本發(fā)明具體涉及一種制備蛋白-多酚共價復合物的方法，屬于食品科學與加工。

背景技術(shù)：

1、在食品體系中，蛋白質(zhì)和多酚是十分常見的兩類物質(zhì)。蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值和其特定的結(jié)構(gòu)功能屬性，使其被廣泛應用于食品體系中，而多酚具有多種生物活性和生理功能，在植物中來源非常廣泛。自然情況下，蛋白質(zhì)常以非共價形式(疏水作用、氫鍵、離子鍵、π鍵等弱相互作用形成非共價鍵結(jié)合)與多酚結(jié)合，從而改善蛋白的功能特性，如乳化性、凝膠性等及消減蛋白致敏性。但非共價結(jié)合方式易受溶液和環(huán)境的影響而發(fā)生蛋白與多酚分離，導致效果不穩(wěn)定。共價結(jié)合是指蛋白與多酚分子之間以共價鍵的形式結(jié)合，二者形成穩(wěn)定的復合物。蛋白與多酚共價結(jié)合復合物具有以下優(yōu)點：①蛋白-多酚共價結(jié)合物更易形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，與非共價結(jié)合物相比，其熱穩(wěn)定性和抗氧化性更好。②共價結(jié)合多酚可以提升蛋白的凝膠性、增強蛋白保水性等。③蛋白-多酚共價結(jié)合物制備的乳液可有效降低乳液平均粒徑、改善蛋白的乳化性。因此，蛋白質(zhì)與多酚共價結(jié)合作為一種蛋白質(zhì)改性手段能極大拓展蛋白的應用場景。

2、目前，蛋白質(zhì)與多酚共價復合物的制備有酶促法和非酶促法兩類。酶促法是通過酶的催化、交聯(lián)作用使蛋白質(zhì)和多酚反應實現(xiàn)二者共價結(jié)合生成穩(wěn)定的蛋白-多酚共價結(jié)合復合物。常用的酶包括多酚氧化酶、漆酶、轉(zhuǎn)谷酰胺酶、過氧化物酶、脂氧化酶、酪氨酸酶等。其原理為多酚在酶催化下形成醌，然后與蛋白反應進一步交聯(lián)結(jié)合。非酶促法包括自由基法和堿法。自由基法通過抗壞血酸和h2o2兩種試劑構(gòu)建的氧化還原體系產(chǎn)生的羥基自由基介導的氧化效應促進蛋白與多酚的結(jié)合，其原理抗壞血酸和h2o2的氧化還原體系中產(chǎn)生羥基自由基，氧化多酚使其生醌，醌與蛋白共價結(jié)合。堿法主要原理是將蛋白質(zhì)多酚復合物溶液的ph調(diào)至堿性，多酚在堿性條件下不穩(wěn)定，氧化成醌，然后與蛋白質(zhì)的親核基團結(jié)合。

3、低溫等離子體技術(shù)作為一種利用高能活性氧氮粒子(rons)實現(xiàn)處理基質(zhì)物性修飾的手段，因其獨特優(yōu)勢已廣泛應用于消毒殺菌、環(huán)境保護、材料改性及醫(yī)學等領(lǐng)域。近年來，低溫等離子體技術(shù)在食品加工領(lǐng)域的應用引起極大關(guān)注。室溫條件下，氣體經(jīng)高能電場電離產(chǎn)生多種活性粒子(o.、o3、oh.、ho2、o2-、no和onoo)，形成復雜的rons等離子體氧化體系，這些活性粒子介導的氧化效應作用于食品基質(zhì)，從而實現(xiàn)食品大分子(蛋白、淀粉等)改性修飾和食品的殺菌保鮮等。因具有綠色、非熱、無化學殘留等優(yōu)勢，使低溫等離子體技術(shù)在食品加工領(lǐng)域，尤其是蛋白的改性修飾，改善其功能特性方面具有良好應用前景。然而，關(guān)于利用等離子體處理實現(xiàn)蛋白與多酚的共價結(jié)合還沒有相關(guān)報道。

4、目前，使蛋白質(zhì)多酚共價結(jié)合常用的酶促法和非酶促法存在的不足有：

5、(1)酶促法效率低，反應時間長(達24h)，成本高；

6、(2)非酶促法(自由基法和堿法)涉及若干個化學試劑的添加，且反應時間長；

7、(3)不綠色、不環(huán)保；

8、(4)共價結(jié)合過程中造成多酚氧化。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種制備蛋白-多酚共價復合物的方法，采用低溫等離子體介導的方法將多酚與蛋白共價結(jié)合。

2、本發(fā)明的方案如下。

3、一種制備蛋白-多酚共價復合物的方法，包括以下步驟：

4、(1)低溫等離子體處理蛋白溶液；

5、(2)向步驟(1)所得蛋白溶液中加入多酚，攪拌使其充分反應，得到蛋白-多酚共價復合物。

6、優(yōu)選的，步驟(1)所述低溫等離子體處理過程中，工作氣體為空氣、氮氣、氦氣、或氬氣，處理電壓為10～50kv，處理頻率為0.5～5khz，處理時間為10～60s。

7、優(yōu)選的，所述低溫等離子體處理的時間為15～45s，優(yōu)選為15～30s。

8、優(yōu)選的，所述低溫等離子體處理的電壓為40kv，處理頻率為1.3khz。

9、優(yōu)選的，步驟(1)所用低溫等離子體處理設(shè)備由反應高壓電源、反應釜和樣品容器組成，其中高壓電源能實現(xiàn)電壓1～100kv，頻率0.1～20khz；反應釜由尺寸為φ50mm的上、下電極組成，絕緣介質(zhì)是尺寸為φ102mm×1mm的石英片，電極間間距為0～10mm可調(diào)，樣品容器為φ50mm×5mm的石英皿。

10、優(yōu)選的，步驟(1)中，處理過程為：將一定量的樣品置于石英皿中，兩電極間的間距調(diào)整8mm，絕緣介質(zhì)板固定于上電極，以空氣作為電離介質(zhì)。

11、優(yōu)選的，步驟(1)所述蛋白為卵白蛋白、β-乳球蛋白、豌豆分離蛋白、大豆分離蛋白中的一種或多種。

12、優(yōu)選的，步驟(1)所述的蛋白溶液是稱取一定量的蛋白溶于去離子水中，攪拌一段時間使其充分水合得到。

13、優(yōu)選的，步驟(2)所述的多酚為沒食子酸、阿魏酸、丁香酸、咖啡酸、鞣花酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、表兒茶素中的一種或多種。不同分子量和結(jié)構(gòu)的多酚與蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力有所差別。

14、優(yōu)選的，步驟(1)所述蛋白溶液中蛋白的濃度為1～20mg/ml。

15、優(yōu)選的，步驟(2)所述多酚在加入多酚后的混合體系中的濃度為1～100μmol/ml。

16、優(yōu)選的，步驟(2)中，將充分反應后的多酚和蛋白混合溶液透析除去未與蛋白結(jié)合的多酚，然后再冷凍干燥，獲得到蛋白-多酚共價復合物。

17、優(yōu)選的，所述透析是將樣品置于透析袋于4℃的去離子水中透析48h，所述冷凍干燥是將透析后的樣品置于-20℃預凍12h。

18、優(yōu)選的，所述透析所選透析袋分子截留量1kda。

19、優(yōu)選的，所述透析期間換水10次以上，并確保透析完全樣品溶液中與蛋白未結(jié)合的游離地多酚。

20、本發(fā)明利用低溫等離子體技術(shù)實現(xiàn)蛋白與多酚快速、高效地共價結(jié)合，其機理如下：首先氣體經(jīng)高能電場電離產(chǎn)生多種活性粒子(o.、o3、oh.、ho2、o2-、no和onoo)形成rons等離子體氧化體系；rons的氧化作用擾亂維持蛋白結(jié)構(gòu)的非共價作用(氫鍵、疏水相互作用、范德華力等)，從而使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，與多酚結(jié)合的氨基和巰基等結(jié)合位點充分暴露；同時，rons氧化蛋白的氨基(-nh2)和巰基(-sh)為氨自由基(-nh.)和硫自由基(-s.)。等離子體處理后加入的多酚被蛋白氨自由基(-nh.)和硫自由基(-s.)等活性中間體攻擊發(fā)生自由基鏈式反應形成共價鍵，從而實現(xiàn)蛋白與多酚快速、高效地共價結(jié)合。

21、本發(fā)明相對現(xiàn)有技術(shù)，具有如下有益效果：

22、(1)本發(fā)明的方法快速(等離子體處理10～60s完成結(jié)合)、高效(多酚結(jié)合量達到40mg/g-100mg/g。

23、(2)本發(fā)明所用設(shè)備具有簡單、穩(wěn)定、成本低的特點。

24、(3)本發(fā)明反應過程無需添加化學試劑，適合高附加值蛋白產(chǎn)品開發(fā)，符合低碳綠色的主題。

25、(4)本發(fā)明與蛋白共價結(jié)合過程中多酚氧化程度極低，未出現(xiàn)氧化成醌所導致的明顯顏色變化。