況下，以短乳桿菌優(yōu)良菌株生產(chǎn)高gaba含量的燕麥發(fā)酵乳或其它植物基發(fā)酵乳具有重要應用價值。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供酒醅來源高產(chǎn)gaba短乳桿菌d17菌株(保藏編號為cgmcc?no.14385，記載于公開號為cn108034599b的中國發(fā)明專利文本中)基于不同植物基基質特性的發(fā)酵方法，所述方法以模式菌株短乳桿菌atcc?367為參照，包括植物基基質的制作方法和菌株發(fā)酵方法。

2、本發(fā)明提供了一種短乳桿菌cgmcc?no.14385在制備抗氧化保健品、藥品或改善胃腸道菌群保健品中的應用，所述抗氧化為能顯著提高血清超氧化物歧化酶(sod)含量；所述改善胃腸道菌群包括顯著恢復腸道有益菌lactobacillus、muribaculaceae、faecalibaculum、bifidobacterium和akkermansia的相對豐度，顯著降低腸道潛在有害菌flintibacter、leptogranulimonas、alistipes的相對豐度。

3、本發(fā)明提供了短乳桿菌cgmcc?no.14385在制備緩解和/或治療高脂飲食導致的肥胖的藥品中的應用。

4、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述藥品中，短乳桿菌cgmcc?no.14385的添加量不低于：1×109cfu/ml。

5、本發(fā)明提供了一種植物基發(fā)酵乳，所述植物基發(fā)酵乳是按照下述步驟制備得到的：

6、(1)向植物基基質中添加蛋白酶進行酶解后，得到酶解液；

7、(2)將短乳桿菌(lactobacillus?brevis)d17菌劑添加至步驟(1)得到的酶解液中進行發(fā)酵后制備得到植物基發(fā)酵乳。

8、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述植物基基質為預水解燕麥乳、預水解焦香麥芽乳、預水解大米乳或預水解玉米乳；所述植物基基質的制備方法包括以下步驟：

9、預水解燕麥粉的制備：

10、將燕麥粉與水混合，添加α-淀粉酶進行酶解后，向酶解液中添加糖化酶進行糖化，糖化結束后進行滅酶處理；向滅酶的糖化液中添加中性蛋白酶進行酶解后，滅酶，得到酶解液；將得到的酶解液經(jīng)濃縮、干燥后得到預水解燕麥粉；

11、將制得的預水解燕麥粉按照料水比為：1～2：5～10混合后，滅菌，制備得到燕麥乳；向得到的燕麥乳中添加蛋白酶進行酶解后，得到預水解燕麥乳。

12、其它預水解谷物原料乳的制備：

13、將焦香麥芽粉、大米粉、玉米粉分別與水混合后糊化，冷卻后向糊化液中添加α-淀粉酶進行酶解后，滅酶，向滅酶后的溶液中添加中性蛋白酶進行酶解后，滅酶，得到酶解液；將得到的酶解液經(jīng)濃縮、干燥后，分別得到預水解焦香麥芽粉、預水解大米粉、預水解玉米粉；

14、將制得的預水解焦香麥芽粉、預水解大米粉、預水解玉米粉分別按照料水比為：1～2：5～10混合后，滅菌，制備得到預水解焦香麥芽乳、預水解大米乳或預水解玉米乳。

15、在本發(fā)明的一種實施方式中，預水解燕麥粉的制備：將燕麥粉(購自徐州方德食品有限公司)與水以質量比1：4進行混勻，隨后添加2％(m/v)的α-淀粉酶(名稱為ban480?l，購自諾維信)，在60℃下酶解60min。隨后，向酶解液中添加2％(m/v)的淀粉酶(名稱為amylaseag?300l，購自諾維信)，在60℃下酶解60min。待酶解完成后，以90℃滅酶10min。隨后，向滅酶的酶解液中再添加0.2％(m/v)的中性蛋白酶(名稱為neutrase?0.8l，購自諾維信)在50℃下酶解60min。待酶解完成后，以90℃再滅酶10min。隨后用60目篩網(wǎng)進行過濾。酶解液經(jīng)過濃縮，再經(jīng)滾筒干燥，最后研成粉備用。

16、在本發(fā)明的一種實施方式中，分別將焦香麥芽粉(購自濟南雙麥啤酒物資有限公司)、大米粉(購自江西谷邑豐食品科技有限公司)、玉米粉(購自江西谷邑豐食品科技有限公司)以1:5(m/v)的料液比進行混勻。蒸煮糊化30min，冷卻至室溫后，向糊化液中添加0.05％(m/v)的α-淀粉酶(名稱為ban480?l)，在95℃下酶解80min。隨后，在90℃下滅酶10min。隨后，向滅酶的酶解液中再添加0.05％(m/v)的中性蛋白酶(名稱為neutrase0.8l)，在50℃下酶解60min。待酶解完成后，以90℃再滅酶10min。隨后用四層紗布過濾，過濾后的酶解液經(jīng)過濃縮，再經(jīng)滾筒干燥，最后研成粉備用。

17、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述蛋白酶包括但不限于：谷物水解酶zb3-1p、溶解酶viscozyme?l、中性蛋白酶neutrase?0.8l。

18、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述短乳桿菌cgmcc?no.14385菌劑為短乳桿菌cgmcc?no.14385發(fā)酵液、短乳桿菌cgmcc?no.14385濕菌體或短乳桿菌cgmcc?no.14385凍干粉。

19、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵液為，將保藏在甘油管中的菌液接于液體mrs培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24h，活化3次。完全活化的菌液以10％接種量接種于100ml液體mrs培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)中期(10-12h)，將培養(yǎng)液稀釋至1×109cfu/ml作為發(fā)酵液。

20、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述菌劑中，短乳桿菌cgmcc?no.14385的添加量不低于：5～10％。

21、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述濕菌體為：將在100ml?mrs液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)中期的短乳桿菌d17的擴大培養(yǎng)液進行離心以收集菌體，用無菌生理鹽水洗菌體3次。再次離心以收集干凈的菌體，即為濕菌體。

22、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述凍干粉為，將在100ml?mrs液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)中期的短乳桿菌d17的擴大培養(yǎng)液進行離心以收集菌體，用無菌生理鹽水洗菌體3次。再次離心以收集干凈的菌體，然后在菌體中加入為10(離心前菌液體積):1(脫脂乳體積)(v/v)的18％脫脂乳(保護劑)。10倍濃縮的牛奶菌懸液依次在4℃下預冷6h、-20℃下預冷12h和-80℃下預冷24h，待完全預冷后置于真空干燥機進行凍干，將凍干好的樣品研磨成粉末備用。

23、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述直投式菌劑的制備方法為：

24、將活化后的菌液接種至種子培養(yǎng)基種，得到種子培養(yǎng)液；將制備得到的種子培養(yǎng)液離心后收集菌體，將收集到的菌體以體積比為10～20：1～2的比例添加脫脂乳作為保護劑，得到菌懸液，將制備得到的菌懸液依次在4～8℃下預冷6～8h、-18～-20℃下預冷10～12h和-80～-100℃下預冷24～48h，待完全預冷后置于真空干燥機進行凍干，將凍干好的樣品研磨成粉末備用。

25、在本發(fā)明的一種實施方式中，將保藏在甘油管中的菌液接于液體mrs培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24h，活化3次。將完全活化的菌液以10％(v/v)的接種量接種于100ml液體mrs培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)中期(發(fā)酵時間為10-12h)后得到培養(yǎng)液，此時培養(yǎng)液菌濃為2.8×1010cfu/ml作為發(fā)酵種子液；將上述發(fā)酵種子液進行離心以收集菌體，用無菌生理鹽水洗菌體3次。再次離心以收集干凈的菌體，然后在菌體中加入為10(離心前菌液體積):1(脫脂乳體積)(v/v)的18％脫脂乳(保護劑)得到10倍濃縮的牛奶菌懸液。將上述10倍濃縮的牛奶菌懸液依次在4℃下預冷6h、-20℃下預冷12h和-80℃下預冷24h，待完全預冷后置于真空干燥機進行凍干，將凍干好的樣品研磨成粉末備用。

26、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述菌劑中，短乳桿菌cgmcc?no.14385的添加量不低于：5～10％。

27、在本發(fā)明的一種實施方式中，采用直投式發(fā)酵方式，方法為，以濕菌體為對照，濕菌體用離心前等量的無菌生理鹽水重懸，以10％(m/v)的接種量接種于植物基基質中。稱取等cfu量的凍干菌粉并用無菌生理鹽水重懸，接種于植物基基質中，37℃，200rpm發(fā)酵24h，每4h取一次樣。通過高效液相色譜(hplc)檢測發(fā)酵液中麥芽糖、葡萄糖、乳酸、乙酸、乙醇、谷氨酸和gaba含量。

28、在本發(fā)明的一種實施方式中，發(fā)酵條件為：35～40℃，100～200rpm條件下發(fā)酵12～36h。

29、在本發(fā)明的一種實施方式中，預水解谷物原料(預水解燕麥粉、預水解焦香麥芽粉、預水解大米粉、預水解玉米粉)以1:5(m/v)的料水比制備預水解燕麥乳、預水解焦香麥芽乳、預水解大米乳、預水解玉米乳，并于115℃滅菌30min。

30、在本發(fā)明的一種實施方式中，將發(fā)酵液以10％的接種量接種于上述4種不同的預水解谷物乳液，37℃，200rpm發(fā)酵24h，每4h取一次樣。通過高效液相色譜(hplc)檢測發(fā)酵液中麥芽糖、葡萄糖、乳酸、乙酸、乙醇、谷氨酸和gaba含量。

31、本發(fā)明還提供一種采用短乳桿菌d17菌株無需外源添加輔助生長因子、谷氨酸及谷氨酸鹽發(fā)酵制備得到富含gaba的燕麥乳，所述燕麥乳是按照下述步驟制備得到的：

32、(1)將燕麥粉與水混合，添加α-淀粉酶進行酶解后，向酶解液中添加糖化酶進行糖化，糖化結束后進行滅酶處理；向滅酶的糖化液中添加中性蛋白酶進行酶解后，滅酶，得到酶解液；將得到的酶解液經(jīng)濃縮、干燥后得到預水解燕麥粉；將制得的預水解燕麥粉按照料水比為：1～2：5～10混合后，滅菌，制備得到預水解燕麥乳；

33、(2)將短乳桿菌cgmcc?no.14385菌劑添加至步驟(1)得到的預水解燕麥乳中進行發(fā)酵后制備得到燕麥乳。

34、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述燕麥乳的制備方法為：

35、(1)預水解燕麥乳的制備：

36、將燕麥粉(購自徐州方德食品有限公司)與水以質量比1：4進行混勻，隨后添加2％(m/v)的α-淀粉酶(名稱為ban480?l)，在60℃下酶解60min。隨后，向酶解液中添加2％(m/v)的淀粉酶(名稱為amylase?ag?300l)，在60℃下酶解60min。待酶解完成后，以90℃滅酶10min。隨后，向滅酶的酶解液中再添加0.2％(m/v)的中性蛋白酶(名稱為neutrase?0.8l)在50℃下酶解60min。待酶解完成后，以90℃再滅酶10min。隨后用60目篩網(wǎng)進行過濾。酶解液經(jīng)過濃縮，再經(jīng)滾筒干燥，最后研成粉即為預水解燕麥粉。將制得的預水解燕麥粉按照料水比為：1～2：5～10混合后滅菌制備得到預水解燕麥乳。

37、(2)向步驟(1)得到的預水解燕麥乳中外源添加1％(m/v)的蛋白酶zb3-1p(購自：山東隆科特酶制劑有限公司，許可證編號為：sc20137132300142)，置于45℃的水浴鍋中水浴酶解8h，然后于115℃下滅菌滅酶30min，即為發(fā)酵用酶解燕麥乳。

38、所述蛋白酶包括但不限于：谷物水解酶zb3-1p、溶解酶viscozyme?l、中性蛋白酶neutrase0.8l。

39、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述短乳桿菌cgmcc?no.14385菌劑為短乳桿菌cgmcc?no.14385發(fā)酵液、短乳桿菌cgmcc?no.14385濕菌體或短乳桿菌cgmcc?no.14385凍干粉；優(yōu)選的，所述菌劑中，短乳桿菌cgmcc?no.14385的添加量不低于：5～10％。

40、在本發(fā)明的一種實施方式中，步驟(1)中，酶解條件為：40～50℃，7～10h；步驟(2)中發(fā)酵條件為：35～40℃，100～200rpm條件下發(fā)酵12～36h。

41、本發(fā)明還提供了一種提高短乳桿菌發(fā)酵制備燕麥乳中gaba含量的方法，所述方法無需外源添加輔助生長因子、谷氨酸及谷氨酸鹽，具體包括以下步驟：

42、(1)向預處理后的燕麥中添加蛋白酶進行酶解后，得到酶解液；所述預處理的方法為：將燕麥粉(購自徐州方德食品有限公司)與水以質量比1：4進行混勻，隨后添加2％(m/v)的α-淀粉酶(名稱為ban480?l)，在60℃下酶解60min。隨后，向酶解液中添加2％(m/v)的淀粉酶(名稱為amylase?ag?300l)，在60℃下酶解60min。待酶解完成后，以90℃滅酶10min。隨后，向滅酶的酶解液中再添加0.2％(m/v)的中性蛋白酶(名稱為neutrase?0.8l)在50℃下酶解60min。待酶解完成后，以90℃再滅酶10min。隨后用60目篩網(wǎng)進行過濾。酶解液經(jīng)過濃縮，再經(jīng)滾筒干燥，最后研成粉即為預水解燕麥粉。將制得的預水解燕麥粉按照料水比為：1～2：5～10混合后滅菌制備得到預水解燕麥乳。

43、(2)將短乳桿菌cgmcc?no.14385菌劑添加至步驟(1)得到的酶解液中進行發(fā)酵后制備得到燕麥乳；

44、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述蛋白酶包括但不限于：谷物水解酶zb3-1p、溶解酶viscozyme?l、中性蛋白酶neutrase?0.8l。

45、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述短乳桿菌cgmcc?no.14385菌劑為短乳桿菌cgmcc?no.14385發(fā)酵液、短乳桿菌cgmcc?no.14385濕菌體或短乳桿菌cgmcc?no.14385凍干粉；

46、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述菌劑中，短乳桿菌cgmcc?no.14385的添加量不低于：5～10％。

47、在本發(fā)明的一種實施方式中，步驟(1)中，酶解條件為：40～50℃，7～10h；步驟(2)中發(fā)酵條件為：35～40℃，100～200rpm條件下發(fā)酵12～36h。

48、本發(fā)明還提供了上述短乳桿菌cgmcc?no.14385在制備抗氧化保健品或藥品、改善胃腸道菌群保健品或藥品中的應用。

49、本發(fā)明還提供了上述短乳桿菌cgmcc?no.14385在制備緩解和/或治療高脂飲食導致的肥胖的藥品中的應用。

50、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述藥品中，短乳桿菌cgmcc?no.14385的添加量不低于：1×109cfu/ml。

51、本發(fā)明的還提供了一種短乳桿菌d17菌株的直投式菌劑，通過對該直投式菌劑的存活能力與發(fā)酵性能評估，發(fā)現(xiàn)該菌株適合凍干，且直投式菌劑在一定時間內(nèi)的冷藏不會對其存活率產(chǎn)生較大影響，并可用于直投式發(fā)酵。所述直投式菌劑的制備方法包括以下步驟：

52、(1)直投式菌劑的制作

53、將在100ml?mrs液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)中期的短乳桿菌d17的擴大培養(yǎng)液進行離心以收集菌體，用無菌生理鹽水洗菌體3次。再次離心以收集干凈的菌體，然后在菌體中加入為10(離心前菌液體積):1(脫脂乳體積)(v/v)的18％脫脂乳(保護劑)。10倍濃縮的牛奶菌懸液在4℃下預冷6h、-20℃下預冷12h和-80℃下預冷24h，待完全預冷后置于真空干燥機進行凍干，將凍干好的樣品研磨成粉末備用。

54、(2)凍干存活率的測定

55、向凍干菌劑中加入等量無菌生理鹽水進行復水，混勻后稀釋涂板計數(shù)，計算出菌粉的活菌數(shù)。用凍干后菌粉的活菌數(shù)除以凍干前菌液的活菌數(shù)即為菌株在凍干后的存活率。

56、(3)冷藏時間對凍干菌劑存活率的測定

57、分別取儲存在4度冰箱中0天、7天和28天的凍干菌劑，以等量無菌生理鹽水進行復水，混勻后稀釋涂板計數(shù)，以監(jiān)測冷藏時間對凍干菌劑存活率的影響。

58、(4)直投式發(fā)酵測定

59、以凍干前離心得到的濕菌體(菌泥)為對照，菌泥用離心前等量的無菌生理鹽水重懸，以10％(m/v)的接種量接種于酶解燕麥乳中。稱取一定量的凍干菌粉(確保與10％的菌泥重懸液的cfu數(shù)一致)用等量無菌生理鹽水重懸，接種于酶解燕麥乳中，37℃，200rpm發(fā)酵24h，每4h取一次樣。通過高效液相色譜(hplc)檢測發(fā)酵液中麥芽糖、葡萄糖、乳酸、乙酸、乙醇、谷氨酸和gaba含量。

60、本發(fā)明還提供了一種對短乳桿菌d17菌株的安全性評估的方法，所述評價方法包括菌株全基因組分析、抗生素抗性試驗和小鼠體內(nèi)毒性試驗。其包括以下步驟：

61、(1)菌株全基因組分析

62、將短乳桿菌d17菌株的全基因組序列與毒力因子數(shù)據(jù)庫(vfdb)和耐藥基因數(shù)據(jù)庫(card)進行比對，參考歐洲食品安全局(efsa)中的相關指南，以同一性(identity)大于80％、覆蓋度(coverage)大于70％和e值小于l×e-10為篩選標準，預測毒力因子和耐藥基因。

63、(2)抗生素抗性試驗

64、采用k-b紙片擴散法判定短乳桿菌d17菌株對12種常用抗生素的抗性。將短乳桿菌d17菌株種子液稀釋至菌濃為1×108cfu/ml，吸取1ml菌液至平板裝含瓊脂的15ml?mrs液體培養(yǎng)基中，混勻。待其凝固后，用無菌鑷子將含有一定濃度抗生素的藥敏紙片均勻貼在板上。置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后測量平板上的抑菌圈直徑。依據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(clinical?and?laboratory?standards?institutes)制定的抗生素敏感試驗執(zhí)行標準進行判定。

65、(3)小鼠體內(nèi)毒性試驗

66、選用20只6-8周齡的spf級balb/c小鼠(雄鼠和雌鼠各10只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)生活于12h光暗循環(huán)，恒定的環(huán)境溫度(22±2℃)、濕度(55±2％)中，自由攝食、飲水。小鼠適應一周后被隨機分成2組，每組10只(雌鼠雄鼠各5只，并分開飼養(yǎng))，分組如下：(1)sd組(對照組)：小鼠飼喂標準飼料(co60輻照實驗鼠維持飼料，購自江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司)和200μl無菌生理鹽水；(2)d17組：在飼喂標準飼料的基礎上補充200μl(濃度為1×109cfu/ml)的短乳桿菌d17菌懸液。每日灌胃，共持續(xù)28天。灌胃期間每日稱量小鼠體重，觀察記錄小鼠的攝食、飲水、活動狀態(tài)和精神狀態(tài)。灌胃期最后一天，所有小鼠禁食過夜，然后經(jīng)眼眶采血后，采用二氧化碳法安樂死小鼠。隨后立即摘取肝臟、脾臟、腎臟和結腸進行后續(xù)分析。本實驗嚴格遵循實驗動物相關倫理準則，并通過江南大學實驗動物倫理委員會批準(倫理批準編號：jn.no20220315b0300601)。

67、本發(fā)明還評估短乳桿菌d17菌株的體內(nèi)益生功能，發(fā)現(xiàn)該菌株具有優(yōu)良的延緩肥胖功效。通過以下技術方案來實現(xiàn)：

68、選用24只8周齡的spf級c57bl/6j雄性小鼠，給予正常飼料適應1周。適應1周后，將小鼠根據(jù)體重分成3組，具體分組如下：(1)普通飼料組(nfd)：普通飼料+0.2ml無菌生理鹽水；(2)高脂飼料組(hfd、60％kcal的脂肪，購自江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司)：高脂飼料+0.2ml無菌生理鹽水；(3)短乳桿菌d17組(hfd+d17)：高脂飼料+0.2ml109cfu/ml的d17菌懸液。每組8只，每日灌胃，共持續(xù)8周。8周灌胃結束后，禁食過夜，經(jīng)眼眶采血后，采用二氧化碳法安樂死小鼠。對每只小鼠的肝、腎、脾、附睪白色脂肪組織(ewat)和腹股溝皮下白色脂肪組織(iwat)進行精確解剖、稱重并收集用于進一步分析。本實驗嚴格遵循實驗動物相關倫理準則，并通過江南大學實驗動物倫理委員會批準(倫理批準編號：jn.no20220930c0321220)。

69、本發(fā)明提供了一種以燕麥粉為底物制備gaba的方法，所述方法無需外源添加輔助生長因子、谷氨酸及谷氨酸鹽，具體包括以下步驟：

70、(1)將燕麥粉與水混合，添加α-淀粉酶進行酶解后，向酶解液中添加糖化酶進行糖化，糖化結束后進行滅酶處理；向滅酶的糖化液中添加中性蛋白酶進行酶解后，滅酶，得到酶解液；將得到的酶解液經(jīng)濃縮、干燥后得到預水解燕麥粉；將制得的預水解燕麥粉按照料水比為：1～2：5～10混合后，滅菌，制備得到燕麥水解液；向得到的燕麥水解液中添加蛋白酶zb3-1p進行酶解后，得到預水解燕麥底物；

71、(2)將短乳桿菌cgmcc?no.14385菌劑添加至步驟(1)得到的預水解燕麥底物中進行發(fā)酵后，制備得到含有gaba的發(fā)酵液，提取后制備得到gaba。

72、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述蛋白酶包括但不限于：谷物水解酶zb3-1p、溶解酶viscozyme?l、中性蛋白酶neutrase?0.8l。

73、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述短乳桿菌cgmcc?no.14385菌劑為短乳桿菌cgmcc?no.14385發(fā)酵液、短乳桿菌cgmcc?no.14385濕菌體或短乳桿菌cgmcc?no.14385凍干粉；優(yōu)選的，所述菌劑中，短乳桿菌cgmcc?no.14385的添加量不低于：5～10％。

74、在本發(fā)明的一種實施方式中，步驟(1)中，酶解條件為：40～50℃，7～10h；步驟(2)中發(fā)酵條件為：35～40℃，100～200rpm條件下發(fā)酵12～36h。

75、在本發(fā)明的一種實施方式中，添加α-淀粉酶進行酶解的條件為：55～65℃酶解60～70min；糖化酶進行糖化的條件為：55～65℃糖化60～70min；添加中性蛋白酶酶解的條件為：50～60℃酶解60～70min；所述燕麥粉與水是按照1～2：4～8的比例混合，所述α-淀粉酶的添加量為：2～3％(m/v)；所述糖化酶的添加量為：2～3％(m/v)；所述中性蛋白酶的添加量為：0.2～0.3％(m/v)。

76、有益效果

77、(1)本發(fā)明的短乳桿菌d17可以直接發(fā)酵燕麥乳和其它多種類型的水解植物基基質。

78、(2)在不外源添加其它任何培養(yǎng)基組分和任何形式谷氨酸或谷氨酸鹽情況下，本發(fā)明的短乳桿菌d17可以發(fā)酵酶解燕麥乳以實現(xiàn)高產(chǎn)gaba。

79、(3)本發(fā)明的短乳桿菌d17可以做成直投式發(fā)酵菌劑，用于直投式發(fā)酵。

80、(4)本發(fā)明的短乳桿菌d17經(jīng)體外測試和體內(nèi)測試證明其是安全可用菌株。

81、(5)本發(fā)明的短乳桿菌d17具有優(yōu)良的減脂、延緩肥胖的功效。