適用于脂質(zhì)體遞送編碼蛋白質(zhì)的RNA的脂質(zhì)本申請(qǐng)要求2010年8月31日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/378,833的權(quán)益，其全部?jī)?nèi)容通過引用納入本文以用于所有目的。技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及對(duì)動(dòng)物的非病毒性遞送RNA的領(lǐng)域。技術(shù)背景遞送體內(nèi)表達(dá)所編碼蛋白的核酸對(duì)基因治療和免疫都有幫助。已經(jīng)測(cè)試各種成功遞送的方法，包括對(duì)DNA或RNA，病毒性或非病毒性遞送載劑（或甚至無遞送載劑，在“裸”疫苗中），復(fù)制或非復(fù)制載體，或病毒性或非病毒性載體的應(yīng)用。仍然需要進(jìn)一步和改進(jìn)的方法來向動(dòng)物遞送體內(nèi)表達(dá)其所編碼蛋白的核酸。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
根據(jù)本發(fā)明，將RNA包埋于脂質(zhì)體中遞送。所述RNA編碼感興趣的多肽。所述脂質(zhì)體包括至少一種選自式(I)和式(XI)化合物組成組的化合物。這些脂質(zhì)體可以有效地遞送體內(nèi)表達(dá)的RNA。本發(fā)明對(duì)免疫特別有用，其中所編碼的多肽是免疫原。因此本發(fā)明提供一種包埋編碼感興趣多肽的RNA的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體包含至少一種選自式(I)和式(XI)化合物組成組組的化合物。式(I)是：其中：R1和R2與其相連的氮原子一起形成任選取代的C3-20-雜環(huán)烷基、C3-20-雜環(huán)烯基、C3-20-雜環(huán)炔基或C5-20-雜芳基基團(tuán)；a不存在或是任選取代的C1-4亞烷基；b不存在或是任選取代的C1-4亞烷基；c不存在或是任選取代的C1-4亞烷基；X1是O或S；X2是O或S；Y1是任選取代的C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L不存在或是–(La)d–(Lb)e–(Lc)f–，其中La是任選取代的C1-15亞烷基、C1-15亞烯基、C1-15亞炔基、C1-15雜亞烷基、C1-15雜亞烯基、或C1-15雜亞炔基；Lb是任選取代的C6-14亞芳基或C5-13雜亞芳基；Lc是任選取代的C1-15亞烷基、C1-15亞烯基、C1-15亞炔基、C1-15雜亞烷基、C1-15雜亞烯基或C1-15雜亞炔基；d是0或1;e是0或1；和f是0或1；和Y2是任選取代的類固醇。式(XI)是：Ra-(AA)z-Rb其中，Ra是N末端烷基酰胺；z是2至10的整數(shù)；每個(gè)AA是氨基酸，前提是存在至少一個(gè)組氨酸和至少一個(gè)陽離子氨基酸；Rb是-H或-NH2。本發(fā)明還提供制備含有RNA的脂質(zhì)體的方法，包括將RNA與選自式(I)和式(XI)化合物組成組的化合物混合的步驟，于所述化合物形成包埋所述RNA的脂質(zhì)體的條件下進(jìn)行。將所述RNA和所述化合物可在其它化合物存在下混合，所述其它化合物也進(jìn)入脂質(zhì)體中，變?yōu)槿缙渌|(zhì)。脂質(zhì)體本發(fā)明利用包埋編碼多肽的RNA的脂質(zhì)體。因此所述RNA（如同在天然病毒中）與任何外部介質(zhì)分離。發(fā)現(xiàn)包埋在脂質(zhì)體中可保護(hù)RNA不被RNA酶消化。所述脂質(zhì)體可包括一些外部的RNA（如在它們的表面上），但至少一半的所述RNA（理想上為全部）被包埋在所述脂質(zhì)體的核心中。包埋于脂質(zhì)體中區(qū)別于，例如，參考文獻(xiàn)1公開的脂質(zhì)/RNA復(fù)合物，其中RNA與預(yù)先形成的脂質(zhì)體混合。各種兩親性脂質(zhì)在水環(huán)境中能形成雙分子層以包埋含RNA的水核心形成脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)可具有陰離子、陽離子或兩性離子親水頭部基團(tuán)。由陰離子磷脂形成脂質(zhì)體可追溯到上世紀(jì)六十年代，而陽離子脂質(zhì)體形成的脂質(zhì)從上世紀(jì)九十年代已開始研究。一些磷脂為陰離子型而其他一些為兩性離子型還有其它為陽離子型。合適類型的磷脂包括但不限于：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油和表1所列的一些有用的磷脂。先有技術(shù)中有用的陽離子脂質(zhì)包括但不限于：二油酰-三甲基銨丙烷(DOTAP)、1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞麻基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)。兩性脂質(zhì)包括但不限于?；鶅尚灾|(zhì)和醚基兩性脂質(zhì)。有用的兩性脂質(zhì)示例為DPPC、DOPC、DSPC、十二烷基磷酸膽堿、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸酰乙醇胺(DOPE)、和1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸酰乙醇胺(DPyPE)。本發(fā)明的脂質(zhì)體中的所述脂質(zhì)可以是飽和的或不飽和的。優(yōu)選使用至少一種不飽和脂質(zhì)來制備脂質(zhì)體。如果不飽和脂質(zhì)有兩個(gè)尾部，這兩個(gè)尾部可以都是不飽和的，或不飽和脂質(zhì)可以有一個(gè)飽和尾部和一個(gè)不飽和尾部。脂質(zhì)的一個(gè)尾部中可包含類固醇基團(tuán)，例如：如同在RV05中。本發(fā)明的脂質(zhì)體可以由單一脂質(zhì)或更通常由脂質(zhì)混合物形成?；旌衔锟砂?i)陽離子脂質(zhì)的混合物(ii)陰離子脂質(zhì)和陽離子脂質(zhì)的混合物(iii)兩性脂質(zhì)和陽離子脂質(zhì)的混合物或(vii)陰離子脂質(zhì)、陽離子脂質(zhì)和兩性脂質(zhì)的混合物。相似地，混合物可包括飽和以及不飽和脂質(zhì)。使用脂質(zhì)混合物時(shí)，并非混合物中的所有組成脂質(zhì)都需要為兩親性，例如可以將一種或多種兩親性脂質(zhì)與膽固醇混合。本發(fā)明的脂質(zhì)體包括至少一種式(I)的化合物和/或至少一種式(XI)的化合物。本發(fā)明的優(yōu)選脂質(zhì)體包含式(I)的離子脂質(zhì)。如實(shí)施例所示，這種脂質(zhì)體特別有助于表達(dá)蛋白的RNA的體內(nèi)遞送。本發(fā)明的其它優(yōu)選脂質(zhì)體包含式(XI)的脂肽。脂質(zhì)體可以包含式(I)的脂質(zhì)體和式(XI)的脂肽，但通常只包含這兩類陽離子化合物中的一種。當(dāng)本發(fā)明的脂質(zhì)體由脂質(zhì)混合物形成時(shí)，優(yōu)選地，那些含有式(I)或(XI)的脂質(zhì)比例應(yīng)該在脂質(zhì)總量的20-80%之間，如30-70%之間或40-60%之間。例如，有用的脂質(zhì)體示于下文，其中40%或60%的總脂質(zhì)是式(I)的脂質(zhì)。其余部分可以由如膽固醇（如35-50%膽固醇）和/或DMG（可選PEG化的）和/或DSPC構(gòu)成。這種混合物在下文使用。這些百分比值為摩爾百分比。脂質(zhì)體可包含親水部分PEG化的（即通過聚乙二醇共價(jià)結(jié)合修飾的）兩親性脂質(zhì)。這些修飾可增加穩(wěn)定性并防止所述脂質(zhì)體的非特異性吸收。例如，可使用如參考文獻(xiàn)2和3公開的技術(shù)將脂質(zhì)與PEG結(jié)合。有用的PEG化脂質(zhì)包含PEG-DMG和參考文獻(xiàn)8的式(XI)的脂質(zhì)。PEG為所述脂質(zhì)體提供包衣，該包衣可賦予有利的藥代動(dòng)力學(xué)特性?？墒褂酶鞣N長(zhǎng)度如0.5-8kDa之間的PEG。用于形成本發(fā)明脂質(zhì)體的有用的脂質(zhì)混合物包括：式(I)的陽離子脂質(zhì)；膽固醇；和PEG化的脂質(zhì)，例如PEG-DMG，即PEG結(jié)合的1,2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]。這種混合物也可包含中性的兩親性脂質(zhì)，例如DSPC(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿)或DPyPE。這些（和其它）混合物在下面實(shí)施例中使用。脂質(zhì)體通常分為3組：多層囊泡(MLV)；小單層囊泡(SUV)；和大單層囊泡(LUV)。MLV的各囊泡中具有多種雙分子層，形成幾個(gè)分開的水隔間。SUV和LUV具有包埋水核心的單一雙分子層；SUV通常直徑≤50nm，LUV直徑>50nm。本發(fā)明的脂質(zhì)體理想地是直徑在60-180nm范圍內(nèi)并優(yōu)選80-160nm范圍內(nèi)的LUV。本發(fā)明的脂質(zhì)體可以是組合物的一部分，該組合物包括多種脂質(zhì)體并且該多種脂質(zhì)體中的脂質(zhì)體直徑在一定范圍內(nèi)。對(duì)于包括不同直徑的脂質(zhì)體群體的組合物：(i)至少80％數(shù)量的脂質(zhì)體的直徑應(yīng)該在60-180nm范圍內(nèi)，且優(yōu)選在80-160nm范圍內(nèi)，和/或(ii)群體的平均直徑（依據(jù)強(qiáng)度，例如Z-平均值）理想地在60-180nm范圍內(nèi)，且優(yōu)選在80-160nm范圍內(nèi)。多種脂質(zhì)體的直徑的分散性指數(shù)理想地應(yīng)為<0.2。參考文獻(xiàn)1中的脂質(zhì)體/RNA復(fù)合物預(yù)期直徑在600-800nm范圍內(nèi)并且具有高分散性。群體中的直徑可以利用動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定。制備合適脂質(zhì)體的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知，如參見參考文獻(xiàn)4至6。參考文獻(xiàn)7中描述了一種有用的方法，該方法涉及混合(i)脂質(zhì)的乙醇溶液(ii)核酸的水溶液和(iii)緩沖液，然后混合、平衡、稀釋并純化。本發(fā)明的優(yōu)選脂質(zhì)體可通過該混合過程獲得。為獲得具有所需直徑的脂質(zhì)體，可使用以下過程進(jìn)行混合：將兩個(gè)RNA水溶液的原料流與一個(gè)乙醇脂質(zhì)溶液流在單一的混合區(qū)中合并，其中所有的流量相同，例如在如下文所述的微流體通道中。式(I)式(I)的陽離子脂質(zhì)如下：其中：R1和R2與其相連的氮原子一起形成任選取代的C3-20-雜環(huán)烷基、C3-20-雜環(huán)烯基、C3-20-雜環(huán)炔基或C5-20-雜芳基基團(tuán)；a不存在或是任選取代的C1-4亞烷基；b不存在或是任選取代的C1-4亞烷基；c不存在或是任選取代的C1-4亞烷基；X1是O或S；X2是O或S；Y1是任選取代的C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L不存在或是–(La)d–(Lb)e–(Lc)f–，其中La是任選取代的C1-15亞烷基、C1-15亞烯基、C1-15亞炔基、C1-15雜亞烷基、C1-15雜亞烯基、或C1-15雜亞炔基；Lb是任選取代的C6-14亞芳基或C5-13雜亞芳基；Lc是任選取代的C1-15亞烷基、C1-15亞烯基、C1-15亞炔基、C1-15雜亞烷基、C1-15雜亞烯基或C1-15雜亞炔基；d是0或1;e是0或1；和f是0或1；和Y2是任選取代的類固醇。因此R1和R2與其相連的氮原子一起形成具有叔胺的環(huán)狀“頭部基團(tuán)”。參考文獻(xiàn)8中有這些化合物更詳細(xì)的描述，其全部?jī)?nèi)容通過引用納入本文。在一些實(shí)施方式中，式(I)的化合物含有式(II)：其中：R1和R2與其相連的氮原子一起形成任選取代的C3-20-雜環(huán)烷基、C3-20-雜環(huán)烯基、C3-20-雜環(huán)炔基或C5-20-雜芳基基團(tuán)；a不存在或是任選取代的C1-4亞烷基；b不存在或是任選取代的C1-4亞烷基；c不存在或是任選取代的C1-4亞烷基；X1是O或S；X2是O或S；Y1是任選取代的C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L是–(La)d–(Lb)e–(Lc)f–，其中La是任選取代的C1-15亞烷基、C1-15亞烯基、C1-15亞炔基、C1-15雜亞烷基、C1-15雜亞烯基、或C1-15雜亞炔基；Lb是任選取代的C6-14亞芳基或C5-13雜亞芳基；Lc是任選取代的C1-15亞烷基、C1-15亞烯基、C1-15亞炔基、C1-15雜亞烷基、C1-15雜亞烯基或C1-15雜亞炔基；d是0或1;e是0或1；和f是0或1；前提是L包含一個(gè)或多個(gè)雜原子，并且Y2是任選取代的類固醇。在一些實(shí)施方式中，式(I)的化合物含有式(III）：其中：R1和R2與其相連的氮原子一起形成任選取代的C3-20-雜環(huán)烷基、C3-20-雜環(huán)烯基、C3-20-雜環(huán)炔基或C5-20-雜芳基基團(tuán)；a是亞甲基；b是亞甲基；c不存在；X1是O或S；X2是O或S；Y1是任選取代的C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L是–(La)d–(Lb)e–(Lc)f–，其中La是任選取代的C1-15亞烷基、C1-15亞烯基、C1-15亞炔基、C1-15雜亞烷基、C1-15雜亞烯基、或C1-15雜亞炔基；Lb是任選取代的C6-14亞芳基或C5-13雜亞芳基；Lc是任選取代的C1-15亞烷基、C1-15亞烯基、C1-15亞炔基、C1-15雜亞烷基、C1-15雜亞烯基或C1-15雜亞炔基；d是0或1;e是0或1；和f是0或1；和Y2是任選取代的類固醇。在一些實(shí)施方式中，式(I)的化合物含有式(IV)：其中：R1和R2與其相連的氮原子一起形成任選取代的C3-20-雜環(huán)烷基、C3-20-雜環(huán)烯基、C3-20-雜環(huán)炔基或C5-20-雜芳基基團(tuán)；a是亞甲基；b是亞甲基；c不存在；X1是O或S；X2是O或S；Y1是任選取代的C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L是–(La)d–(Lb)e–(Lc)f–，其中La是任選取代的C1-15亞烷基、C1-15亞烯基、C1-15亞炔基、C1-15雜亞烷基、C1-15雜亞烯基、或C1-15雜亞炔基；Lb是任選取代的C6-14亞芳基或C5-13雜亞芳基；Lc是任選取代的C1-15亞烷基、C1-15亞烯基、C1-15亞炔基、C1-15雜亞烷基、C1-15雜亞烯基或C1-15雜亞炔基；d是0或1;e是0或1；和f是0或1；前提是L包含一個(gè)或多個(gè)雜原子，并且Y2是任選取代的類固醇。在一些實(shí)施方式中，式(I)的化合物含有式(V)：其中：R1和R2與其相連的氮原子一起形成任選取代的C3-20-雜環(huán)烷基、C3-20-雜環(huán)烯基、C3-20-雜環(huán)炔基或C5-20-雜芳基基團(tuán)；a是亞甲基；b是亞甲基；c不存在；X1是O;X2是O;Y1是任選取代的C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L是–(La)d–(Lb)e–(Lc)f–，其中La是任選取代的C1-15亞烷基、C1-15亞烯基、C1-15亞炔基、C1-15雜亞烷基、C1-15雜亞烯基或C1-15雜亞炔基；Lb是任選取代的C6-14亞芳基或C5-13雜亞芳基；Lc是任選取代的C1-15亞烷基、C1-15亞烯基、C1-15亞炔基、C1-15雜亞烷基、C1-15雜亞烯基或C1-15雜亞炔基；d是0或1;e是0或1；和f是0或1；前提是L包含一個(gè)或多個(gè)雜原子，并且Y2是任選取代的類固醇。在一些實(shí)施方式中，式(I)的化合物含有式(VI)：其中：R1和R2與其相連的氮原子一起形成任選取代的C3-20-雜環(huán)烷基、C3-20-雜環(huán)烯基、C3-20-雜環(huán)炔基或C5-20-雜芳基基團(tuán)；a是亞甲基；b是亞甲基；c不存在；X1是O;X2是O;Y1是任選取代的C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L是–Lc–，其中Lc是任選取代的C1-15雜亞烷基、C1-15雜亞烯基或C1-15雜亞炔基；且Y2是任選取代的類固醇。在一些實(shí)施方式中，式(I)的化合物含有式(VII)：其中：R1和R2與其相連的氮原子一起形成任選取代的C3-20-雜環(huán)烷基、C3-20-雜環(huán)烯基、C3-20-雜環(huán)炔基或C5-20-雜芳基基團(tuán)；a是亞甲基；b是亞甲基；c不存在；X1是O;X2是O;Y1是任選取代的C16-22烯基基團(tuán)，L是–Lc–，其中Lc是任選取代的C1-15雜亞烷基、C1-15雜亞烯基或C1-15雜亞炔基；且Y2是任選取代的類固醇。在一些實(shí)施方式中，式(I)的化合物含有式(VIII)：其中：R1和R2與其相連的氮原子一起形成任選取代的C3-20-雜環(huán)烷基、C3-20-雜環(huán)烯基、C3-20-雜環(huán)炔基或C5-20-雜芳基基團(tuán)；a是亞甲基；b是亞甲基；c不存在；X1是O;X2是O;Y1是任選取代的C16-22烯基基團(tuán)，L是–Lc–，其中Lc是任選取代的C1-15雜亞烷基、C1-15雜亞烯基或C1-15雜亞炔基；且Y2是通過A類固醇環(huán)的3位上的羥基連接的膽固醇，所述羥基的氫原子不存在。在一些實(shí)施方式中，式(I)的化合物含有式(IX)：其中：R1和R2與其相連的氮原子一起形成任選取代的C3-20-雜環(huán)烷基、C3-20-雜環(huán)烯基、C3-20-雜環(huán)炔基或C5-20-雜芳基基團(tuán)；a是亞甲基；b是亞甲基；c不存在；X1是O或S；X2是O或S；Y1是任選取代的C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L是–(La)d–(Lb)e–(Lc)f–，其中La是任選取代的C1-15亞烷基、C1-15亞烯基、C1-15亞炔基、C1-15雜亞烷基、C1-15雜亞烯基或C1-15雜亞炔基；Lb是任選取代的C6-14亞芳基或C5-13雜亞芳基；Lc是任選取代的C1-15亞烷基、C1-15亞烯基、C1-15亞炔基、C1-15雜亞烷基、C1-15雜亞烯基或C1-15雜亞炔基；d是0或1;e是0或1；和f是0或1；前提是L包含一個(gè)或多個(gè)雜原子，Y2是任選取代的類固醇；且該化合物的pKa值為約5.9至約7。在一些實(shí)施方式中，式(I)的化合物含有式(X)：其中：R1和R2與其相連的氮原子一起形成任選取代的C3-20-雜環(huán)烷基、C3-20-雜環(huán)烯基、C3-20-雜環(huán)炔基或C5-20-雜芳基基團(tuán)；a是亞甲基；b是亞甲基；c不存在；X1是O或S；X2是O或S；Y1是任選取代的C10-30烯基、C10-30炔基、C10-30雜烯基或C10-30雜炔基；L是–(La)d–(Lb)e–(Lc)f–，其中La是任選取代的C1-15亞烷基、C1-15亞烯基、C1-15亞炔基、C1-15雜亞烷基、C1-15雜亞烯基或C1-15雜亞炔基；Lb是任選取代的C6-14亞芳基或C5-13雜亞芳基；Lc是任選取代的C1-15亞烷基、C1-15亞烯基、C1-15亞炔基、C1-15雜亞烷基、C1-15雜亞烯基或C1-15雜亞炔基；d是0或1;e是0或1；和f是0或1；前提是L包含一個(gè)或多個(gè)雜原子，Y2是任選取代的類固醇；且該化合物的pKa值為約4.5至約6.2。a、b和c在一個(gè)實(shí)施方式中，a是任選取代的C1-2亞烷基。在另一個(gè)實(shí)施方式中，a是任選取代的C1亞烷基。在一個(gè)實(shí)施方式中，b是任選取代的C0-2亞烷基。在另一個(gè)實(shí)施方式中，b是任選取代的C1亞烷基。在一個(gè)實(shí)施方式中，c不存在或是任選取代的C1亞烷基。在另一個(gè)實(shí)施方式中，c不存在。在一個(gè)實(shí)施方式中，如果a、b、和c存在，是未取代的。頭部基團(tuán)在一個(gè)實(shí)施方式中，R1和R2與其相連的氮原子一起形成任選取代的C3-20-雜環(huán)烷基、C3-20-雜環(huán)烯基、C3-20-雜環(huán)炔基基團(tuán)、C5-雜芳基或C6-雜芳基基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，R1和R2與其相連的氮原子一起形成任選取代的C3-20-雜環(huán)烷基、C3-20-雜環(huán)烯基或C3-20-雜環(huán)炔基基團(tuán)。在另一實(shí)施方式中，R1和R2與其相連的氮原子一起形成任選取代的C3-20-雜環(huán)烷基基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，R1和R2與其相連的氮原子一起形成任選取代的C5-16基團(tuán)。在另一實(shí)施方式中，R1和R2與其相連的氮原子一起形成任選取代的C5-12基團(tuán)。在另一實(shí)施方式中，R1和R2與其相連的氮原子一起形成任選取代的C5基團(tuán)、C6基團(tuán)或C7基團(tuán)。在另一實(shí)施方式中，R1和R2與其相連的氮原子一起形成任選取代的C5基團(tuán)或C6基團(tuán)。在一個(gè)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，R1和R2與其相連的氮原子一起形成包含至少一個(gè)氧原子的物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，R1和R2與其相連的氮原子選自表1中提供的H1至H48。表1－名為H1至H48的部分X1和X2在一個(gè)實(shí)施方式中，X1是O。在另一個(gè)實(shí)施方式中，X2是O。在另一個(gè)實(shí)施方式中，X1和X2都是O。連接部位在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，L包含至少一個(gè)雜原子。這意味著提供X2和Y2之間直接連接的鏈具有至少一個(gè)雜原子，或換言之，L上的取代基中的任何雜原子對(duì)這些目的不重要。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，L包含至少一個(gè)O原子。在一個(gè)實(shí)施方式中，L包含至少兩個(gè)雜原子。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，L包含至少兩個(gè)O原子。在一個(gè)實(shí)施方式中，Lc是任選取代的C1-15亞烷基或C1-15雜亞烷基。在一個(gè)實(shí)施方式中，Lc是任選取代的C1-15亞烷基或C1-15雜亞烷基且d和e都為0。在一個(gè)實(shí)施方式中，Lc選自式Lc-i至式Lc-xxiii中的一個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方式中，Lc選自式Lc-i至式Lc-xxiii中的一個(gè)且d和e都為0。Lc-xxiii-(CH2)2NHC(=O)CH(側(cè)鏈-1)NHC(=O)-，其中側(cè)鏈-1代表基團(tuán)虛線代表與分子其余部分的連接。因?yàn)閮?yōu)選其中的L包含至少一個(gè)雜原子的基團(tuán)，Lc優(yōu)選選自Lc-i、Lc-v至Lc-vii和Lc-ix至Lc-xxiii。在一個(gè)實(shí)施方式中，Lc是任選取代的C1-15雜亞烷基。在一個(gè)實(shí)施方式中，Lc是任選取代的C1-11基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，Lc是任選取代的C1-9基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，Lc是任選取代的C3-8基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，其中Lc是任選取代的C4-7基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，Lc是任選取代的C5、C6或C7基團(tuán)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，d是0；e是0，并且f是1。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，d是0；e是0，并且f是1且Lc是在上述鏈長(zhǎng)之間的雜亞烷基。Y1在一個(gè)實(shí)施方式中，Y1是C12-28基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，Y1是C14-26基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，Y1是C16-24基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，Y1是C16-22基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，Y1鏈為18、19、20或21個(gè)原子長(zhǎng)度。在上述的碳鏈范圍中，Y1優(yōu)選烯基或雜烯基。在一個(gè)實(shí)施方式中，Y1具有至少一個(gè)烯烴基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，Y1具有1、2或3個(gè)烯烴基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，Y1在ω-3位具有烯烴基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，Y1在ω-6位具有烯烴基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，Y1在ω-9位具有烯烴基團(tuán)。在另一實(shí)施方式中，Y1在ω-3、ω-6和ω-9中的兩個(gè)或三個(gè)位置上具有烯烴基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，Y1在ω-6和ω-9位上是不飽和的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，Y1在ω-3、ω-6和ω-9位上是不飽和的。在一個(gè)實(shí)施方式中，Y1在ω-9位上是不飽和的。在一個(gè)實(shí)施方式中，Y1具有至少一個(gè)順式不飽和烯烴基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，Y1具有至少兩個(gè)順式不飽和烯烴基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，Y1具有至少三個(gè)順式不飽和烯烴基團(tuán)。所述至少一個(gè)順式不飽和烯烴基團(tuán)可以在ω-3、ω-6和ω-9位中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)位置上。MacLachlan等,控釋雜志(JournalofControlledRelease)107(2005)276-287中討論了脂質(zhì)鏈上的不飽和現(xiàn)象。在一個(gè)實(shí)施方式中，Y1選自表2中提供的Y1-i至Y1-vi。表2.名為Y1-i至Y1-v的Y1相關(guān)部分Y2在一個(gè)實(shí)施方式中，Y2通過任選取代的類固醇上的氧原子與L連接。在另一個(gè)實(shí)施方式中，Y2通過A類固醇環(huán)的3位上的氧原子與L連接。在另一個(gè)實(shí)施方式中，Y2是固醇，該固醇中去除了A類固醇環(huán)3位上的羥基的氫原子（并且通過所述羥基的氧原子與L連接）。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述固醇選自由以下組成的組：安娜固醇（annasterol）、燕麥甾醇、β-谷甾醇、菜子甾醇、鈣化固醇、油菜甾醇、查理諾固醇（chalinosterol）、支那固醇（chinasterol）、膽甾烷醇、膽固醇、糞甾醇、環(huán)阿屯醇、脫氫膽甾醇、鏈膽甾醇、二氫鈣化甾醇、二氫膽甾醇、二氫麥角甾醇、甲藻甾醇、表膽固醇、麥角固醇、巖藻甾醇、六氫光固醇、六醇、羥基膽甾醇、羊毛甾醇、光固醇、帕克醇、多孔甾醇、海藻甾醇、二氫谷甾醇、谷甾醇、豆甾烷醇、豆甾醇、溫伯固醇(weinbersterol)、酵母甾醇、固醇膽汁酸(例如膽酸、鵝去氧膽酸、甘膽酸、?；悄懰帷⑷パ跄懰岷褪懰?、和它們的鹽。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述固醇是膽固醇。pKa脂質(zhì)的pKa值是指50％脂質(zhì)帶電荷時(shí)的pH值，位于所述脂質(zhì)完全帶電荷和所述脂質(zhì)完全不帶電荷的中間。其可通過多種方法測(cè)定，但優(yōu)選使用以下公開的方法測(cè)定。測(cè)定pKa值通常應(yīng)該測(cè)定單獨(dú)的脂質(zhì)而不是測(cè)定還包含其它脂質(zhì)的混合物中的脂質(zhì)（例如，并非如參考文獻(xiàn)2中實(shí)施的那樣，其考察SNALP的pKa值而非單獨(dú)脂質(zhì)的pKa值）。在標(biāo)準(zhǔn)溫度和壓力下，使用以下技術(shù)在水中測(cè)定脂質(zhì)的pKa值：·通過稱重所述脂質(zhì)并溶解于乙醇來制備乙醇中的2mM脂質(zhì)溶液。在乙醇:甲醇為9:1中的0.3mM熒光探針甲苯硝基磺酸(TNS)溶液通過先在甲醇中制備3mMTNS溶液然后用乙醇稀釋至0.3mM來制備?！ぶ苽浜姿徕c、檸檬酸鈉、乙酸鈉和氯化鈉的緩沖水溶液，濃度分別為20mM、25mM、20mM和150mM。將所述緩沖液分成八份，并用12NHCl或6NNaOH將pH調(diào)至4.44-4.52、5.27、6.15-6.21、6.57、7.10-7.20、7.72-7.80、8.27-8.33和10.47-11.12。將400uL的2mM脂質(zhì)溶液和800uL的0.3mMTNS混合?！?.5μL的探針/脂質(zhì)混合物添加到1mL96孔板中的242.5μL緩沖液中。對(duì)所有八份緩沖液實(shí)施該步驟。混合后，將100uL各探針/脂質(zhì)/緩沖液混合物轉(zhuǎn)移至250uL黑色透明底的96孔板中(例如，型號(hào)COSTAR3904，康寧公司(Corning))?！び?22nm激發(fā)波長(zhǎng)，431nm發(fā)射波長(zhǎng)(在420nm自動(dòng)截止)測(cè)定各探針/脂質(zhì)/緩沖液混合物的熒光(例如，使用SpectraMaxM5分光光度計(jì)和SoftMaxpro5.2軟件)?！y(cè)定后，各探針/脂質(zhì)/緩沖液混合物減去96孔板上的空孔背景熒光值。接著將熒光強(qiáng)度值標(biāo)準(zhǔn)化至在最低pH處的數(shù)值。然后將標(biāo)準(zhǔn)化的熒光強(qiáng)度對(duì)pH值作圖，并提供最佳符合線?！ぐl(fā)現(xiàn)最佳符合線上標(biāo)準(zhǔn)化熒光強(qiáng)度所在點(diǎn)等于0.5。發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化熒光強(qiáng)度的相應(yīng)pH值等于0.5，并視其為所述脂質(zhì)的pKa。具有pKa在5.0至7.6范圍內(nèi)的脂質(zhì)表現(xiàn)最佳免疫結(jié)果。在該pKa范圍內(nèi)，優(yōu)選脂質(zhì)的pKa是5.5至6.7，例如5.6至6.8、5.6至6.3、5.6至6.0、5.5至6.2，或5.7至5.9。式(I)的具體化合物參考文獻(xiàn)8中公開了對(duì)本發(fā)明有用的式(I)的具體化合物。例如，所述化合物可以是E0024、E0014、E0052、E0118、E0083、E0011、E0008、E0025、E0026、E0069、E0076、E0077、E0078、E0085或E0088。所述化合物可以是示于下文的在“RV03”至“RV12”或“RV15”脂質(zhì)體中使用的脂質(zhì)。優(yōu)選的化合物是E0026、E0069和E0078。優(yōu)選的化合物是示于下文的在“RV05”、“RV08”和“RV09”脂質(zhì)體中使用的脂質(zhì)。在替代的實(shí)施方式中，本發(fā)明的脂質(zhì)體不使用式(I)的化合物而使用“RV02”化合物（結(jié)構(gòu)示于下文）。除了這個(gè)取代，本文別處描述了這些包含RV02的脂質(zhì)體的所有其它方面。式(XI)式(XI)的化合物是包含N末端烷基酰胺和2至10個(gè)氨基酸的陽離子脂肽脂肽。式(XI)是：Ra-(AA)z-Rb其中，Ra是N末端烷基酰胺；z是2至10的整數(shù)；每個(gè)AA是氨基酸，前提是存在至少一個(gè)組氨酸或存在至少一個(gè)陽離子氨基酸；Rb是-H、-OH或-NH2。Ra部分具有式Rc-C(O)-NRd-，其中Rc是C2至C24烷基，Rd是–H或C1至C4烷基。適合的Rc基團(tuán)包括月桂基（‘Lau’；C12）和棕櫚酰胺（‘Pal’；C16）。Ra部分的酰胺與2至10個(gè)氨基酸如3至8個(gè)氨基酸的寡肽鏈相連。該鏈包含至少一個(gè)（例如1、2、3、4或5個(gè)）組氨酸。該鏈還包含至少一個(gè)陽離子氨基酸，例如至少一個(gè)精氨酸、賴氨酸或鳥氨酸殘基。優(yōu)選包含至少一個(gè)賴氨酸，并且理想地是包含2或3個(gè)賴氨酸。包含組氨酸的原因是其側(cè)鏈為弱堿性并且主要在生理pH時(shí)非離子化，但在核內(nèi)體的弱酸性環(huán)境中更高度地質(zhì)子化。陽離子氨基酸，如賴氨酸或精氨酸，在中性pH時(shí)對(duì)脂肽提供一個(gè)單位的正電荷。有用的寡肽含有氨基酸序列-C-Ki-Hj-，其中：I是1、2或3；且j是1、2、3、4或5。寡肽鏈的C末端可以保持為–COOH或可以代替形成酰胺。式(XI)的化合物可以在其烷基鏈、氨基酸鏈和C末端基團(tuán)的方面進(jìn)行描述。例如，脂肽“Lau-(C-K-H-H)-NH2”具有N末端月桂基鏈，然后半胱氨酸，然后賴氨酸，然后兩個(gè)組氨酸和C末端胺。因此適合的式(XI)的脂肽包括但不限于：Lau-(C-K-K-H)-NH2、Pal-(C-K-H-H)-NH2、Pal-(C-K-K-H-H)-NH2、Pal-(C-K-K-H-H-H)-NH2、Pal-(C-K-K-H-H-H-H)-NH2、Pal-(C-K-K-H-H-H-H-H)-NH2、Pal-(C-K-K-K-H-H)-NH2和Pal-(C-K-K-K-H-H-H)-NH2。參考文獻(xiàn)9公開了這些和其它化合物在，并包括：RNA本發(fā)明的脂質(zhì)體包括編碼多肽的RNA分子（不同于siRNA，如參考文獻(xiàn)中）。體內(nèi)給予所述顆粒后，RNA從顆粒中釋放出來并在細(xì)胞中翻譯以提供原位所述多肽。所述RNA為+-鏈，并且不需要任何間插性的復(fù)制步驟如逆轉(zhuǎn)錄通過細(xì)胞進(jìn)行翻譯。所述RNA也可以與免疫細(xì)胞表達(dá)的TLR7受體結(jié)合，從而引發(fā)有助于免疫目的佐劑效應(yīng)。優(yōu)選的+-鏈RNA是自復(fù)制RNA。自復(fù)制RNA分子（復(fù)制子）在甚至無任何蛋白遞送到脊椎動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，能通過由自身（或通過由自身產(chǎn)生的反義拷貝）轉(zhuǎn)錄引導(dǎo)生成多子代RNA。因此自復(fù)制RNA分子通常是+-鏈分子，其遞送到細(xì)胞后能直接翻譯，且該翻譯提供RNA依賴性RNA聚合酶，該RNA聚合酶然后由遞送的RNA生成反義和正義轉(zhuǎn)錄本。因此遞送的RNA引導(dǎo)生成多子代RNA。這些子代RNA以及共線亞基因組轉(zhuǎn)錄本可自身翻譯以提供編碼感興趣多肽的原位表達(dá)，或可轉(zhuǎn)錄以提供與遞送的RNA同義的其它轉(zhuǎn)錄本，遞送的RNA經(jīng)翻譯以提供感興趣多肽的原位表達(dá)。此轉(zhuǎn)錄序列的總體結(jié)果是大幅擴(kuò)增引入的復(fù)制子RNA，因此編碼的感興趣多肽變?yōu)榧?xì)胞的主要產(chǎn)物。實(shí)現(xiàn)自復(fù)制的一種合適系統(tǒng)為使用基于α病毒的RNA復(fù)制子。這些+-鏈復(fù)制子在遞送到細(xì)胞后翻譯以得到復(fù)制酶（或復(fù)制酶-逆轉(zhuǎn)錄酶）。這些復(fù)制酶翻譯為自切割產(chǎn)生復(fù)制復(fù)合物的多聚蛋白，所述復(fù)合物引起該+-鏈遞送的RNA的基因組–-鏈拷貝。這些-–-鏈轉(zhuǎn)錄本可自我轉(zhuǎn)錄以得到+-鏈親本RNA的其它拷貝和得到編碼感興趣多肽的亞基因組轉(zhuǎn)錄本。因此所述亞基因組轉(zhuǎn)錄本的翻譯引起感染細(xì)胞原位表達(dá)多肽。合適的α病毒復(fù)制子可使用來自辛德畢斯病毒、西門利克森林病毒、東部馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒等的復(fù)制酶?？墒褂猛蛔兓蛞吧筒《拘蛄?，例如VEEV減毒TC83突變體已被用于復(fù)制子中[10]。因此優(yōu)選的自復(fù)制RNA分子編碼(i)RNA依賴性RNA聚合酶，所述RNA聚合酶可從所述自復(fù)制RNA分子轉(zhuǎn)錄RNA和(ii)感興趣的多肽。所述聚合酶可為α病毒復(fù)制酶，例如包括一種或多種α病毒蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4。盡管除了非結(jié)構(gòu)性復(fù)制酶多聚蛋白，天然α病毒基因組還編碼結(jié)構(gòu)病毒體蛋白，但本發(fā)明的自復(fù)制RNA分子優(yōu)選不編碼α病毒結(jié)構(gòu)蛋白。因此優(yōu)選的自復(fù)制RNA可引起產(chǎn)生細(xì)胞中自身的基因組RNA拷貝，但不生成含RNA的病毒顆粒。不能生成這些病毒體說明自復(fù)制RNA分子不像野生型α病毒，其自身不能以感染形式永存。野生型病毒中永存必需的α病毒結(jié)構(gòu)蛋白在本發(fā)明的自復(fù)制RNA中缺失，且他們的位置被編碼感興趣多肽的基因占據(jù)，如此以致亞基因組轉(zhuǎn)錄本編碼該多肽而非結(jié)構(gòu)α病毒病毒體蛋白。因此本發(fā)明有用的自復(fù)制RNA分子可具有兩個(gè)開放閱讀框。第一個(gè)(5')開放閱讀框編碼復(fù)制酶；第二個(gè)(3')開放閱讀框編碼感興趣的多肽。在一些實(shí)施方式中，所述RNA可具有額外的（例如下游）開放閱讀框，例如用于編碼其他感興趣多肽(見下文)或編碼輔助多肽。自復(fù)制RNA分子可具有與所述編碼的復(fù)制酶相容的5'序列。自復(fù)制RNA分子可具有各種長(zhǎng)度，但其通常為5000-25000核苷酸長(zhǎng)度，如8000-15000核苷酸或9000-12000核苷酸。因此該RNA比見于siRNA遞送中的長(zhǎng)。本發(fā)明有用的RNA分子可具有5'帽（例如7-甲基鳥苷）。該帽可增強(qiáng)所述RNA的體內(nèi)翻譯。本發(fā)明有用的RNA分子的5'核苷酸可具有5'三磷酸基團(tuán)。在加帽的RNA中其可通過5'-至-5'橋與7-甲基鳥苷連接。5'三磷酸可增強(qiáng)RIG-I結(jié)合并因此促進(jìn)佐劑效應(yīng)。RNA分子可具有3'聚=A尾部。RNA分子還可在其3'末端附近包含聚-A聚合酶識(shí)別序列（如AAUAAA）。本發(fā)明有用的RNA分子通常為單鏈。單鏈RNA通常能通過與TLR7、TLR8、RNA解旋酶和/或PKR結(jié)合引起佐劑效應(yīng)。以雙鏈形式遞送的RNA（dsRNA）可與TLR3結(jié)合，并且該受體還會(huì)被在單鏈RNA復(fù)制中或單鏈RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中形成的dsRNA觸發(fā)。本發(fā)明有用的RNA分子可通過體外轉(zhuǎn)錄（IVT）方便地制備。IVT可使用細(xì)菌中以質(zhì)粒形式產(chǎn)生和增殖或合成產(chǎn)生（例如通過基因合成和/或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）工程改造方法）的(cDNA)模板。例如，DNA依賴性RNA聚合酶（如噬菌體T7、T3或SP6RNA聚合酶）可用于從DNA模板轉(zhuǎn)錄RNA。合適的加帽和聚-A加成反應(yīng)可按需使用（盡管所述復(fù)制子的聚A通常在DNA模板內(nèi)編碼）。這些RNA聚合酶可對(duì)轉(zhuǎn)錄的5'核苷酸有嚴(yán)格的要求，且在一些實(shí)施方式中，這些要求必須與所編碼的復(fù)制酶的要求匹配，以確保IVT-轉(zhuǎn)錄的RNA能有效作為其自身編碼復(fù)制酶的底物發(fā)揮作用。如參考文獻(xiàn)11中討論的，所述自復(fù)制RNA可包括（除了任何5'帽結(jié)構(gòu)）一個(gè)或多個(gè)具有修飾的核堿基的核苷酸。因此所述RNA可包括：m5C(5-甲基胞苷)、m5U(5-甲基尿苷)、m6A(N6-甲基腺苷)、s2U(2-硫代尿苷)、Um(2'-O-甲基尿苷)、m1A(l-甲基腺苷)、m2A(2-甲基腺苷)、Am(2'-O-甲基腺苷)、ms2m6A(2-甲硫基-N6-甲基腺苷)、i6A(N6-異戊烯基腺苷)、ms2i6A(2-甲硫基-N6異戊烯基腺苷)、io6A(N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷)、ms2io6A(2-甲硫基-N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷)、g6A(N6-甘氨酰氨甲?；佘?、t6A(N6-蘇氨酰氨甲酰基腺苷)、ms2t6A(2-甲基硫-N6-蘇氨酰氨甲?；佘?、m6t6A(N6-甲基-N6-蘇氨酰氨甲酰基腺苷)、hn6A(N6-羥基正纈氨酰氨甲?；佘?、ms2hn6A(2-甲硫基-N6-羥基正纈氨酰氨甲?；佘?、Ar(p)(2'-O-核糖基腺苷(磷酸))、I(肌苷)、m11(1-甲基肌苷)、m'Im(1,2'-O-二甲基肌苷)、m3C(3-甲基胞苷)、Cm(2T-O-甲基胞苷)、s2C(2-巰基胞苷)、ac4C(N4-乙酰胞苷)、f5C(5-甲?；?、m5Cm(5,2-O-二甲基胞苷)、ac4Cm(N4乙酰基2TO甲基胞苷)、k2C(賴西丁)、m1G(1-甲基鳥苷)、m2G(N2-甲基鳥苷)、m7G(7-甲基鳥苷)、Gm(2'-O-甲基鳥苷)、m22G(N2,N2-二甲基鳥苷)、m2Gm(N2,2'-O-二甲基鳥苷)、m22Gm(N2,N2,2'-O-三甲基鳥苷)、Gr(p)(2'-O-核糖基鳥苷(磷酸))、yW(懷丁苷)、o2yW(過氧懷丁苷)、OHyW(羥基懷丁苷)、OHyW*(經(jīng)改性羥基懷丁苷)、imG(懷俄苷)、mimG(甲基鳥苷)、Q(q苷)、oQ(環(huán)氧q苷)、galQ(半乳糖-q苷)、manQ(甘露糖-q苷)、preQo(7-氰基-7-脫氮鳥苷)、preQi(7-氨甲基-7-脫氮鳥苷取代鳥苷)、G*(古嘌苷)、D(二氫尿苷)、m5Um(5,2'-O-二甲基尿苷)、s4U(4-硫代尿苷)、m5s2U(5-甲基-2-硫代尿苷)、s2Um(2-硫代-2'-O-甲基尿苷)、acp3U(3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷)、ho5U(5-羥基尿苷)、mo5U(5-甲氧基尿苷)、cmo5U(尿苷5-氧乙酸)、mcmo5U(尿苷5-氧乙酸甲酯)、chm5U(5-(羧基羥基甲基)尿苷))、mchm5U(5-(羧基羥基甲基)尿苷甲酯)、mcm5U(5-甲氧羰基甲基尿苷)、mcm5Um(S-甲氧羰基甲基-2-O-甲基尿苷)、mcm5s2U(5-甲氧羰基甲基-2-硫代尿苷)、nm5s2U(5-氨基甲基-2-硫代尿苷)、mnm5U(5-甲氨基甲基尿苷)、mnm5s2U(5-甲氨基甲基-2-硫代尿苷)、mnm5se2U(5-甲氨基甲基-2-硒基尿苷)、ncm5U(5-氨甲酰基甲基尿苷)、ncm5Um(5-氨甲?；谆?2'-O-甲基尿苷)、cmnm5U(5-羧甲基氨甲基尿苷)、cnmm5Um(5-羧甲基氨甲基-2-L-O甲基尿苷)、cmnm5s2U(5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷)、m62A(N6,N6-二甲基腺苷)、Tm(2'-O-甲基肌苷)、m4C(N4-甲基胞苷)、m4Cm(N4,2-O-二甲基胞苷)、hm5C(5-羥甲基胞苷)、m3U(3-甲基尿苷)、cm5U(5-羧甲基尿苷)、m6Am(N6,T-O-二甲基腺苷)、rn62Am(N6,N6,O-2-三甲基腺苷)、m2'7G(N2,7-二甲基鳥苷)、m2'2'7G(N2,N2,7-三甲基鳥苷)、m3Um(3,2T-O-二甲基尿苷)、m5D(5-甲基二氫尿苷)、f5Cm(5-甲酰基-2'-O-甲基胞苷)、m1Gm(1,2'-O-二甲基鳥苷)、m'Am(1,2-O-二甲基腺苷)虹膜甲基尿苷)（irinomethyluridine）、tm5s2U(S-?；撬峒谆?2-硫代尿苷))、imG-14(4-去甲基鳥苷)、imG2(異鳥苷)，或ac6A(N6-乙酰腺苷)、次黃嘌呤、肌苷、8-氧代-腺嘌呤、它的7-取代衍生物、二氫尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羥甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二甲基鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、8-氮鳥嘌呤、7-脫氮-7-取代鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤-7-(C2-C6)炔基鳥嘌呤、7-脫氮-8-取代鳥嘌呤、8-羥基鳥嘌呤、6-硫鳥嘌呤、8-氧鳥嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,4-二氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、8-氮嘌呤、取代7-脫氮嘌呤、7-脫氮-7-取代嘌呤、7-脫氮-8-取代嘌呤、或脫堿基核苷酸。例如，自復(fù)制RNA可包括一種或多種修飾的嘧啶核堿基，例如假尿苷和/或5-甲基胞嘧啶殘基。然而在一些實(shí)施方式中，所述RNA不包含修飾的核堿基，并可不包含修飾的核苷酸，即RNA中所有核苷酸是標(biāo)準(zhǔn)的A、C、G和U核糖核苷酸（除了任何5'帽結(jié)構(gòu)，其可包含7'-甲基鳥苷）。在其他實(shí)施方式中，所述RNA可包括含7-甲基鳥苷的5'帽，且第1、2或3個(gè)5'核糖核苷酸可在核糖的2'位被甲基化。本發(fā)明所用的RNA理想上僅包括核苷之間的磷酸二酯鍵，但在一些實(shí)施方式中其可含氨基磷酸酯鍵、硫代磷酸酯鍵和/或甲基磷酸酯鍵。理想地，脂質(zhì)體包含少于10種不同種類的RNA，例如5種、4種、3種或2種不同種類，最優(yōu)選脂質(zhì)體包含單一的RNA種類，即所述脂質(zhì)體中所有RNA分子具有相同的序列和相同的長(zhǎng)度。每個(gè)脂質(zhì)體中的RNA量可以變化。每個(gè)脂質(zhì)體中單個(gè)的自復(fù)制RNA分子數(shù)目通常是<50，例如每個(gè)脂質(zhì)體中<20、<10、<5或1-4。編碼的感興趣多肽本發(fā)明所用的RNA分子編碼感興趣多肽。給予所述脂質(zhì)體后，所述RNA發(fā)生體內(nèi)翻譯并且產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可發(fā)揮它的所需作用，例如，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可引起受體中的免疫應(yīng)答，或可提供感興趣的功能作用，例如酶活性。所述RNA分子可編碼感興趣的單一多肽或多個(gè)多肽。多個(gè)多肽可以以單一多肽（融合多肽）或單獨(dú)的多肽存在。如果多肽由復(fù)制子以單獨(dú)多肽表達(dá)，那么這些多肽中的一種或多種可與上游IRES或額外的病毒啟動(dòng)子元件一起提供。替代地，多個(gè)多肽可由多聚蛋白或以內(nèi)含肽表達(dá)，該多聚蛋白編碼與小自催化蛋白酶融合的單一多肽（例如口蹄疫病毒2A蛋白）。不同于參考文獻(xiàn)1和12，所述RNA編碼帶有有效體內(nèi)功能的多肽。為避免疑問，本發(fā)明不包括編碼螢火蟲熒光素酶或編碼大腸桿菌(E.coli)β-半乳糖苷酶的融合蛋白或編碼綠色熒光蛋白(GFP)的RNA。將該多肽作為標(biāo)記可能很有用處，但本發(fā)明涉及體內(nèi)表達(dá)多肽的RNA遞送，該多肽可提供有用的治療或免疫應(yīng)答。并且，所述RNA不是全小鼠胸腺RNA。免疫原在一些實(shí)施方式中，所述RNA編碼多肽免疫原。給予所述脂質(zhì)體后，所述RNA發(fā)生體內(nèi)翻譯并且所述免疫原可引起受體的免疫應(yīng)答。所述免疫原可引起針對(duì)細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲（或者在一些實(shí)施方式中針對(duì)變應(yīng)原，以及在其它實(shí)施方式中針對(duì)腫瘤抗原）的免疫應(yīng)答。所述免疫應(yīng)答可包括抗體應(yīng)答（通常包括IgG）和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。該多肽免疫原通常會(huì)引起識(shí)別相應(yīng)的細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲（或變應(yīng)原或腫瘤）多肽的免疫應(yīng)答，但在一些實(shí)施方式中，所述多肽可作為模擬表位來引起識(shí)別細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲單糖的免疫應(yīng)答。所述免疫原通常是表面多肽，例如粘附素、血凝素、包膜糖蛋白、突起糖蛋白等。在一些實(shí)施方式中，所述免疫原引起針對(duì)以下這些細(xì)菌之一的免疫應(yīng)答：腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)：有用的免疫原包括但不限于膜蛋白，例如粘附素、自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、毒素、鐵攝取蛋白和H因子結(jié)合蛋白。三種有用多肽的組合公開在參考文獻(xiàn)13中。肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)：有用的多肽免疫原公開在參考文獻(xiàn)14中。其包括但不限于RrgB菌毛亞基、β-N-乙酰-己糖胺酶前體(spr0057)、spr0096、普通應(yīng)激蛋白GSP-781(spr2021、SP2216)、絲氨酸/蘇氨酸激酶StkP(SP1732)和肺炎球菌表面粘附素PsaA。釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)：有用的免疫原包括但不限于公開在參考文獻(xiàn)15和16中的多肽。卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)。百日咳博德特菌(Bordetellapertussis)：有用的百日咳免疫原包括但不限于：百日咳毒素或類毒素(PT)、絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)、百日咳菌粘附素和凝集原2和3。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)：有用的免疫原包括但不限于公開在參考文獻(xiàn)17中的多肽，例如溶血素、esxA、esxB、鐵色素結(jié)合蛋白(sta006)和/或sta011脂蛋白。破傷風(fēng)梭菌(Clostridiumtetani)：典型的免疫原是破傷風(fēng)類毒素。白喉棒狀桿菌(Cornynebacteriumdiphtheriae)：典型的免疫原是白喉類毒素。流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)：有用的免疫原包括但不限于公開在參考文獻(xiàn)18和19中的多肽。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)：有用的免疫原包括但不限于公開在參考文獻(xiàn)15中的多肽。沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)：有用的免疫原包括但不限于：PepA、LcrE、ArtJ、DnaK、CT398、OmpH-樣、L7/L12、OmcA、AtoS、CT547、Eno、HtrA和MurG（例如參考文獻(xiàn)20中所公開的）。LcrE[21]和HtrA[22]是兩種優(yōu)選的免疫原。肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae)：有用的免疫原包括但不限于公開在參考文獻(xiàn)23中的多肽。幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)：有用的免疫原包括但不限于：CagA、VacA、NAP和/或脲酶[24]。大腸桿菌(Escherichiacoli)：有用的免疫原包括但不限于衍生自以下大腸桿菌的免疫原：腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)、腸聚集性大腸桿菌(EAggEC)、彌散粘附性大腸桿菌(DAEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸外致病性大腸桿菌(ExPEC)和/或腸出血性大腸桿菌(EHEC)。ExPEC菌株包括尿致病性大腸桿菌(UPEC)和腦膜炎/敗血癥相關(guān)的大腸桿菌(MNEC)。有用的UPEC多肽免疫原公開在參考文獻(xiàn)25和26中。有用的MNEC免疫原公開在參考文獻(xiàn)27中。AcfD是幾種大腸桿菌類型的有用免疫原[28]。炭疽桿菌(Bacillusanthracis)鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis)：有用的免疫原包括但不限于參考文獻(xiàn)29和30中所公開的。表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermis)產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)或肉毒梭菌(Clostridiumbotulinums)嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)伯內(nèi)特科克斯立克次體(Coxiellaburnetti)布魯氏菌(Brucella)，如牛布魯氏菌(B.abortus)、犬布魯氏菌(B.canis)、羊布魯氏菌(B.melitensis)、沙林鼠布魯氏菌(B.neotomae)、綿羊附睪布魯氏菌(B.ovis)、豬布魯氏菌(B.suis)、有鰭動(dòng)物布魯氏菌(B.pinnipediae)。弗朗西斯氏菌(Francisella)，如新兇手弗朗西斯氏菌(F.novicida)、蜃樓弗朗西斯氏菌(F.philomiragia)、土拉熱弗朗西斯氏菌(F.tularensi)。淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)蒼白密螺旋體(Treponemapallidum)杜氏嗜血桿菌(Haemophilusducreyi)糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)或屎腸球菌(Enterococcusfaecium)腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitic)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)立克次體(Rickettsia)單核細(xì)胞增生利斯特菌(Listeriamonocytogenes)霍亂弧菌(Vibriocholerae)傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)克雷伯菌(Klebsiella)在一些實(shí)施方式中，所述免疫原引起針對(duì)以下病毒之一的免疫應(yīng)答：正粘病毒(Orthomyxovirus)：有用的免疫原可來自甲型、乙型或丙型流感病毒，如血凝素、神經(jīng)氨酸酶或基質(zhì)M2蛋白。免疫原為甲型流感病毒血凝素時(shí)，其可來自任何亞型，例如來自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒：病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的免疫原：肺炎病毒(Pneumovirus)(例如，呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus)，RSV)、腮腺炎病毒(Rubulaviruses)(例如，流行性腮腺炎病毒(mumpsvirus))、副粘液病毒(Paramyxoviruses)(例如，副流感病毒(parainfluenzavirus))、偏肺病毒(Metapneumoviruses)和麻疹病毒(Morbilliviruses)(例如，麻疹病毒(measlesvirus))。痘病毒(Poxviridae)：病毒免疫原包括但不限于衍生自正痘病毒(Orthopoxvirus)的免疫原，如天花(Variolavera)，包括但不限于重型天花(Variolamajor)和輕型天花(Variolaminor)。小核糖核酸病毒(Picornavirus)：病毒免疫原包括但不限于衍生自小核糖核酸病毒的免疫原，如腸道病毒(Enterovirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、嗜肝RNA病毒(Heparnavirus)、心臟病毒(Cardiovirus)和口蹄疫病毒(Aphthovirus)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述腸道病毒是脊髓灰質(zhì)炎病毒，如1型、2型和/或3型脊髓灰質(zhì)炎病毒。在另一實(shí)施方式中，所述腸道病毒是EV71腸道病毒。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述腸道病毒是甲型或乙型柯薩奇病毒(coxsackievirus)。布尼亞病毒(Bunyavirus)：病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的免疫原：正布尼亞病毒(Orthobunyavirus)如加利福尼亞腦炎病毒(Californiaencephalitisvirus)，白蛉病毒(Phlebovirus)如裂谷熱病毒(RiftValleyFevervirus)，或內(nèi)羅病毒(Nairovirus)如克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congohemorrhagicfevervirus)。嗜肝RNA病毒(Heparnavirus)：病毒免疫原包括但不限于衍生自嗜肝RNA病毒如甲型肝炎病毒(HAV)的免疫原。纖絲病毒(Filovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自纖絲病毒的免疫原，如埃博拉病毒(Ebolavirus)（包括扎伊爾(Zaire)、象牙海岸(IvoryCoast)、萊斯頓(Reston)或蘇丹(Sudan)纖絲病毒）或馬爾堡(Marburg)病毒。披膜病毒(Togavirus)：病毒免疫原包括但不限于衍生自披膜病毒的免疫原，如風(fēng)疹病毒(Rubivirus)、α病毒(Alphavirus)或動(dòng)脈炎病毒(Arterivirus)。包括風(fēng)疹病毒。黃病毒(Flavivirus)：病毒免疫原包括但不限于衍生自黃病毒(Flavivirus)的免疫原，如蜱傳腦炎(TBE)病毒、登革熱(1、2、3或4型)病毒、黃熱病毒(YellowFevervirus)、日本腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus)、開薩諾森林病毒(KyasanurForestVirus)、西尼羅河腦炎病毒(WestNileencephalitisvirus)、圣路易斯腦炎病毒(St.Louisencephalitisvirus)、俄國(guó)春夏腦炎病毒(Russianspring-summerencephalitisvirus)、波瓦生腦炎病毒(Powassanencephalitisvirus)。.瘟病毒(Pestivirus)：病毒免疫原包括但不限于衍生自瘟病毒的免疫原，如牛病毒性腹瀉(BVDV)、典型豬瘟(CSFV)或邊界病(BDV)。嗜肝DNA病毒(Hepadnavirus)：病毒免疫原包括但不限于衍生自嗜肝DNA病毒如乙型肝炎病毒的免疫原。組合物可包含乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。其他肝炎病毒：組合物可包含來自丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒或庚型肝炎病毒的免疫原。桿狀病毒(Rhabdovirus)：病毒免疫原包括但不限于衍生自桿狀病毒的免疫原，如恐水病病毒(Lyssavirus)(如狂犬病病毒(Rabiesvirus))和水泡病毒(VSV)。杯狀病毒(Caliciviridae)：病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的免疫原：杯狀病毒，如諾沃克病毒(Norwalkvirus)(諾如病毒(Norovirus))和類諾沃克病毒(Norwalk-likeviruses)，如夏威夷病毒(HawaiiVirus)和雪山病毒(SnowMountainVirus)。冠狀病毒(Coronavirus)：病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的免疫原：SARS冠狀病毒、禽傳染性支氣管炎(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和豬傳染性腸胃炎病毒(TGEV)。所述冠狀病毒免疫原可為突起多肽。逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)：病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的免疫原：腫瘤病毒(Oncovirus)、慢病毒(Lentivirus)(例如HIV-1或HIV-2)或泡沫病毒(Spumavirus)。呼腸病毒(Reovirus)：病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的免疫原：正呼腸病毒(Orthoreovirus)、輪狀病毒(Rotavirus)、環(huán)狀病毒(Orbivirus)或科羅拉多蜱傳熱病毒(Coltivirus)。細(xì)小病毒(Parvovirus)：病毒免疫原包括但不限于衍生自細(xì)小病毒B19的免疫原。皰疹病毒(Herpesvirus)：病毒免疫原包括但不限于衍生自人皰疹病毒的免疫原，如僅為示例的單純皰疹病毒(HSV)(例如1和2型HSV)、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、人皰疹病毒6(HHV6)、人皰疹病毒7(HHV7)和人皰疹病毒8(HHV8)。乳頭多瘤空泡病毒(Papovaviruses)：病毒免疫原包括但不限于衍生自乳頭瘤病毒(Papillomavirus)和多瘤病毒(Polyomavirus)的免疫原。(人)乳頭瘤病毒可以是血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63或65，例如來自血清型6、11、16和/或18的一種或多種。腺病毒(Adenovirus)：病毒免疫原包括但不限于衍生自腺病毒血清型36(Ad-36)的免疫原。在一些實(shí)施方式中，所述免疫原引起針對(duì)感染魚的病毒的免疫應(yīng)答，如：傳染性鮭魚貧血病毒(ISAV)、鮭魚胰腺疾病病毒(SPDV)、傳染性胰腺壞死病毒(IPNV)、斑點(diǎn)鯰魚病毒(CCV)、與魚淋巴囊腫病病毒(FLDV)、傳染性造血組織壞死病病毒(IHNV)、錦鯉皰疹病毒、鮭魚類小核糖核酸病毒(又稱為大西洋鮭魚類小核糖核酸病毒)、陸封鮭魚病毒(LSV)、大西洋鮭魚輪狀病毒(ASR)、鱒魚草莓病病毒(TSD)、銀鮭魚腫瘤病毒(CSTV)、或病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)。真菌免疫原可衍生自皮膚真菌，包括：絮狀表皮霉菌(Epidermophytonfloccusum)，頭癬小孢子菌(Microsporumaudouini)，犬小孢子菌(Microsporumcanis)，扭曲小孢子菌(Microsporumdistortum)，馬小孢子菌(Microsporumequinum)，石膏樣小孢子菌(Microsporumgypsum)，矮小小孢子菌(Microsporumnanum)，同心性毛癬菌(Trichophytonconcentricum)，馬毛癬菌(Trichophytonequinum)，雞毛癬菌(Trichophytongallinae)，石膏樣毛癬菌(Trichophytongypseum)，麥格氏毛癬菌(Trichophytonmegnini)，須毛癬菌(Trichophytonmentagrophytes)，昆克努毛癬菌(Trichophytonquinckeanum)，紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)，許蘭毛癬菌(Trichophytonschoenleini)，斷發(fā)毛癬菌(Trichophytontonsurans)，疣狀毛癬菌(Trichophytonverrucosum)，疣狀毛癬菌白色變種(T.verrucosumvar.album)、盤狀變種(var.discoides)、赭黃變種(var.ochraceum)，紫色毛癬菌(Trichophytonviolaceum)和/或蜜塊狀毛癬菌(Trichophytonfaviforme);或來自煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、黃曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、土曲霉(Aspergillusterreus)、聚多曲霉(Aspergillussydowi)、黃曲菌(Aspergillusflavatus)、灰綠曲霉(Aspergillusglaucus)、頭狀芽裂殖菌(Blastoschizomycescapitatus)、白假絲酵母(Candidaalbicans)、烯醇酶假絲酵母(Candidaenolase)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)、光滑假絲酵母(Candidaglabrata)、克柔假絲酵母(Candidakrusei)、近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)、類星形假絲酵母(Candidastellatoidea)、克魯斯假絲酵母(Candidakusei)、帕拉克斯假絲酵母(Candidaparakwsei)、葡萄牙假絲酵母(Candidalusitaniae)、偽熱帶假絲酵母(Candidapseudotropicalis)、季也蒙假絲酵母(Candidaguilliermondi)、卡氏枝孢霉(Cladosporiumcarrionii)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatidis)、新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)、棒地霉(Geotrichumclavatum)、莢膜組織胞漿菌(Histoplasmacapsulatum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、微孢子蟲(Microsporidia)、腦炎微孢子蟲屬(Encephalitozoonspp)、腸間隔微孢子蟲(Septataintestinalis)和畢氏腸微孢子蟲(Enterocytozoonbieneusi)；較不常見的是短粒蟲屬(Brachiolaspp.)、微孢子蟲屬(Microsporidiumspp.)、小孢子蟲屬(Nosemaspp.)、匹里蟲屬(Pleistophoraspp)、氣管普孢蟲屬(Trachipleistophoraspp.)、條孢蟲屬(Vittaformaspp.)、巴西芽生菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、卡氏肺孢子蟲(Pneumocystiscarinii)、苜蓿腐酶(Pythiumninsidiosum)、皮屑芽胞菌(Pityrosporumovale)、釀酒酵母(Sacharomycescerevisae)、布拉酵母(Saccharomycesboulardii)、粟酒酵母(Saccharomycespombe)、尖端賽多孢子菌(Scedosporiumapiosperum)、申克孢子絲菌(Sporothrixschenckii)、白吉利絲孢酵母(Trichosporonbeigelii)、弓形蟲(Toxoplasmagondii)、馬爾尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)、馬拉色菌屬(Malasseziaspp.)、著色真菌屬(Fonsecaeaspp.)、王氏霉菌屬(Wangiellaspp.)、孢子絲菌屬(Sporothrixspp.)、蛙糞霉屬(Basidiobolusspp.)、耳霉屬(Conidiobolusspp.)、根霉屬(Rhizopusspp.)、毛霉屬(Mucorspp.)、犁頭霉屬(Absidiaspp.)、被孢霉屬(Mortierellaspp.)、小克銀漢霉屬(Cunninghamellaspp.)、瓶霉屬(Saksenaeaspp.)、鏈格孢菌屬(Alternariaspp.)、彎孢菌屬(Curvulariaspp.)、長(zhǎng)蠕孢菌屬(Helminthosporiumspp.)、鐮胞菌屬(Fusariumspp.)、曲霉屬(Aspergillusspp.)、青霉屬(Penicilliumspp.)、鏈核盤菌屬(Monoliniaspp.)、絲核菌屬(Rhizoctoniaspp.)、擬青霉屬(Paecilomycesspp.)、皮司霉屬(Pithomycesspp.)和枝孢屬(Cladosporiumspp.)。在一些實(shí)施方式中，所述免疫原引起針對(duì)來自瘧原蟲(Plasmodium)屬的寄生蟲的免疫應(yīng)答，如惡性瘧原蟲(P.falciparum)、間日瘧原蟲(P.vivax)、三日瘧原蟲(P.malariae)或卵圓瘧原蟲(P.ovale)。因此本發(fā)明可用于針對(duì)瘧疾的免疫。在一些實(shí)施方式中，所述免疫原引起針對(duì)來自魚虱科(Caligidae)家族的寄生蟲的免疫應(yīng)答，特別是來自瘡痂魚虱屬(Lepeophtheirus)和魚虱屬(Caligus)的寄生蟲，如海虱,例如鮭瘡痂魚虱(Lepeophtheirussalmonis)或智利魚虱(Caligusrogercresseyi)。在一些實(shí)施方式中，所述免疫原引起針對(duì)以下物質(zhì)的免疫應(yīng)答：花粉變應(yīng)原(樹、草本、雜草和草花粉變應(yīng)原)、昆蟲或蛛形綱動(dòng)物變應(yīng)原(吸入劑、唾液和毒液變應(yīng)原，如螨蟲變應(yīng)原、蟑螂和蠓變應(yīng)原、膜翅目昆蟲毒液變應(yīng)原)、動(dòng)物毛發(fā)和頭皮屑變應(yīng)原(來自例如狗、貓、馬、大鼠、小鼠等)和食物變應(yīng)原(如麩朊)。來自樹、草和草本的重要花粉變應(yīng)原源自殼斗目,木犀目,松杉目和懸鈴木目的分類目，包括但不限于：白樺(樺屬)，赤楊(榿木)，榛子(榛屬)，鵝耳櫪(鵝耳櫪屬)和橄欖(木犀欖屬)，柳杉(柳杉屬和圓柏屬)，懸鈴木(法國(guó)梧桐)，禾本目包括黑麥屬、貓尾屬、早熟禾屬、狗牙根屬、鴨茅屬、絨毛草屬、子虉草屬、黑麥屬和高粱屬的草，菊目和蕁麻目包括豚草屬、蒿屬和歐蓍草屬的草本植物。其它重要的吸入變應(yīng)原來自塵螨屬和霉螨屬的屋塵螨、倉(cāng)儲(chǔ)螨如害嗜鱗螨屬、食甜螨屬和食酪螨屬，來自蟑螂、蠓和跳蚤，如小蠊屬、大蠊屬、搖蚊屬和貓櫛頭蚤屬，以及來自哺乳動(dòng)物如貓、狗和馬，毒液變應(yīng)原包括源自針昆蟲或咬蟲的變應(yīng)原如源自膜翅目分類目的變應(yīng)原，包括蜜蜂(蜜蜂科(Apidae))、黃蜂(胡蜂科(Vespidea))和螞蟻(蟻總科(Formicoidae))。在一些實(shí)施方式中，所述免疫原是選自以下的腫瘤抗原：(a)睪丸癌抗原，如NY-ESO-1、SSX2、SCP1以及RAGE、BAGE、GAGE和MAGE家族多肽，如GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12(其可用于，例如，處理黑色素瘤、肺腫瘤、頭頸腫瘤、NSCLC瘤、乳腺腫瘤、胃腸道腫瘤和膀胱腫瘤)，(b)突變抗原，例如p53(與多種實(shí)體瘤如結(jié)直腸癌、肺癌、頭頸癌有關(guān))、p21/Ras(例如，與黑色素瘤、胰腺癌和結(jié)直腸癌有關(guān))、CDK4(例如，與黑色素瘤有關(guān))、MUM1(例如，與黑色素瘤有關(guān))、半胱天冬酶-8(例如，與頭頸癌有關(guān))、CIA0205(例如，與膀胱癌有關(guān))、HLA-A2-R1701、β連環(huán)蛋白(例如，與黑色素瘤有關(guān))、TCR(例如，與T-細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤有關(guān))、BCR-abl(例如，與慢性髓細(xì)胞性白血病有關(guān))、磷酸丙糖異構(gòu)酶、KIA0205、CDC-27和LDLR-FUT，(c)過量表達(dá)的抗原，例如半乳糖凝集素4(例如，與結(jié)直腸癌有關(guān))、半乳糖凝集素9(例如，與霍奇金病有關(guān))、蛋白酶3(例如，與慢性髓細(xì)胞性白血病有關(guān))、WT1(例如，與多種白血病有關(guān))、碳酸酐酶(例如，與腎癌有關(guān))、醛縮酶A(例如，與肺癌有關(guān))、PRAME(例如，與黑色素瘤有關(guān))、HER-2/neu(例如，與乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌與卵巢癌有關(guān))、乳腺珠蛋白、甲胎蛋白(例如，與肝細(xì)胞癌有關(guān))、KSA(例如，與結(jié)直腸癌有關(guān))、胃泌素(例如，與胰腺癌和胃癌有關(guān))、端粒酶催化蛋白、MUC-1(例如，與乳腺癌和卵巢癌有關(guān))、G-250(例如，與腎細(xì)胞癌有關(guān))、p53(例如，與乳腺癌和結(jié)腸癌有關(guān))和癌胚抗原(例如，與乳腺癌、肺癌和胃腸道癌如結(jié)直腸癌有關(guān))，(d)共有抗原，例如黑色素瘤-黑素細(xì)胞分化抗原，如MART-1/MelanA、gp100、MC1R、黑素細(xì)胞-刺激激素受體、酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1/TRP1和酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2/TRP2(例如，與黑色素瘤有關(guān))，(e)前列腺相關(guān)抗原如PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2，例如與前列腺癌有關(guān)，(f)免疫球蛋白個(gè)體基因型(例如，與骨髓瘤和B細(xì)胞淋巴瘤有關(guān))。在某些實(shí)施方式中，腫瘤免疫原包括但不限于：p15、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳頭瘤病毒(HPV)抗原，包括E6和E7、乙肝和丙肝病毒抗原、人T細(xì)胞嗜淋巴細(xì)胞病毒抗原、TSP-180、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、TAG-72-4、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、p16、TAGE、PSCA、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3(CA27.29\BCAA)、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2結(jié)合蛋白\親環(huán)蛋白C相關(guān)蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS等等。基因治療在一些實(shí)施方式中，所述RNA編碼在基因治療方面有用的多肽。除了編碼用于RNA自復(fù)制能力的任何多肽，還提供所編碼的該蛋白。因此所述RNA可以編碼酶(例如不與RNA結(jié)合的酶)、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)膜受體、離子通道、激素、血蛋白或抗體。所述RNA優(yōu)選編碼這些種類中的人多肽。感興趣的酶包括但不限于：DNA聚合酶α、DNA聚合酶δ。感興趣的細(xì)胞因子包括但不限于：白介素1、白介素2、白介素4、白介素6、白介素7、白介素12、白介素17、GM-CSF、G-CSF、TNF-α、干擾素α、干擾素β、干擾素γ和分泌神經(jīng)素。感興趣的受體包括但不限于：瘦素受體、低密度脂蛋白受體、2型骨形態(tài)蛋白受體、TNF受體、促性腺素釋放激素受體、多巴胺受體、促生長(zhǎng)素抑制素受體、維生素D受體、尿激酶纖溶酶原激活劑受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體等。感興趣的離子通道包括但不限于：HCN2、HCN4、CFTR、Maxi-K通道的α-亞基、KCNQ2、KCNQ3和Kv1.5。感興趣的激素包括但不限于：絨毛膜促性腺素、促皮質(zhì)素、紅細(xì)胞生成素、胰高血糖素、IGF-1、催產(chǎn)素、血小板衍生的生長(zhǎng)因子、降鈣素、促卵泡激素、促黃體激素、促甲狀腺激素、胰島素、促性腺激素釋放激素、加壓素、促生長(zhǎng)素抑制素、促乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素、抗利尿激素、促甲狀腺素釋放激素、奧曲肽、人生長(zhǎng)激素、松弛素、生長(zhǎng)激素釋放激素、甲狀旁腺激素、鈣化固醇、心房鈉尿肽、促胃液素、促胰液素、膽囊收縮素、瘦體、神經(jīng)肽Y、生長(zhǎng)素釋放肽、血管緊張素原、多巴胺和血小板生成素。當(dāng)激素需要多個(gè)多肽亞基表現(xiàn)活性時(shí)，所述RNA可編碼一個(gè)或多個(gè)該亞基，例如所述RNA可編碼促卵泡激素的α亞基和/或β亞基。感興趣的血蛋白包括但不限于：血紅蛋白、纖維蛋白原、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、纖維蛋白原、凝血酶、血管性血友病因子。藥物組合物本發(fā)明的脂質(zhì)體可用作藥物組合物中的組分使患者對(duì)多種疾病有免疫。除了脂質(zhì)體，這些組合物通常包含藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體的全面討論可參見參考文獻(xiàn)31。本發(fā)明的藥物組合物可包含一種或多種小分子免疫增強(qiáng)劑。例如，所述組合物可包含TLR2激動(dòng)劑（例如Pam3CSK4）、TLR4激動(dòng)劑（例如氨烷基氨基葡糖苷磷酸，如E6020）、TLR7激動(dòng)劑（例如咪喹莫特）、TLR8激動(dòng)劑（例如雷西莫特）和/或TLR9激動(dòng)劑（例如IC31）。任何該激動(dòng)劑理想上分子量<2000Da。在一些實(shí)施方式中，該激動(dòng)劑還與所述RNA包埋在脂質(zhì)體中，但在其它實(shí)施方式中其未包埋。本發(fā)明的藥物組合物可包含淡水（例如w.f.i.）或緩沖劑（磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、硼酸鹽緩沖液、琥珀酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液）中的脂質(zhì)體。通常包含濃度在5-20mM范圍內(nèi)的緩沖鹽在。本發(fā)明的藥物組合物pH值通?？梢栽?.0至9.5之間，例如6.0至8.0之間。本發(fā)明的組合物可含有鈉鹽(如氯化鈉)以產(chǎn)生張力。NaCl濃度通常為10±2mg/ml，例如約9mg/ml。本發(fā)明的組合物可包含金屬離子螯合劑。其可通過去除能促進(jìn)磷酸二酯鍵水解的離子來延長(zhǎng)RNA的穩(wěn)定性。因此組合物可包含EDTA、EGTA、BAPTA、三胺五乙酸等其中的一種或多種。該螯合劑通常以10-500μM（例如0.1mM）存在。檸檬酸鹽如檸檬酸鈉也可作為螯合劑，同時(shí)也有助于提供緩沖活性。本發(fā)明的藥物組合物可具有200mOsm/kg至400mOsm/kg的滲透壓，例如240至360mOsm/kg或290至310mOsm/kg。本發(fā)明的藥物組合物可包含一種或多種防腐劑，例如硫柳汞或2-苯氧乙醇。優(yōu)選不含汞的組合物，并且可制備不含防腐劑的疫苗。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選無菌組合物。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選無熱原組合物，如每劑量含有<1EU(內(nèi)毒素單位，標(biāo)準(zhǔn)量度)，且優(yōu)選每劑量<0.1EU。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選不含谷蛋白。本發(fā)明的藥物組合物可以單位劑型制備。在一些實(shí)施方式中，單位劑量的體積可為0.1至1.0ml，例如約0.5ml。所述組合物可以制備成溶液或懸浮液形式的注射劑。所述組合物可以制備成采用噴霧的肺部給藥，例如通過吸入器。所述組合物可以制備成用于鼻部、耳部或眼部給藥，例如作為噴霧劑或滴劑。通常為用于肌內(nèi)給藥的注射劑。組合物包含免疫有效量的脂質(zhì)體，以及按需的任何其它組分?！懊庖哂行Я俊敝敢砸淮蝿┝炕蛞幌盗袆┝康囊徊糠纸o予個(gè)體的對(duì)治療或預(yù)防有效的量。該量的變化取決于所治療個(gè)體的健康和身體狀況、年齡、所治療個(gè)體的分類組（例如，非人的靈長(zhǎng)動(dòng)物、靈長(zhǎng)動(dòng)物等）、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護(hù)程度、疫苗配方、治療醫(yī)生對(duì)醫(yī)學(xué)情況的評(píng)估和其它相關(guān)因素。預(yù)計(jì)所述量將落入可通過常規(guī)試驗(yàn)測(cè)定的相對(duì)較寬范圍內(nèi)。本發(fā)明的組合物的脂質(zhì)體和RNA含量通常按每劑量的RNA量表示。優(yōu)選劑量含<100μgRNA（例如10至100μg，例如約10μg、25μg、50μg、75μg或100μg），但可見到相當(dāng)?shù)退降谋硎荆?lt;1μg/劑、<100ng/劑、<10ng/劑、<1ng/劑等。本發(fā)明還提供含有本發(fā)明藥物組合物的遞送裝置（例如注射器、霧化器、噴霧器、吸入器、皮膚貼片等）。該裝置可用于向脊椎動(dòng)物患者給予所述組合物。本發(fā)明的脂質(zhì)體不含核糖體。治療方法和醫(yī)學(xué)應(yīng)用相比參考文獻(xiàn)12公開的顆粒，本發(fā)明的脂質(zhì)體和藥物組合物用于體內(nèi)引起針對(duì)感興趣的免疫原的免疫應(yīng)答或基因治療。本發(fā)明還提供了引起脊椎動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，包括給予有效量的本發(fā)明脂質(zhì)體或藥物組合物的步驟。所述免疫應(yīng)答優(yōu)選為保護(hù)性的，并優(yōu)選涉及抗體和/或細(xì)胞介導(dǎo)免疫。所述方法可以引起加強(qiáng)應(yīng)答。本發(fā)明還提供本發(fā)明脂質(zhì)體或藥物組合物在脊椎動(dòng)物中引起免疫應(yīng)答的方法的應(yīng)用。本發(fā)明還提供本發(fā)明脂質(zhì)體或藥物組合物在脊椎動(dòng)物中基因治療方法的應(yīng)用。本發(fā)明還提供本發(fā)明脂質(zhì)體在制備在脊椎動(dòng)物中引起免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。通過這些應(yīng)用和方法在脊椎動(dòng)物中引起免疫應(yīng)答，所述脊椎動(dòng)物可受到抵御多種疾病和/或感染的保護(hù)，例如抵御上文所討論的細(xì)菌和/或病毒疾病。所述脂質(zhì)體和組合物有免疫原性，且更優(yōu)選疫苗組合物。本發(fā)明的疫苗可以是預(yù)防性(即預(yù)防感染)或治療性(即治療感染)疫苗，但通常是預(yù)防性疫苗。所述脊椎動(dòng)物優(yōu)選哺乳動(dòng)物、例如人或大型獸類哺乳動(dòng)物（例如馬、牛、鹿、羊、豬）。當(dāng)所述疫苗用于預(yù)防用途時(shí)，人優(yōu)選兒童(如幼童或嬰兒)或青少年；當(dāng)疫苗用于治療用途時(shí)，人優(yōu)選青少年或成人。準(zhǔn)備給予兒童的疫苗也可給予成年人，例如，為評(píng)估其安全性、劑量、免疫原性等。根據(jù)本發(fā)明制備的疫苗可用于治療兒童和成年人。因此，人患者可以小于1歲、小于5歲、1-5歲、5-15歲、15-55歲或至少55歲。接受疫苗的患者優(yōu)選老年人(如>50歲、>60歲并優(yōu)選>65歲)，幼兒(如<5歲)，住院病人、醫(yī)護(hù)人員、武裝人員和軍人、孕婦、慢性病人或免疫缺陷病人。不過所述疫苗不僅適用于這些人群，還可用于更廣泛的群體。本發(fā)明的組合物通常直接給予患者。直接遞送可通過胃腸道外注射（例如皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)或向組織間隙遞送；不同于參考文獻(xiàn)，本發(fā)明通常不使用舌內(nèi)注射）完成。替代的遞送途徑包括直腸、口服（例如片劑、噴霧）、口頰、舌下、陰道、局部、透皮或經(jīng)皮、鼻內(nèi)、眼部、耳部、肺部或其它粘膜給予。皮內(nèi)和肌內(nèi)給予是兩種優(yōu)選的途徑。注射可以通過針頭（例如皮下針頭）進(jìn)行，但也可以替代地采用無針注射。肌內(nèi)劑量通常為0.5ml。本發(fā)明可用于引起全身和/或粘膜免疫，優(yōu)選引起增強(qiáng)的全身和/或粘膜免疫?？梢酝ㄟ^單劑量方案或多劑量方案進(jìn)行給藥。多劑量可以用于初次免疫方案和/或加強(qiáng)免疫方案。在多劑量方案中，可通過相同或不同的途徑如外腸道起始和粘膜加強(qiáng)，粘膜起始和外腸道加強(qiáng)等給予不同劑量。多劑量的給予一般間隔至少1周（例如約2周、約3周、約4周、約6周、約8周、約10周、約12周、約16周等）。在一個(gè)實(shí)施方式中，多劑量的給予可在出生后約6周、10周和14周，例如在6周齡、10周齡和14周齡時(shí)，如世界衛(wèi)生組織的擴(kuò)大免疫規(guī)劃（“EPI”）中常使用的頻率。在替代實(shí)施方式中，間隔約兩個(gè)月給予兩個(gè)初次免疫劑量，例如間隔約7、8或9周，在給予第二個(gè)初次免疫劑量約6個(gè)月至1年后，例如給予第二個(gè)初次免疫劑量約6、8、10或12個(gè)月后，給予一個(gè)或多個(gè)加強(qiáng)免疫劑量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，間隔約兩個(gè)月給予三個(gè)初次免疫劑量，例如間隔約7、8或9周，在給予第三個(gè)初次免疫劑量約6個(gè)月至1年后，例如給予第三個(gè)初次免疫劑量約6、8、10或12個(gè)月后，給予一個(gè)或多個(gè)加強(qiáng)免疫劑量?；瘜W(xué)術(shù)語和定義鹵素術(shù)語“鹵素”(或“鹵”)包括氟、氯、溴和碘。烷基、亞烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基等本文所用的術(shù)語“烷基”、“亞烷基”、“烯基”和“炔基”是指直鏈和支鏈的非環(huán)形式。其環(huán)類似物指環(huán)烷基等。術(shù)語“烷基”包括單價(jià)的、直鏈或支鏈的、飽和的、非環(huán)狀的烴基基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，烷基是C1-10烷基，在另一個(gè)實(shí)施方式中是C1-6烷基，在另一個(gè)實(shí)施方式中是C1-4烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基或叔丁基基團(tuán)。術(shù)語“環(huán)烷基”包括單價(jià)的、飽和的、環(huán)狀的烴基基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，環(huán)烷基是C3-10環(huán)烷基，在另一個(gè)實(shí)施方式中是C3-6環(huán)烷基，例如環(huán)戊基和環(huán)己基。術(shù)語“烷氧基”是指烷基-O-。術(shù)語“烯基”包括單價(jià)、直鏈或支鏈、不飽和的、非環(huán)狀的烴基基團(tuán)，其具有至少一個(gè)碳碳雙鍵，在一個(gè)實(shí)施方式中，沒有碳碳三鍵。在一個(gè)實(shí)施方式中，烯基是C2-10烯基，在另一個(gè)實(shí)施方式中是C2-6烯基，在另一個(gè)實(shí)施方式中是C2-4烯基。術(shù)語“環(huán)烯基”包括單價(jià)的、部分不飽和的、環(huán)狀的烴基基團(tuán)，其具有至少一個(gè)碳碳雙鍵，在一個(gè)實(shí)施方式中，沒有碳碳三鍵。在一個(gè)實(shí)施方式中，環(huán)烯基是C3-10環(huán)烯基，在另一個(gè)實(shí)施方式中是C5-10環(huán)烯基，例如環(huán)己基或苯并環(huán)己基。術(shù)語“炔基”包括單價(jià)的、直鏈或支鏈的、不飽和的、非環(huán)狀的烴基基團(tuán)，其具有至少一個(gè)碳碳三鍵，在一個(gè)實(shí)施方式中，沒有碳碳雙鍵。在一個(gè)實(shí)施方式中，炔基是C2-10炔基，在另一個(gè)實(shí)施方式中是C2-6炔基，在另一個(gè)實(shí)施方式中是C2-4炔基。術(shù)語“環(huán)炔基”包括單價(jià)的、部分不飽和的、環(huán)狀的烴基基團(tuán)，其具有至少一個(gè)碳碳三鍵，在一個(gè)實(shí)施方式中，沒有碳碳雙鍵。在一個(gè)實(shí)施方式中，環(huán)炔基是C3-10環(huán)烯基，在另一實(shí)施方式中是C5-10環(huán)炔基。術(shù)語“亞烷基”包括二價(jià)的、直鏈或支鏈的、飽和的、非環(huán)狀的烴基基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，亞烷基是C1-10亞烷基，在另一個(gè)實(shí)施方式中是C1-6亞烷基，在另一個(gè)實(shí)施方式中是C1-4亞烷基，例如亞甲基、乙烯、正丙烯、異丙烯或叔丁烯基團(tuán)。術(shù)語“亞烯基”包括二價(jià)的、直鏈或支鏈的、不飽和的、非環(huán)狀的烴基基團(tuán)，其具有至少一個(gè)碳碳雙鍵，在一個(gè)實(shí)施方式中，沒有碳碳三鍵。在一個(gè)實(shí)施方式中，亞烯基是C2-10亞烯基，在另一個(gè)實(shí)施方式中是C2-6亞烯基，在另一個(gè)實(shí)施方式中是C2-4亞烯基。術(shù)語“亞炔基”包括二價(jià)的、直鏈或支鏈的、不飽和的、非環(huán)狀的烴基基團(tuán)，其具有至少一個(gè)碳碳三鍵，在一個(gè)實(shí)施方式中，沒有碳碳雙鍵。在一個(gè)實(shí)施方式中，亞炔基是C2-10亞炔基，在另一個(gè)實(shí)施方式中是C2-6亞炔基，在另一個(gè)實(shí)施方式中是C2-4亞炔基。雜烷基等術(shù)語“雜烷基”包括烷基基團(tuán)，該基團(tuán)中多至6個(gè)碳原子，在一個(gè)實(shí)施方式中多至5個(gè)碳原子，在另一個(gè)實(shí)施方式中多至4個(gè)碳原子，在另一個(gè)實(shí)施方式中多至3個(gè)碳原子，在另一個(gè)實(shí)施方式中多至2個(gè)碳原子，在另一個(gè)實(shí)施方式中1個(gè)碳原子中的每個(gè)碳原子獨(dú)立地被O、S(O)q、N、P(O)r或Si（并優(yōu)選O、S(O)q或N）取代，前提是保留所述烷基碳原子中的至少一個(gè)。雜烷基基團(tuán)可以是C-連接或雜-連接，即其可與該分子的其余部分通過碳原子或通過O、S(O)q、N、P(O)r或Si連接。術(shù)語“雜環(huán)烷基”包括環(huán)烷基基團(tuán)，該基團(tuán)中多至6個(gè)碳原子，在一個(gè)實(shí)施方式中多至5個(gè)碳原子，在另一個(gè)實(shí)施方式中多至4個(gè)碳原子，在另一個(gè)實(shí)施方式中多至3個(gè)碳原子，在另一個(gè)實(shí)施方式中多至2個(gè)碳原子，在另一個(gè)實(shí)施方式中1個(gè)碳原子中的每個(gè)碳原子獨(dú)立地被O、S(O)q或N取代，前提是保留所述環(huán)烷基碳原子中的至少一個(gè)。雜環(huán)烷基基團(tuán)的示例包括：環(huán)氧乙烷基、環(huán)硫乙烷基、氮丙啶基、氧雜環(huán)丁烷基、硫雜環(huán)丁烷基、氮雜環(huán)丁烷基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、吡咯烷基、四氫吡喃基、四氫噻喃基、哌啶基、1,4-二烷基、1,4-氧硫雜環(huán)丁烷基、嗎啉基、1,4-二噻烷基、哌嗪基、1,4-氮噻烷基、氧雜環(huán)庚烷基、硫雜環(huán)庚烷基、氮雜環(huán)庚烷基、1,4-二氧雜環(huán)庚烷基、1,4-氧硫雜環(huán)庚烷基、1,4-氧氮雜環(huán)庚烷基、1,4-二硫雜環(huán)庚烷基、1,4-硫氮雜環(huán)庚烷基和1,4-二氮雜環(huán)庚烷基。所述雜環(huán)烷基基團(tuán)可為C-連接或N-連接，即其可與該分子的其余部分通過碳原子或通過氮原子連接。術(shù)語“雜烯基”包括烯基基團(tuán)，該基團(tuán)中多至3個(gè)碳原子，在一個(gè)實(shí)施方式中多至2個(gè)碳原子，在另一個(gè)實(shí)施方式中1個(gè)碳原子中的每個(gè)碳原子獨(dú)立地被O、S(O)q或N取代，前提是保留所述烯基碳原子中的至少一個(gè)。所述雜烯基基團(tuán)可以是C-連接或雜-連接，即其可與該分子的其余部分通過碳原子或通過O、S(O)q或N連接。術(shù)語“雜環(huán)烯基”包括環(huán)烯基基團(tuán)，該基團(tuán)中多至3個(gè)碳原子、在一個(gè)實(shí)施方式中多至2個(gè)碳原子、在另一個(gè)實(shí)施方式中1個(gè)碳原子中的每個(gè)碳原子獨(dú)立地被O、S(O)q或N取代，前提是保留所述環(huán)烯基碳原子中的至少一個(gè)。雜環(huán)烯基基團(tuán)的示例包括3,4-二氫-2H-吡喃基、5-6-二氫-2H-吡喃基、2H-吡喃基、1,2,3,4-四氫吡啶基和1,2,5,6-四氫吡啶基。所述雜環(huán)烯基基團(tuán)可為C-連接或N-連接，即其可與該分子的其余部分通過碳原子或通過氮原子連接。術(shù)語“雜炔基”包括炔基基團(tuán)，該基團(tuán)中多至3個(gè)碳原子、在一個(gè)實(shí)施方式中多至2個(gè)碳原子、在另一個(gè)實(shí)施方式中1個(gè)碳原子中的每個(gè)碳原子獨(dú)立地被O、S(O)q或N取代，前提是保留所述炔基碳原子中的至少一個(gè)。所述雜炔基基團(tuán)可以是C-連接或雜-連接，即其可與該分子的其余部分通過碳原子或通過O、S(O)q或N連接。術(shù)語“雜環(huán)炔基”包括環(huán)炔基基團(tuán)，該基團(tuán)中多至3個(gè)碳原子，在一個(gè)實(shí)施方式中多至2個(gè)碳原子，在另一個(gè)實(shí)施方式中1個(gè)碳原子中的每個(gè)碳原子獨(dú)立地被O、S(O)q或N取代，前提是保留所述環(huán)炔基碳原子中的至少一個(gè)。所述雜環(huán)烯基基團(tuán)可為C-連接或N-連接，即其可與該分子的其余部分通過碳原子或通過氮原子連接。術(shù)語“雜亞烷基”包括亞烷基基團(tuán)，該基團(tuán)中多至3個(gè)碳原子，在一個(gè)實(shí)施方式中多至2個(gè)碳原子，在另一個(gè)實(shí)施方式中1個(gè)碳原子中的每個(gè)碳原子獨(dú)立地被O、S(O)q或N取代，前提是保留所述亞烷基碳原子中的至少一個(gè)。術(shù)語“雜亞烯基”包括亞烯基基團(tuán)，該基團(tuán)中多至3個(gè)碳原子，在一個(gè)實(shí)施方式中多至2個(gè)碳原子，在另一個(gè)實(shí)施方式中1個(gè)碳原子中的每個(gè)碳原子獨(dú)立地被O、S(O)q或N取代，前提是保留所述亞烯基碳原子中的至少一個(gè)。術(shù)語雜“雜亞炔基”包括亞炔基基團(tuán)，該基團(tuán)中多至3個(gè)碳原子，在一個(gè)實(shí)施方式中多至2個(gè)碳原子，在另一個(gè)實(shí)施方式中1個(gè)碳原子中的每個(gè)碳原子獨(dú)立地被O、S(O)q或N取代，前提是保留所述亞炔基碳原子中的至少一個(gè)。芳基術(shù)語“芳基”包括單價(jià)的、芳族的、環(huán)狀烴基基團(tuán)，例如苯基或萘基（例如1-萘基或2-萘基）。通常，所述芳基基團(tuán)可以是單環(huán)或多環(huán)的稠環(huán)芳香族基團(tuán)。優(yōu)選的芳基是C6-C14芳基。芳基的其它示例是以下物質(zhì)的單價(jià)衍生物：醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、甘菊環(huán)、草屈、暈苯、螢蒽、芴、不對(duì)稱引達(dá)省、對(duì)稱引達(dá)省、茚、萘、卵苯、二萘嵌苯、非那烯、菲、苉、七曜烯、芘、吡蒽和玉紅省。術(shù)語“芳基烷基”指帶有芳基基團(tuán)取代基的烷基，例如芐基。術(shù)語“亞芳基”包括二價(jià)芳族的、環(huán)狀的烴基基團(tuán)，例如亞苯基。通常，所述亞芳基基團(tuán)可以是單環(huán)或多環(huán)的稠環(huán)芳香族基團(tuán)。優(yōu)選的亞芳基是C6-C14亞芳基。亞芳基基團(tuán)的其它示例是以下物質(zhì)的二價(jià)衍生物：醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、甘菊環(huán)、草屈、暈苯、螢蒽、芴、不對(duì)稱引達(dá)省、對(duì)稱引達(dá)省、茚、萘、卵苯、二萘嵌苯、非那烯、菲、苉、七曜烯、芘、吡蒽和玉紅省。雜芳基術(shù)語“雜芳基”包括單價(jià)的、雜芳香族的、環(huán)狀的烴基基團(tuán)，該基團(tuán)還含有一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自O(shè)、S、N和NRN的雜原子，其中RN在下文中定義（且在一個(gè)實(shí)施方式中是H或烷基(例如C1-6烷基)）。通常，所述雜芳基基團(tuán)可以是單環(huán)或多環(huán)（例如雙環(huán)）的稠環(huán)雜芳香族基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，雜芳基基團(tuán)含有5-13個(gè)環(huán)成員（優(yōu)選5-10個(gè)的成員）和1、2、3或4個(gè)獨(dú)立地選自O(shè)、S、N和NRN的環(huán)雜原子。在一個(gè)實(shí)施方式中，雜芳基基團(tuán)可以是5、6、9或10元環(huán)，例如5元單環(huán)、6元單環(huán)、9元稠環(huán)二環(huán)或10元稠環(huán)二環(huán)。單環(huán)雜芳基基團(tuán)包括含有5至6個(gè)環(huán)成員和選自O(shè)、S、N或NRN的1、2、3或4個(gè)雜原子的雜芳基基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，5元單環(huán)雜芳基基團(tuán)含有1個(gè)環(huán)成員，該環(huán)成員是-NRN-基團(tuán)、–O-原子或–S-原子以及任選地為=N-原子（此處5個(gè)環(huán)成員的其余部分為碳原子）的1-3個(gè)環(huán)成員（例如，1或2個(gè)環(huán)成員）。5元單環(huán)雜芳基基團(tuán)的示例是吡咯基、呋喃基、苯硫基、吡唑基、咪唑基、異唑基、唑基、異噻唑基、噻唑基、1,2,3三唑基、1,2,4三唑基、1,2,3二唑基、1,2,4二唑基、1,2,5二唑基、1,3,4二唑基、1,3,4噻二唑基、吡啶基、嘧啶基、噠嗪基、吡嗪基、1,3,5三嗪基、1,2,4三嗪基、1,2,3三嗪基和四唑基。6元單環(huán)雜芳基基團(tuán)的示例是吡啶基、噠嗪基、嘧啶基和吡嗪基。在一個(gè)是實(shí)施方式中，6元單環(huán)雜芳基基團(tuán)含有1或2個(gè)環(huán)成員，該環(huán)成員是=N-原子（此處6個(gè)環(huán)成員的其余部分為碳原子）。雙環(huán)雜芳基基團(tuán)包括含有9至13個(gè)環(huán)成員和選自O(shè)、S、N或NRN的1、2、3、4或多個(gè)雜原子的雜芳基基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，9元雙環(huán)雜芳基基團(tuán)含有1個(gè)環(huán)成員，該環(huán)成員是-NRN-基團(tuán)、–O-原子或–S-原子以及任選地可以是=N-原子（此處9個(gè)環(huán)成員的其余部分為碳原子）的1-3個(gè)環(huán)成員（例如，1或2個(gè)環(huán)成員）。9元稠環(huán)雙環(huán)雜芳基基團(tuán)的示例是苯并呋喃基、苯并苯硫基、吲哚基、苯并苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑劑、吡咯并[2,3-b]吡啶基、吡咯并[2,3-c]吡啶基、吡咯并[3,2-c]吡啶基、吡咯并[3,2-b]吡啶基、咪唑并[4,5-b]吡啶基、咪唑并[4,5-c]吡啶基、吡唑并[4,3-d]吡啶基、吡唑并[4,3-c]吡啶基、吡唑并[3,4-c]吡啶基、吡唑并[3,4-b]吡啶基、異吲哚基、吲唑基、嘌呤基、吲哚啉基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、咪唑并[1,5-a]吡啶基、吡唑并[1,2-a]吡啶基、吡咯并[1,2-b]噠嗪基和咪唑并[1,2-c]嘧啶基。在一個(gè)實(shí)施方式中，10元雙環(huán)雜芳基基團(tuán)含有1-3個(gè)環(huán)成員，該環(huán)成員是=N-原子（此處10個(gè)環(huán)成員的其余部分為碳原子）。10元稠環(huán)雙環(huán)雜芳基基團(tuán)的示例是喹啉基、異喹啉基、噌啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、酞嗪基、1,6-萘啶基、1,7-萘啶基、1,8-萘啶基、1,5-萘啶基、2,6-萘啶基、2,7-萘啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[4,3-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡啶并[2,3-d]嘧啶基、吡啶并[2,3-b]吡嗪基、吡啶并[3,4-b]吡嗪基、嘧啶并[5,4-d]嘧啶基、吡嗪并[2,3-b]吡嗪基和嘧啶并[4,5-d]嘧啶基。術(shù)語“雜芳基烷基”指帶有雜芳基基團(tuán)取代基的烷基。術(shù)語“雜亞芳基”包括二價(jià)的、雜芳族的、環(huán)狀的烴基基團(tuán)，該基團(tuán)還包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自O(shè)、S、N和NRN的雜原子，其中RN在下文中定義（且在一個(gè)實(shí)施方式中是H或烷基(例如C1-6烷基)）。通常，所述雜亞芳基基團(tuán)可以是單環(huán)或多環(huán)（例如雙環(huán)）的稠環(huán)雜芳香族基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，雜亞芳基基團(tuán)包含5-13個(gè)環(huán)成員（優(yōu)選5-10個(gè)成員）和1、2、3或4個(gè)獨(dú)立地選自O(shè)、S、N和NRN的環(huán)雜原子。在一個(gè)實(shí)施方式中，雜亞芳基基團(tuán)可以是5、6、9或10元環(huán)，例如5元單環(huán)、6元單環(huán)、9元稠環(huán)二環(huán)或10元稠環(huán)二環(huán)。術(shù)語“雜亞芳基”包括上述每種雜芳基基團(tuán)的二價(jià)衍生物。術(shù)語“芳基”、“芳香族的”、“雜芳基”和“雜芳香族的”也包括部分還原的基團(tuán)。因此例如，“雜芳基”包括稠合類，其中的一個(gè)環(huán)被還原為飽和環(huán)（例如1,2,3,4-四氫-1,8-萘啶-2-基）。不存在的基團(tuán)當(dāng)式(I)中的基團(tuán)a、b、或c“不存在”，這是指代替地存在一個(gè)鍵，即，基團(tuán)a、b或c任一邊的兩個(gè)基團(tuán)互相連接。概述除非另有說明，本文中的基團(tuán)組合指作為一部分，例如芳基烷基，所述部分通過最后提到的基團(tuán)所含的原子與所述分子其余部分連接。提及被O、S(O)q、N或P(O)r取代的烷基基團(tuán)或其它基團(tuán)的碳原子，意在說明：取代(其中E不能是H)；–CH=被–N=或–P(O)r=取代；≡C-H被≡N或≡P(O)r取代；或–CH2–被–O–、–S(O)q–、–NRN–或–P(O)rRN–取代，其中RN是H或任選取代的C1-6烷基、C1-6雜烷基、C3-6環(huán)烷基、C3-6雜環(huán)烷基、C2-6烯基、C2-6雜烯基、C3-6環(huán)烯基、C3-6雜環(huán)烯基、苯基、或含有5或6個(gè)環(huán)成員的雜芳基。RN優(yōu)選H、C1-6烷基或C3-6環(huán)烷基。q獨(dú)立地是0、1或2。在一個(gè)實(shí)施方式中，q是0。r獨(dú)立地是0或1。在一個(gè)實(shí)施方式中，r是0。提及被Si取代的碳原子，意在說明所述碳原子被替換成硅原子但鍵仍保持相同。因此例如，–CH2–被–SiH2–取代；–CH=被–SiH=取代；且≡C–H被≡Si–H取代。需要說明的是，關(guān)于上面提及的含雜原子的基團(tuán)（例如雜烷基等），當(dāng)存在多個(gè)碳原子時(shí)，例如C3-6雜烷基，意在說明基于C3-6烷基的基團(tuán)，其中3至6個(gè)鏈碳原子中的一個(gè)或多個(gè)被O、S(O)q或N取代。因此，C3-6雜烷基基團(tuán)含有少于3至6個(gè)鏈碳原子。作為另一個(gè)示例，吡啶基基團(tuán)即便含有5個(gè)碳原子，仍歸類為C6雜芳基基團(tuán)。取代本發(fā)明的化合物基團(tuán)（例如烷基、環(huán)烷基、烷氧基、烯基、環(huán)烯基、炔基、亞烷基、亞烯基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜烯基、雜環(huán)烯基、雜炔基、雜亞烷基、雜亞烯基芳基、芳基烷基、芳基雜烷基、雜芳基、雜芳基烷基或雜芳基雜烷基基團(tuán)等）可以是取代或未取代的，在一個(gè)實(shí)施方式中是未取代的。通常取代涉及氫原子被取代基團(tuán)概念性替代，或兩個(gè)氫原子被=O替代。在取代時(shí)，通常每個(gè)基團(tuán)上有1至5個(gè)取代基，在一個(gè)實(shí)施方式中有1至3個(gè)取代基，在一個(gè)實(shí)施方式中有1或2個(gè)取代基，在一個(gè)實(shí)施方式中有1個(gè)取代基。在一個(gè)實(shí)施方式中，在一個(gè)原子上有多于一個(gè)的取代基，例如乙縮醛基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述取代基獨(dú)立地為Sub1或Sub2（在一個(gè)實(shí)施方式中為Sub2），其中：Sub1獨(dú)立地為鹵素、三鹵代甲基、三鹵代乙基、-NO2、-CN、-N+(Rs)2O-、-CO2H、-CO2Rs、-SO3H、-SORs、-SO2Rs、-SO3Rs、-OC(=O)ORs、-C(=O)H、-C(=O)Rs、-OC(=O)Rs、=O、-NRs2、-C(=O)NH2、-C(=O)NRs2、-N(Rs)C(=O)ORs、-N(Rs)C(=O)NRs2、-OC(=O)NRs2、-N(Rs)C(=O)Rs、-C(=S)NRs2、-NRsC(=S)Rs、-SO2NRs2、-NRsSO2Rs、-N(Rs)C(=S)NRs2、-N(Rs)SO2NRs2、-Rsor–ZsRs、其中；Zs獨(dú)立地為O、S或NRs；Rs獨(dú)立地為H或C1-6烷基、C1-6雜烷基、-(Alka)f-C3-6環(huán)烷基、-(Alka)f-C3-6雜環(huán)烷基、C2-6烯基、C2-6雜烯基、-(Alka)f-C3-6環(huán)烯基、-(Alka)f-C3-6雜環(huán)烯基、C2-6炔基、C2-6雜炔基、-(Alka)f-C6-14芳基、-(Alka)f-C6-14芳基或-(Alka)f-雜芳基(其中雜芳基含5-13個(gè)環(huán)成員)，其中f是0或1；Alka是C1-6亞烷基或C1-6雜亞烷基；且Rs任選地被1至3個(gè)取代基Sub2取代（在一個(gè)實(shí)施方式中未被取代）；Sub2獨(dú)立地為鹵素、三鹵代甲基、三鹵代乙基、-NO2、-CN、-N+(C1-6烷基)2O-、-CO2H、-CO2C1-6烷基、-SO3H、-SOC1-6烷基、-SO2C1-6烷基、-SO3C1-6烷基、-OC(=O)OC1-6烷基、-C(=O)H、-C(=O)C1-6烷基、-OC(=O)C1-6烷基、=O、-N(C1-6烷基)2、-C(=O)NH2、-C(=O)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(=O)O(C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)C(=O)N(C1-6烷基)2、-OC(=O)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(=O)C1-6烷基、-C(=S)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(=S)C1-6烷基、-SO2N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)SO2C1-6烷基、-N(C1-6烷基)C(=S)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)SO2N(C1-6烷基)2、-C1-6烷基、-C1-6雜烷基、-C3-6環(huán)烷基、-C3-6雜環(huán)烷基、-C2-6烯基、-C2-6雜烯基、-C3-6環(huán)烯基、-C3-6雜環(huán)烯基、-C2-6炔基、-C2-6雜炔基、-C6-14-芳基、-C5-13雜芳基、-Zt-C1-6烷基、-Zt-C3-6環(huán)烷基、–Zt-C2-6烯基、–Zt-C3-6環(huán)烯基或–Zt-C2-6炔基；且Zt獨(dú)立地為O、S、NH或N(C1-6烷基)。雖然Sub1中的Rs可任選地被1至3個(gè)取代基Sub2取代，Sub2是未取代的。不過在一個(gè)實(shí)施方式中，Rs是未取代的。在一個(gè)實(shí)施方式中，Rs是H或C1-6烷基，任選地被1至3個(gè)取代基Sub2取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，Sub2獨(dú)立地為鹵素、三鹵代甲基、三鹵代乙基、-NO2、-CN、-N+(C1-6烷基)2O-、-CO2H、-SO3H、-SOC1-6烷基、-SO2C1-6烷基、-C(=O)H、-C(=O)C1-6烷基、=O、-N(C1-6烷基)2、-C(=O)NH2、-C1-6烷基、-C3-6環(huán)烷基、-C3-6雜環(huán)烷基、–Zt-C1-6烷基或–Zt-C3-6環(huán)烷基。在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)取代基團(tuán)為非環(huán)狀的（例如烷基、雜烷基、烯基等），Sub1不是Rs且Sub2不是-C1-6烷基、-C1-6雜烷基、-C2-6烯基、-C2-6雜烯基、-C2-6炔基或-C2-6雜炔基。非Sub2基團(tuán)具有至少2個(gè)可被取代的位置時(shí)，該基團(tuán)可被亞烷基、亞烯基、亞炔基、雜亞烷基、雜亞烯基、雜亞炔基鏈（在一個(gè)實(shí)施方式中含1至6個(gè)原子、在另一個(gè)實(shí)施方式中含3至6個(gè)原子，且在另一個(gè)實(shí)施方式中含3或4個(gè)原子）的兩端取代以形成環(huán)狀部分。該鏈任選地被1至3個(gè)取代基Sub2取代。在一個(gè)實(shí)施方式中該鏈未被取代。因此，術(shù)語任選取代的“環(huán)烷基”、“環(huán)烯基”、“環(huán)炔基”、“雜環(huán)烷基”、“雜環(huán)烯基”、“雜環(huán)炔基”、“芳基”和“雜芳基”包括稠合類。例如“任選取代的環(huán)烷基”包括其中兩個(gè)環(huán)烷基環(huán)稠合的種類，且“任選取代的雜芳基”包括其中雜環(huán)烷基環(huán)與芳香族環(huán)稠合的種類（例如5,6,7,8-四氫-1,8-萘啶-2-基）。非Sub2基團(tuán)具有可被取代兩次的原子時(shí)，該原子可被亞烷基、亞烯基、亞炔基、雜亞烷基、雜亞烯基、雜亞炔基鏈（在一個(gè)實(shí)施方式中含2至8個(gè)原子、在另一個(gè)實(shí)施方式中含3至6個(gè)原子，且在另一個(gè)實(shí)施方式中含4或5個(gè)原子）的兩端取代以形成環(huán)狀部分。該鏈任選地被1至3個(gè)取代基Sub2取代。在一個(gè)實(shí)施方式中該鏈未被取代。因此，術(shù)語任選取代的“環(huán)烷基”、“環(huán)烯基”、“環(huán)炔基”、“雜環(huán)烷基”、“雜環(huán)烯基”、“雜環(huán)炔基”、“芳基”和“雜芳基”包括螺類。需要說明的是，當(dāng)基團(tuán)是雜原子時(shí)，取代基可與所述雜原子結(jié)合。因此例如，“任選取代的雜烷基”包括CH2–N(Sub1)–CH2–、–CH(Sub1)–NH–CH2–和–CH(Sub1)–N(Sub1)–CH2–等。修飾術(shù)語當(dāng)列表前有修飾語時(shí)，意在理解為所述修飾語應(yīng)用于所述列表中的每一項(xiàng)。例如，詞組“任選取代的C3-20-雜環(huán)烷基、C3-20-雜環(huán)烯基、C3-20-雜環(huán)炔基或C5-20-雜芳基基團(tuán)”是指該列表中四項(xiàng)中的每項(xiàng)，即C3-20-雜環(huán)烷基基團(tuán)、C3-20-雜環(huán)烯基基團(tuán)、C3-20-雜環(huán)炔基基團(tuán)或C5-20-雜芳基基團(tuán)可被任選取代。當(dāng)基團(tuán)由第一修飾語描述，然后相同的基團(tuán)由后續(xù)的修飾語描述，這說明該基團(tuán)同時(shí)由兩個(gè)修飾語描述。例如，如果基團(tuán)被表述為“C3-20-雜環(huán)炔基”（第一修飾語）基團(tuán)然后該相同的基團(tuán)被表述為“C5-16”（后續(xù)的修飾語）基團(tuán)，這說明它是C5-16雜環(huán)炔基基團(tuán)。類固醇用于本文中的術(shù)語“類固醇”指包含以下結(jié)構(gòu)（該結(jié)構(gòu)在本文中指“類固醇骨架”）的任何基團(tuán)。僅為說明的目的，上面所繪制的類固醇骨架是完全飽和的。然而術(shù)語類固醇還意在涵蓋其中的類固醇骨架是不飽和的例子。例如，術(shù)語類固醇涵蓋包括完全飽和的(滿環(huán))基礎(chǔ)骨架的基團(tuán)，15H-環(huán)戊二烯并[a]菲：術(shù)語類固醇還涵蓋含部分不飽和的類固醇骨架的基團(tuán)。術(shù)語還分別涵蓋類固醇骨架的“斷(seco)”衍生物，即其中已發(fā)生環(huán)斷裂的基團(tuán)；其中涉及縮小和增大的類固醇骨架的“降(nor)”和“增(homo)”衍生物（參見有機(jī)化學(xué)系統(tǒng)命名法（SystemicNomenclatureofOrganicChemistry），D.Hellwinkel著，斯普林格（Springer）出版，ISBN:3-540-41138-0，第203頁(yè)記載“斷(seco)”和第204頁(yè)記載“降(nor)”和“增(homo)”）。然而在一個(gè)實(shí)施方式中，術(shù)語“類固醇”不包括該斷衍生物。然而在另一個(gè)實(shí)施方式中，術(shù)語“類固醇”不包括該降衍生物。然而在另一個(gè)實(shí)施方式中，術(shù)語“類固醇”不包括該增衍生物。因此在一個(gè)實(shí)施方式中，術(shù)語“類固醇”不包括該斷、降和增衍生物。術(shù)語類固醇還涵蓋其中結(jié)構(gòu)標(biāo)記的類固醇骨架上的一個(gè)或多個(gè)碳原子被雜原子取代的例子。在一個(gè)這樣的實(shí)施方式中，多至6個(gè)碳原子，在一個(gè)實(shí)施方式中多至5個(gè)碳原子，在另一個(gè)實(shí)施方式中多至4個(gè)碳原子，在另一個(gè)實(shí)施方式中多至3個(gè)碳原子，在另一個(gè)實(shí)施方式中多至2個(gè)碳原子，在另一個(gè)實(shí)施方式中1個(gè)碳原子中的每個(gè)碳原子獨(dú)立地被O、S(O)q、N、P(O)r或Si（并優(yōu)選O、S(O)q或N）取代。然而在一個(gè)實(shí)施方式中，術(shù)語“類固醇”包括其中“類固醇基礎(chǔ)骨架”不含雜原子的種類。類固醇環(huán)體系按以下習(xí)慣編號(hào)。術(shù)語類固醇包括固醇、類固醇激素、膽汁酸和膽汁酸鹽。固醇是在A環(huán)的3位具有羥基基團(tuán)的任何固醇。不飽和根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)用法，ω-3位指從鏈的（甲基）末端開始第三個(gè)鍵；ω-6位從鏈的（甲基）末端開始第六個(gè)鍵；ω-9位從鏈的（甲基）末端開始第九個(gè)鍵。概述除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施將采用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和藥理學(xué)的常規(guī)方法。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中已有充分描述。參見例如，參考文獻(xiàn)32－38等。術(shù)語“包含”涵蓋“包括”以及“由…組成”，例如，“包含”X的組合物可以僅由X組成或可以包括其它物質(zhì)，例如X+Y。與數(shù)值x相關(guān)的術(shù)語“約”是任選的并表示例如x±10%。術(shù)語“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的組合物可能完全不含Y。如有需要，“基本上”一詞可以從本發(fā)明的定義中省略。述及電荷、陽離子、陰離子、兩性離子等，在pH7時(shí)獲取。TLR3是類Toll受體3。其為先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的單一的跨膜受體。已知的TLR3激動(dòng)劑包括poly(I:C)?！癟LR3”是編碼該受體的基因的核準(zhǔn)HGNC名稱，其唯一的HGNCID是HGNC:11849。人TLR3基因的RefSeq序列是GI:2459625。TLR7是類Toll受體7。其為在先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的單一的跨膜受體。已知的TLR7激動(dòng)劑包括例如咪喹莫特。“TLR7”是編碼該受體的基因的核準(zhǔn)HGNC名稱，其唯一的HGNCID是HGNC:15631。人TLR7基因的RefSeq序列是GI:67944638。TLR8是類Toll受體8。其為在先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的單一的跨膜受體。已知的TLR8激動(dòng)劑包括例如瑞喹莫德?！癟LR8”是編碼該受體的基因的核準(zhǔn)HGNC名稱，其唯一的HGNCID是HGNC:15632。人TLR8基因的RefSeq序列是GI:20302165。類RIG-I受體(“RLR”)家族包括先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的各種RNA解旋酶[39]。RLR-1(也稱為RIG-I或視黃酸誘導(dǎo)型基因I)在N末端附近含兩個(gè)半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域。編碼RLR-1解旋酶的基因的核準(zhǔn)HGNC名稱是“DDX58”（相當(dāng)于DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)盒多肽58），唯一的HGNCID是HGNC:19102。人RLR-1基因的RefSeq序列是GI:77732514。RLR-2(也稱為MDA5或黑瘤素分化相關(guān)基因5)也在N末端附近含兩個(gè)半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域。編碼RLR-2解旋酶的基因的核準(zhǔn)HGNC名稱是“IFIH1”（相當(dāng)于解旋酶C結(jié)構(gòu)域1誘導(dǎo)的干擾素），唯一的HGNCID是HGNC:18873。人RLR-2基因的RefSeq序列是GI:27886567。RLR-3（也稱為L(zhǎng)GP2或遺傳和生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室2）有兩個(gè)半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域。編碼RLR-3解旋酶的基因的核準(zhǔn)HGNC名稱是“DHX58”（相當(dāng)于DEXH(Asp-Glu-X-His)盒多肽58），唯一的HGNCID是HGNC:29517。人RLR-3基因的RefSeq序列是GI:149408121。PKP是雙鏈RNA依賴性蛋白激酶。其在先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮了重要作用?！癊IF2AK2”（相當(dāng)于真核翻譯啟動(dòng)因子2-α激酶2）是編碼酶的基因的核準(zhǔn)HGNC名稱，其唯一的HGNCID是HGNC:9437。人PKR基因的RefSeq序列是GI:208431825。附圖說明圖1顯示含有染色RNA的凝膠。泳道顯示(1)標(biāo)記物(2)裸復(fù)制子(3)經(jīng)RNA酶處理的復(fù)制子(4)包埋在脂質(zhì)體中的復(fù)制子(5)經(jīng)RNA酶處理的脂質(zhì)體(6)經(jīng)RNA酶處理然后經(jīng)苯酚/氯仿提取的脂質(zhì)體。圖2是脂質(zhì)體的電子顯微鏡照片。圖3顯示在含多種陽離子脂質(zhì)的脂質(zhì)體中的RNA遞送6天后的蛋白質(zhì)表達(dá)（如相對(duì)光單位，RLU）。圖4顯示含有染色RNA的凝膠。泳道顯示(1)標(biāo)記物(2)裸復(fù)制子(3)包埋在脂質(zhì)體中的復(fù)制子(4)經(jīng)RNA酶處理再經(jīng)苯酚/氯仿提取的脂質(zhì)體。圖5顯示作為病毒顆粒包裝復(fù)制子（方塊）的、作為裸RNA(菱形)的或在脂質(zhì)體中(+=0.1μg,x=1μg)的RNA遞送1、3和6天后的蛋白表達(dá)。圖6顯示4種不同劑量的脂質(zhì)體包埋的RNA在遞送1、3和6天后的蛋白表達(dá)。圖7顯示接受病毒顆粒包裝復(fù)制子（VRP或VSRP）、1μg裸RNA和1μg脂質(zhì)體包埋的RNA的動(dòng)物中抗FIgG的效價(jià)。圖8顯示接受VRP、1μg裸RNA和0.1μg或1μg脂質(zhì)體包埋的RNA的動(dòng)物中抗FIgG的效價(jià)。圖9顯示接受VRP或0.1g或1μg的任一劑量的脂質(zhì)體包埋的RNA后的動(dòng)物中的中和抗體效價(jià)。圖10顯示作為裸RNA（圓圈）、脂質(zhì)體包埋的RNA（三角和方塊）或作為脂復(fù)合物（倒三角）的復(fù)制子遞送后的表達(dá)水平。圖11顯示作為裸RNA(0.01-1μg)、脂質(zhì)體包埋的RNA（0.01-10μg）或作為病毒顆粒(VRP，106感染單位或IU)包裝的復(fù)制子在遞送后（給予第兩劑量?jī)芍芎螅┑腇特異性IgG效價(jià)。圖12顯示作為裸RNA(1μg)、脂質(zhì)體包埋的RNA（0.1或1μg）或作為病毒顆粒（VRP，106IU）包裝的復(fù)制子在遞送后的F特異性IgG效價(jià)（圓圈）和PRNT效價(jià)（方塊）。還顯示了原初小鼠的效價(jià)。實(shí)線表示幾何平均值。圖13顯示給予第二劑量4周后用代表F蛋白中主要表位的合成肽再刺激后的胞內(nèi)細(xì)胞因子的產(chǎn)生情況。Y軸顯示CD8+CD4-的％細(xì)胞因子。圖14顯示對(duì)第0和第21天的牛免疫接種63天后的F特異性IgG效價(jià)（log10效價(jià)平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）。具體實(shí)施方式RNA復(fù)制子使用以下多種復(fù)制子。通常這些復(fù)制子基于具有雜交α病毒基因組，其帶有委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（VEEV）的非結(jié)構(gòu)蛋白、辛德畢斯病毒的包裝信號(hào)和辛德畢斯病毒的3'UTR或VEEV突變體的。所述復(fù)制子長(zhǎng)度約10kb并具有聚A尾。將編碼α病毒復(fù)制子（名為pT7-mVEEV-FL.RSVF或A317；pT7-mVEEV-SEAP或A306；pSP6-VCR-GFP或A50）的質(zhì)粒DNA作為模板來體外合成RNA。所述復(fù)制子包含RNA復(fù)制所需的α病毒遺傳元件但缺少編碼顆粒裝配所需的基因產(chǎn)品的序列；結(jié)構(gòu)蛋白被感興趣的蛋白（報(bào)告蛋白如SEAP或GFP，或免疫原如全長(zhǎng)RSVF蛋白）取代，因此所述復(fù)制子不能誘導(dǎo)感染顆粒的產(chǎn)生。α病毒cDNA上游的噬菌體（T7或SP6）啟動(dòng)子促進(jìn)所述復(fù)制子RNA體外合成，且緊鄰聚(A)尾下游的丁型肝炎病毒（HDV）核酶通過其自切割活性產(chǎn)生校正的3’末端。所述HDV核酶下游的質(zhì)粒DNA用合適的限制性內(nèi)切核酸酶線性化后，用T7或SP6噬菌體來源的DNA依賴性RNA聚合酶體外合成失控轉(zhuǎn)錄本。按照生產(chǎn)商（安碧公司(Ambion)）提供的說明，在存在7.5mM（T7RNA聚合酶）或5mM（SP6RNA聚合酶）各三磷酸核苷（ATP、CTP、GTP和UTP）時(shí)，于37℃轉(zhuǎn)錄2小時(shí)。轉(zhuǎn)錄后，用TURBODNA酶（安碧公司）消化模板DNA。用LiCl沉淀所述復(fù)制子RNA并在無核酸酶的水中重建。按照使用手冊(cè)利用ScriptCapm7G加帽系統(tǒng)（ScriptCapm7GCappingSystem）（艾比森得生物技術(shù)公司（EpicentreBiotechnologies））用牛痘加帽酶（VacciniaCappingEnzyme）(VCE)在轉(zhuǎn)錄后對(duì)未加帽的RNA加帽；采用該方法加帽的復(fù)制子標(biāo)有“v”前綴，例如vA317是經(jīng)VCE加帽的A317復(fù)制子。轉(zhuǎn)錄后加帽的RNA用LiCl沉淀并在無核酸酶的水中重建。通過測(cè)量OD260nm來測(cè)定RNA樣品濃度。體外轉(zhuǎn)錄本的完整性通過變性瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。基于DlinDMA的脂質(zhì)體中的包埋將RNA包埋于主要通過參考文獻(xiàn)7和40的方法所制備的脂質(zhì)體中。所述脂質(zhì)體由10%DSPC(兩性離子)、40%DlinDMA(陽離子)、48%膽固醇和2%PEG結(jié)合的DMG(2kDaPEG)制成。這些比例指總脂質(zhì)體中的摩爾百分比。采用參考文獻(xiàn)2的方法合成DlinDMA(1,2-二油酰-N,N-二甲基-3-氨基丙烷)。DSPC(1,2-二硬質(zhì)酰-sn-甘油-3-磷酸酰膽堿)購(gòu)自健贊公司（Genzyme）。膽固醇獲自西格瑪-奧德里奇公司（Sigma-Aldrich）。PEG結(jié)合的DMG(1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)，銨鹽)、DOTAP(1,2-二油酰-3-三甲基銨-丙烷，氯化鹽)和DC-膽固醇(3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨甲?；鵠鹽酸膽固醇)來自阿凡提極性脂質(zhì)公司（AvantiPolarLipids）。簡(jiǎn)單來說，將脂質(zhì)溶于乙醇（2ml），將RNA復(fù)制子溶于緩沖劑（2ml,100mM檸檬酸鈉,pH6），并將它們?cè)?ml緩沖劑中混合，然后平衡1小時(shí)。將該混合物用6ml緩沖劑稀釋然后過濾。得到的產(chǎn)物含有脂質(zhì)體，包埋效率為大約95％。圖2顯示通過該方法制得的示例性脂質(zhì)體電子顯微鏡照片。這些脂質(zhì)體含有包埋的編碼全長(zhǎng)RSVF抗原的RNA。一個(gè)批料的動(dòng)態(tài)光散射顯示平均直徑為141nm(Zav，強(qiáng)度)或78nm(數(shù)目)。在一個(gè)具體的包埋方法中，在乙醇中制備新鮮脂質(zhì)母液。稱量37mgDlinDMA、11.8mgDSPC、27.8mg膽固醇和8.07mgPEG結(jié)合的DMG并溶于7.55mL乙醇中。使用三種不同的結(jié)合用PEG：PEG-1000、PEG-2000或PEG-3000。37℃溫和搖動(dòng)新鮮配制的脂質(zhì)母液約15分鐘以形成均質(zhì)混合物。然后將226.7μL該母液加入1.773mL乙醇中形成2mL工作脂質(zhì)母液。同樣用約1μg/μL母液在100mM檸檬酸緩沖液（pH6）中制備2mLRNA工作液。使用前用RNA酶去除（RNaseAway）液沖洗3個(gè)20mL的玻璃瓶（有攪拌棒）并用大量MilliQ水清洗以去除瓶的RNA酶污染。其中一個(gè)瓶用于所述RNA工作液，其他的用于收集所述脂質(zhì)和RNA混合物（如下所述）。將工作脂質(zhì)和RNA溶液在37℃加熱10分鐘，然后裝入3cc魯爾接口注射器中。將2mL檸檬酸緩沖劑(pH6)加入另一3cc注射器中。將含有RNA和所述脂質(zhì)的注射器用FEP管（氟化乙烯-丙烯；所有使用的FEP管內(nèi)徑為2mm，外徑為3mm；獲自藝達(dá)思健康科學(xué)公司（IdexHealthScience））與T混合器（Tmixer）(PEEKTM500μmID接頭)相連接。T混合器的出口也是FEP管。含有檸檬酸緩沖劑的第三個(gè)注射器連接到管的分離部分。然后使用注射泵以7mL/分鐘的流速驅(qū)動(dòng)所有注射器。該管出口放置成所述混合物收集到20mL玻璃瓶中（攪拌時(shí)）。取出攪拌棒并將乙醇/水性溶液室溫平衡1小時(shí)。將4mL混合物裝入連接部分FEP管的5cc注射器中，在另一個(gè)連有等長(zhǎng)FEP管的5cc注射器中裝入等量100mM檸檬酸緩沖液（pH6）。用注射泵以7mL/分鐘的流速驅(qū)動(dòng)所述兩個(gè)注射器，并將最終混合物收集到20mL玻璃瓶中（攪拌時(shí)）。之后，將第二混合步驟（脂質(zhì)體）收集的混合物通過MustangQ膜（結(jié)合并移除陰離子分子的陰離子交換支持物，獲自波樂公司(PallCorporation)）。將該膜用于所述脂質(zhì)體前，用4mL的1MNaOH、4mL的1MNaCl和10mL的100mM檸檬酸緩沖液(pH6)依次通過該膜。將該脂質(zhì)體在37℃加熱10分鐘然后通過該膜。之后，將脂質(zhì)體濃縮到2mL并通過切向流過濾用10-15體積1×PBS進(jìn)行透析。所述TFF系統(tǒng)和中空纖維素過濾膜購(gòu)自斯派實(shí)驗(yàn)室(SpectrumLabs)（加利福尼亞州多明格斯牧場(chǎng)(RanchoDominguez,CA)）并按照生產(chǎn)商指南使用。使用100kD孔徑截止值和8cm2表面積的聚砜中空纖維素過濾膜。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，制劑用1XPBS稀釋到所需的RNA濃度。按照制造商的說明利用Quant-iTRiboGreenRNA試劑盒（英杰公司（Invitrogen））測(cè)定包埋的RNA和RNA的百分比濃度。使用試劑盒提供的核糖體RNA標(biāo)準(zhǔn)以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。加入染料前，用1×TE緩沖劑（來自試劑盒）將脂質(zhì)體稀釋10倍或100倍。單獨(dú)地，加入染料（以破壞脂質(zhì)體從而測(cè)定全RNA）前將脂質(zhì)體在含0.5%TritonX的1×TE緩沖劑中稀釋10倍或100倍。之后向每份溶液中加入等量染料，然后在加入染料后將每份溶液180μL一式兩份加到96孔組織培養(yǎng)板上。在酶標(biāo)儀上讀取熒光值（激發(fā)485nm，發(fā)射528nm）。所有脂質(zhì)體制劑基于RNA的包埋量體內(nèi)給予。為獲得較小的脂質(zhì)體，用將脂質(zhì)和RNA溶液在微流體芯片的管道中混合的方法代替所述注射器/管的方法。在乙醇中配制新鮮的脂質(zhì)母液。稱量37mgDlinDMA、11.8mgDSPC、27.8mg膽固醇和8.07mgPEG-DMG并溶于7.55mL乙醇中。37℃溫和搖動(dòng)新鮮配制的脂質(zhì)母液約15分鐘以形成均質(zhì)混合物。然后將226.7μL所述母液加入1.773mL乙醇中形成2mL工作脂質(zhì)母液。同樣用約1μg/μL母液在100mM檸檬酸緩沖液（pH6）中制備4mLRNA工作液使用前用RNA酶去除（RNaseAway）液沖洗4個(gè)20mL的玻璃瓶（帶攪拌棒）并用大量MilliQ水清洗以去除瓶的RNA酶污染。其中兩個(gè)玻璃瓶用于RNA工作溶液（每瓶2mL），其它的玻璃瓶用于收集脂質(zhì)和RNA混合物。工作脂質(zhì)和RNA溶液在37℃加熱10分鐘，然后在裝入3cc魯爾接口（luer-lok）注射器中。通過（Syrris）4-通道邊緣接觸器（4-wayedgeconnector）將含有RNA和所述脂質(zhì)的注射器連接到采用PTFE管0.03英寸IDx1/16英寸OD的Mitos液滴接口芯片（獲自Syrris公司的玻璃微流體裝置，產(chǎn)品編號(hào)：3000158）。通過注射器泵驅(qū)動(dòng)兩個(gè)RNA流和一個(gè)脂質(zhì)流，并在芯片X接口(100μmx105μm)處進(jìn)行乙醇和水相的混合。三個(gè)物流的流速都保持在1.5mL/分鐘，因此總水流與乙醇流度之比為2:1。所述管出口放置成所述混合物收集到20mL玻璃瓶中（攪拌時(shí)）。取出攪拌棒并將乙醇/水性溶液室溫平衡1小時(shí)。然后將所述混合物裝入5cc注射器中，該注射器訂制成PTFE管的一部分0.03英寸ID×1/16英寸OD，且在另一個(gè)與等長(zhǎng)PTFE管連接的5cc注射器中裝入等體積的100mM檸檬酸緩沖液(pH6)。用注射泵以3mL/分鐘的流速驅(qū)動(dòng)所述兩個(gè)注射器，并將最終混合物收集到20mL玻璃瓶中（攪拌時(shí)）。之后，將脂質(zhì)體濃縮到2mL并通過TFF系統(tǒng)用10-15體積1×PBS進(jìn)行透析，然后回收終產(chǎn)物。使用100kD孔徑截止值和20cm2表面積的中空纖維素過濾膜。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，制劑用1×PBS稀釋到所需的RNA濃度。通過注射器/管方法用75μgRNA制備的脂質(zhì)體具有148nm的Z平均直徑和0.122的多分散性指數(shù)，芯片混合制得的脂質(zhì)體具有97nm的Z平均直徑和0.086的多分散性指數(shù)。包埋的RNA的比例從90％略微下降至87％。脂質(zhì)體包埋顯示保護(hù)RNA免受RNA酶消化。實(shí)驗(yàn)采用3.8mAU的RNA酶A每微克RNA，在室溫孵育30分鐘。用蛋白水解酶K在55℃處理10分鐘使RNA酶失活。然后在1:1v/v樣品混合物中加入25:24:1v/v/v的苯酚:氯仿:異戊醇，以從脂質(zhì)中提取RNA到水相中。然后將樣品渦旋混合數(shù)秒，然后將其置于離心機(jī)中12kRPM離心15分鐘。去除水相（包含RNA）并用于分析RNA。上樣(400ngRNA/孔)前，所有樣品和甲醛上樣染料一起孵育，65℃變性10分鐘并冷卻至室溫。采用安碧Millennium標(biāo)記來估算RNA構(gòu)建體的分子量。在90V跑膠。根據(jù)制造商的指示下在室溫?fù)u動(dòng)1小時(shí)使用0.1%SYBR金在水中對(duì)凝膠染色。圖1顯示不存在包埋物時(shí)RNA酶完全消化RNA（泳道3）。包埋后無法檢測(cè)到RNA（泳道4），且當(dāng)這些脂質(zhì)體經(jīng)RNA酶處理也沒有發(fā)現(xiàn)變化（泳道4）。RNA酶處理過的脂質(zhì)體經(jīng)苯酚提取后，可觀察到未消化的RNA（泳道6）。即使在4℃保存1周后可觀察到該RNA沒有任何斷裂。在4℃保存6周并經(jīng)過一輪冷凍-融化循環(huán)后體內(nèi)蛋白表達(dá)無變化。因此脂質(zhì)體包埋的RNA很穩(wěn)定。為評(píng)估RNA的體內(nèi)表達(dá)，復(fù)制子不編碼免疫原而編碼報(bào)告酶（SEAP，分泌型堿性磷酸酶）。使用化學(xué)發(fā)光堿金屬磷酸鹽底物在經(jīng)1×Phospha-Light稀釋緩沖液以1:4稀釋的血清中測(cè)定表達(dá)水平。在第0天以0.1μg或1μgRNA劑量向8－10周齡BALB/c小鼠（5個(gè)/每組）每條腿肌內(nèi)注射50μl。同樣給予1μg無脂質(zhì)體的相同載體（無RNA酶的1×PBS中）。也測(cè)定病毒顆粒包裝的復(fù)制子。通過參考文獻(xiàn)41的方法獲得用于本文的病毒顆粒包裝的復(fù)制子（稱為“VRPs”），其中α病毒復(fù)制子衍生自突變VEEV或衍生自VEEV基因組的嵌合體，該VEEV基因組經(jīng)工程改造含有辛德比斯病毒3'UTR和辛德比斯病毒包裝信號(hào)（PS）,并通過以下方法包裝：將其共電穿孔導(dǎo)入含編碼辛德比斯病毒質(zhì)粒和糖蛋白基因的缺陷性輔助RNA的BHK細(xì)胞。如圖5所示，以1μg劑量包埋提高約的SEAP水平，在第6天0.1μg包埋劑量的表達(dá)與1μg未包埋劑量所觀察到的水平相當(dāng)。到第3天表達(dá)水平超過VRP所達(dá)到的水平（方塊）。因此當(dāng)RNA配制到脂質(zhì)體中時(shí)，表達(dá)相比裸RNA對(duì)照其得到提高，甚至在10×的較低劑量。表達(dá)也高于VRP對(duì)照，但表達(dá)動(dòng)力學(xué)差別很大（見圖5）。采用電穿孔遞送RNA導(dǎo)致表達(dá)相比裸RNA對(duì)照得到提高，但該水平低于采用脂質(zhì)體的水平。為評(píng)估脂質(zhì)體組的效果是否僅僅是由于脂質(zhì)體組分還是與包埋有關(guān)，將所述復(fù)制子以包埋的形式給予（用兩種不同的純化方案，0.1μgRNA），或與脂質(zhì)體混合在形成后（非包埋“脂質(zhì)復(fù)合物”，0.1μgRNA）給予，或以裸RNA（1μg）給予。圖10顯示所述脂質(zhì)復(fù)合物表達(dá)水平最低，表明包埋對(duì)于有效表達(dá)是必需的。其它SEAP實(shí)驗(yàn)顯示體內(nèi)明顯的劑量應(yīng)答，以少至1ng的RNA遞送后還可觀察到表達(dá)（圖6）。比較包埋和裸復(fù)制子表達(dá)的其它實(shí)驗(yàn)表明0.01μg包埋的RNA相當(dāng)于1μg裸RNA。0.5μg的RNA劑量時(shí)包埋物質(zhì)在第6天的表達(dá)高出12倍；0.1μg劑量時(shí)在第6天的水平高出24倍。除了在組中觀察平均水平，還研究單個(gè)動(dòng)物。數(shù)個(gè)動(dòng)物對(duì)裸復(fù)制子無應(yīng)答，包埋則消減了無應(yīng)答者。其它實(shí)驗(yàn)中用DOTAP(“RV13”)替代DlinDMA。雖然DOTAP脂質(zhì)體相比裸復(fù)制子得到較好的表達(dá)，但比DlinDMA脂質(zhì)體差（第1天有2到3倍的差異）。為體內(nèi)評(píng)估免疫原性，構(gòu)建復(fù)制子以表達(dá)呼吸道合胞病毒（RSV）的全長(zhǎng)F蛋白。在第0天后第21天將其以裸的(1μg)、包埋在脂質(zhì)體中(0.1或1μg)、或包裝在病毒顆粒中(106IU；“VRP”)遞送。圖7顯示給予第二劑量?jī)芍芎蟮目笷IgG效價(jià)，并且脂質(zhì)體明顯增強(qiáng)免疫原性。圖8顯示2周后的效價(jià)，此時(shí)0.1μg包埋RNA、1μg包埋RNA或VRP組之間無統(tǒng)計(jì)差異性。給予第2劑量2周后，這三組的中和效價(jià)（以60％空斑減少測(cè)量，“PRNT60”)）無顯著差異性（圖9）。圖12顯示給予第二劑量4周后IgG和PRNT效價(jià)。圖13證實(shí)所述RNA引起強(qiáng)烈的CD8T細(xì)胞應(yīng)答。其它實(shí)驗(yàn)比較了接受VRP、0.1μg脂質(zhì)體包埋的RNA或1μg脂質(zhì)體包埋的RNA的小鼠中F特異性IgG效價(jià)。以下為給予第二劑量后不同時(shí)間的效價(jià)比例（VRP:脂質(zhì)體）：2周4周8周0.1μg2.91.01.11μg2.30.90.9因此脂質(zhì)體包埋的RNA誘導(dǎo)基本上與通過病毒顆粒遞送相同水平的免疫應(yīng)答。其它實(shí)驗(yàn)顯示10μg劑量產(chǎn)生較強(qiáng)的F特異性IgG應(yīng)答，1μg和0.1μg劑量產(chǎn)生等同的應(yīng)答，0.01μg劑量產(chǎn)生較低應(yīng)答。圖11顯示以3種不同劑量接受裸復(fù)制子形式復(fù)制子，以4種不同劑量接受脂質(zhì)體形式的復(fù)制子或以VRP形式(106IU)的復(fù)制子的小鼠中IgG效價(jià)。相比VRP，1μg脂質(zhì)體包埋的RNA表現(xiàn)出的應(yīng)答統(tǒng)計(jì)學(xué)不顯著（ANOVA），但相對(duì)其它兩組10μg脂質(zhì)體包埋的RNA表現(xiàn)出的較高應(yīng)答統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著（p<0.05）。其它實(shí)驗(yàn)證實(shí)，0.1μg脂質(zhì)體包埋的RNA得到遠(yuǎn)高于0.1μg遞送的DNA的抗FIgG應(yīng)答（第二劑量15天后），免疫原性甚至強(qiáng)于20μg通過電穿孔（ElgenTMDNA遞送系統(tǒng)，Inovio公司（ElgenTMDNADeliverySystem,Inovio））遞送的編碼F抗原的質(zhì)粒DNA。使用棉鼠（剛毛棉花鼠（Sigmodonhispidis））取代小鼠進(jìn)行進(jìn)一步研究。1μg劑量時(shí)脂質(zhì)體包埋相比裸RNA提高F特異性IgG效價(jià)8.3倍，并提高中和效價(jià)9.5倍（以PRNT60測(cè)定）?？贵w應(yīng)答的強(qiáng)度等同于由5×106IUVRP誘導(dǎo)的強(qiáng)度。裸RNA和脂質(zhì)體包埋的RNA都能保護(hù)棉鼠免受RSV激發(fā)（1×105空斑形成單位），降低肺病毒載量至少3.5log。包埋提高約2倍的降低。在牛中進(jìn)行大型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。用66μg配制在脂質(zhì)體中的編碼全長(zhǎng)RSVF蛋白的復(fù)制子在第0天和第21天免疫接種牛。單一的PBS作為陰性對(duì)照，批準(zhǔn)疫苗作為陽性對(duì)照（來自FortDodge公司的“三角4”(“Triangle4”)，含有滅活病毒）。圖14顯示從第一次免疫接種起算的63天期間的F-特異性IgG效價(jià)。所述RNA復(fù)制子在牛中產(chǎn)生免疫原性，雖然給出的效價(jià)低于批準(zhǔn)疫苗的效價(jià)。所有接種疫苗的牛在接受第二次劑量后顯示F特異性抗體，且在接受第二次劑量后的2至6周期間效價(jià)很穩(wěn)定（且RNA疫苗特別穩(wěn)定）。使用替代的陽離子脂質(zhì)進(jìn)行脂質(zhì)體包埋作為使用DlinDMA的替代方式，使用參考文獻(xiàn)8中的陽離子脂質(zhì)。這些脂質(zhì)可根據(jù)參考文獻(xiàn)8公開的內(nèi)容合成。上述使用DlinDMA形成的脂質(zhì)體是指下文中的“RV01”系列。用下文所述系列“RV02”至“RV12”中的各種陽離子脂質(zhì)替代DlinDMA。使用2％PEG2000-DMG以及（01）40%陽離子脂質(zhì)、10%DSPC和48%膽固醇，或（02）60％陽離子脂質(zhì)和38％膽固醇形成每種脂質(zhì)體的兩種不同類型。因此（01）和（02）脂質(zhì)體的比較顯示中性的兩親性脂質(zhì)體的作用。使用以下陽離子脂質(zhì)制備RV02脂質(zhì)體：使用以下陽離子脂質(zhì)制備RV03脂質(zhì)體：使用以下陽離子脂質(zhì)制備RV04脂質(zhì)體：使用以下陽離子脂質(zhì)制備RV05脂質(zhì)體：使用以下陽離子脂質(zhì)制備RV06脂質(zhì)體：使用以下陽離子脂質(zhì)制備RV07脂質(zhì)體：使用以下陽離子脂質(zhì)制備RV08脂質(zhì)體：使用以下陽離子脂質(zhì)制備RV09脂質(zhì)體：使用以下陽離子脂質(zhì)制備RV10脂質(zhì)體：使用以下陽離子脂質(zhì)制備RV11脂質(zhì)體：使用以下陽離子脂質(zhì)制備RV12脂質(zhì)體：使用以下陽離子脂質(zhì)（DOTAP，為比較的目的）制備RV13脂質(zhì)體：使用以下陽離子脂質(zhì)（DC-膽固醇，為了比較）制備RV14脂質(zhì)體：使用以下陽離子脂質(zhì)制備RV15脂質(zhì)體：用上述的SEAP報(bào)告子測(cè)定這些脂質(zhì)體。以下表格顯示所述脂質(zhì)體尺寸（Z均值和多分散性指數(shù)）、每種脂質(zhì)體的RNA包埋的百分比以及注射后第1天和第6天檢測(cè)的SEAP活性。由DlinDMA、膽固醇和PEG-DMG制成的“RV01(02)””脂質(zhì)體的SEAP活性：圖3表明在第6天觀察到的SEAP表達(dá)水平。RV04、RV05、RV07、RV08、RV09和RV11觀察到最佳結(jié)果。這些脂質(zhì)中的多種也被用于遞送編碼全長(zhǎng)RSVF蛋白的復(fù)制子。一個(gè)實(shí)驗(yàn)比較了RV01、RV05和RV13；采用RV01時(shí)觀察到最高F特異性血清IgG效價(jià)，采用RV13觀察到的最低。另一個(gè)實(shí)驗(yàn)比較了RV01、RV02、RV04和RV07；采用RV01時(shí)再次觀察到最佳結(jié)果，而RV07表現(xiàn)不佳。另一個(gè)實(shí)驗(yàn)比較了RV01、RV03、RV08、RV09和RV14；采用RV01時(shí)再次觀察到最佳結(jié)果，而RV03和RV14表現(xiàn)不佳。另一個(gè)實(shí)驗(yàn)比較了RV01、RV10、RV11和RV15；采用RV01時(shí)再次觀察到最佳結(jié)果。總而言之，采用RV01、RV05、RV08和RV09時(shí)觀察到最佳結(jié)果，而RV13(DOTAP)和RV14(DC-膽固醇)表現(xiàn)不佳。因此并非所有脂質(zhì)體都能有效引起免疫應(yīng)答。但總的來說，當(dāng)脂質(zhì)體中的陽離子脂質(zhì)pKa范圍在5.0至7.6，特別是在5.5至6.7、5.6至6.3、5.6至6.0或5.7至5.9時(shí)被觀察到表現(xiàn)出最佳免疫功效。BHK表達(dá)將含不同脂質(zhì)的脂質(zhì)體和BHK細(xì)胞一起過夜孵育并評(píng)估蛋白表達(dá)功效。由RV05脂質(zhì)的基線可知，通過對(duì)脂質(zhì)體加入10％1,2-二植烷酰sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DPyPE)表達(dá)可提高18倍或通過加入10%18:2（順式）磷脂酰膽堿可提高10倍?？偠灾?，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明不飽和脂質(zhì)尾部?jī)A向于增強(qiáng)針對(duì)所編碼抗原引起的IgG效價(jià)。RSV免疫原通過在第0天和第21天僅用所述復(fù)制子（1μg）或以RV05或（為了比較）RV01或RV13配制的脂質(zhì)體雙側(cè)肌內(nèi)接種疫苗（每條腿50μL），對(duì)BALB/c小鼠（每組4或8個(gè)）給予編碼RSVF蛋白的vA317自復(fù)制復(fù)制子。RV01脂質(zhì)體具有40%DlinDMA、10%DSPC、48%膽固醇和2%PEG-DMG，但具有不同含量的RNA。RV05脂質(zhì)體具有40%RV05、10%DSPC、48%膽固醇和2%PEG-DMG或60%RV05、38%膽固醇和2%PEG-DMG。RV13脂質(zhì)體具有40%DOTAP、10%DOPE、48%膽固醇和2%PEG-DMG。使用多種技術(shù)制備所述脂質(zhì)體。為作比較，使用電子穿孔或采用RV01(10)脂質(zhì)體（0.1μgDNA）遞送編碼相同RSV-F抗原的裸質(zhì)粒DNA(20μg)。將4只小鼠作為原初對(duì)照組。Z平均粒徑和多分散指數(shù)為：在第14天、36天和49天收集血清用于抗體分析。在第49天收集小鼠的脾臟用于T細(xì)胞分析。以下是F特異性血清IgG效價(jià)(GMT)：因此，根據(jù)測(cè)定所提高的F特異性IgG效價(jià)和T細(xì)胞頻率，與裸RNA對(duì)照相比脂質(zhì)體制劑顯著提高了免疫原性。以脂質(zhì)體配制的質(zhì)粒DNA或通過電穿孔裸露遞送，其免疫原性都顯著低于脂質(zhì)體配制的自復(fù)制RNA。不同小鼠系中的RSV免疫原性復(fù)制子“vA142”編碼RSV的全長(zhǎng)野生型表面融合(F)糖蛋白但所帶融合肽被刪除，而且3'端通過核酶介導(dǎo)切割所形成。在三種不同的小鼠系中測(cè)試。在第0天和第22天對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行兩側(cè)肌內(nèi)免疫接種（每條腿50μL）。將動(dòng)物分成8個(gè)測(cè)試組（每組5只動(dòng)物）和對(duì)照組（2只動(dòng)物）：組1給予裸復(fù)制子（1μg）。組2給予1μg以脂質(zhì)體“RV01(37)”遞送的復(fù)制子，該脂質(zhì)體含40%DlinDMA、10%DSPC、48%膽固醇、2%PEG結(jié)合的DMG。組3給予和組2相同的物質(zhì)，但以0.1μgRNA遞送。組4給予1μg“RV05(11)”脂質(zhì)體（40%RV05脂質(zhì)、30%18:2PE(DLoPE、28%膽固醇、2%PEG-DMG）中的復(fù)制子。組5給予5μg含氫氧化鋁佐劑的RSV-F亞基蛋白。組6為原初對(duì)照（2只動(dòng)物）。在第14天、35天和49天收集血清用于抗體分析。F特異性血清IgGGMT為：天數(shù)123456148224631789117112935351538341812560513718738095以下為在第35天的F特異性IgG1和IgG2a效價(jià)(GMT)：IgG12345IgG19462384836828878604IgG2a538677064590841443724以下是在第35天和第49天RSV血清中和抗體效價(jià)（數(shù)據(jù)為2-5只小鼠的收集池中60％空斑減少中和效價(jià)，每組一個(gè)收集池）：天數(shù)12345635<201432032111<2049<20139<20411009<20在第49天收集脾臟用于T細(xì)胞分析。以下是平均凈F特異性細(xì)胞因子陽性T細(xì)胞頻率（CD4+或CD8+），其中只顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著大于0的數(shù)值（對(duì)RSV肽F51-66、F164-178、F309-323特異性的CD4+，或?qū)﹄腇85-93和F249-258特異性的CD8+）：用相同方法使C57BL/6小鼠產(chǎn)生免疫，但第7組接受VRP（1x106IU），該VRP表達(dá)RSV的全長(zhǎng)野生型表面融合糖蛋白（刪除融合肽）。在第14天、35天和49天收集血清用于抗體分析。F特異性IgG效價(jià)（GMT）為：天數(shù)123456714114021331026304529755110135172155323184952539251512139以下為在第35天的F特異性IgG1和IgG2a效價(jià)(GMT)：IgG123456IgG166247144685625879IgG2a21707685505515733514229以下是在第35天和第49天的RSV血清中和抗體效價(jià)（數(shù)據(jù)為2-5只小鼠的收集池中60％空斑減少中和效價(jià)，每組一個(gè)收集池）：天數(shù)123456735<2027293628<20<2049<2044303633<2037在第49天收集脾臟用于T細(xì)胞分析。以下是平均凈F特異性細(xì)胞因子陽性T細(xì)胞頻率（CD8+），其中只顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性大于0的數(shù)值（對(duì)RSV肽F85-93和F249-258特異性）：用相同方法使9組C3H/HeN小鼠產(chǎn)生免疫。F特異性IgG效價(jià)（GMT）為：天數(shù)12345671452049166629835195806351522775419008342462297517249以下為在第35天的F特異性IgG1和IgG2a效價(jià)(GMT)：IgG123456IgG15132317013683114189IgG2a3021369417842415667380072727以下是第35天和49天的RSV血清中和抗體效價(jià)：天數(shù)123456735<20539260101443<2059549<20456296821148<20387因此在三種不同的近交小鼠系中測(cè)試不同脂質(zhì)（RV01和RV05；pKa5.8和5.85）。對(duì)于BALB/c和C3H系，RV05不及RV01有效，但其在B6系中更有效。然而在所有情況下，所述脂質(zhì)體比兩種平行測(cè)試中的陽離子納米乳液更有效。棉鼠也用由以下物質(zhì)形成的脂質(zhì)體在棉鼠中測(cè)試vA142復(fù)制子：(a)40%DlinDMA、10%DPSC、48%膽固醇和2%PEGDMG2000。(b)40%RV05、30%DLoPE(18:2PE)、28%膽固醇和2%PEGDMG2000。使用以下物質(zhì)在第0天和第21天對(duì)棉鼠（每組4-8只動(dòng)物）肌內(nèi)接種疫苗（每條腿100μL）：組1配制在脂質(zhì)體（a）中的自復(fù)制RNA（vA142，0.1μg，RSV-F）組2配制在脂質(zhì)體（b）中的自復(fù)制RNA（vA142，0.1μg，RSV-F）組3配制在脂質(zhì)體（a）中的自復(fù)制RNA（vA142，1μg，RSV-F）組4配制在脂質(zhì)體（b）中的自復(fù)制RNA（vA142，1μg，RSV-F）組5表達(dá)RSV全長(zhǎng)野生型表面F糖蛋白的VRP(1x106IU)組6含氫氧化鋁佐劑的RSV-F亞單位蛋白疫苗(5μg)組7原初對(duì)照(3只動(dòng)物)在第49天(第二次接種疫苗4周后)用5μgF亞單位和氫氧化鋁對(duì)所有棉鼠(除了組7)接種疫苗。在第0天、21天、35天、49天、64天收集血清用于抗體分析。以下是F特異性血清IgG效價(jià)(GMT)。組第21天第35天第49天第64天111214039431512324910085131530835583938238316563434232072151244945155574484023257776842581297547768291175555以下是RSV血清中和抗體效價(jià)：組第21天第35天第49天第64天1261625817722273711632449366788306161475448201573351372879102919206307257011242897710--10因此用vA142復(fù)制子對(duì)棉鼠接種疫苗，該復(fù)制子以RV01或RV05配制并以兩個(gè)劑量給予(1．0和0．1μg)。在第一次接種復(fù)制子疫苗后，采用RV01的F特異性血清IgG效價(jià)高于采用RV05的所述效價(jià)，但中和效價(jià)大約相同。在第21天通過同源的第二次疫苗接種加強(qiáng)所有組的效價(jià)。第二次復(fù)制子接種后，采用RV01的F特異性血清IgG效價(jià)還是高于采用RV05的所述效價(jià)，且RSV中和效價(jià)通常跟隨該相同趨勢(shì)。在先前接種蛋白質(zhì)的棉鼠中，在第49天接種蛋白沒有加強(qiáng)抗體效價(jià)，但先前以RNA接種疫苗的棉鼠中的效價(jià)有較大增強(qiáng)。采用RV05在第64天的效價(jià)（總IgG和中和效力）高于采用RV01的所述效價(jià)。含vA317RSV復(fù)制子的不同陽離子脂質(zhì)其它實(shí)驗(yàn)比較了四種不同陽離子脂質(zhì)（RV01、RV02、RV04和RV07）。所有脂質(zhì)含有2%PEG-DMG2000但其余脂質(zhì)組分發(fā)生變化。以下為組分和物理特性：為比較免疫原性，還用相同的組分以相同的比例，但用制造商的非擴(kuò)展方法（但更快），采用RV01制備HT、SUV和MLV脂質(zhì)體。簡(jiǎn)單來說，制備含37mg/mlDLinDMA、12mg/mlDSPC、28mg/ml膽固醇和8mg/mlPEGDMG2000的乙醇母液。在總體積1ml的乙醇中稀釋100μl母液。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀以150毫托壓力于50℃蒸發(fā)乙醇30分鐘制備脂質(zhì)體。通過將該樣品在凍干機(jī)上真空存放過夜來保證殘余乙醇的蒸發(fā)。通過添加1.0mL過濾的去離子蒸餾水使脂質(zhì)膜發(fā)生水合并分散，并將其置于50℃以確保脂質(zhì)進(jìn)入MLV中完全懸浮。從MLV中移除一整份然后用探頭式超聲器超聲處理1秒鐘并在100％功率處理5分鐘以形成SUV。得到的兩種溶液都與復(fù)制子RNA復(fù)合。使用含37mg/mlDLinDMA、12mg/mlDSPC、28mg/ml膽固醇和8mg/mlPEGDMG2000的乙醇母液制備HT脂質(zhì)體。用乙醇將100μl母液稀釋至400μl。在持續(xù)攪拌下將得到的乙醇溶液逐滴加到600μl的pH6.5且含有RNA的10mM檸檬酸緩沖液。使用10,000MWCO透析膜將得到的溶液在4LPBS緩沖液中過夜透析。在第0天和第21天用裸復(fù)制子（1μg）或0.1μg包埋的RNA對(duì)BALB/c小鼠（每組8只）雙側(cè)肌內(nèi)接種疫苗（每條腿50μL）。以下是兩次注射2周后的F特異性血清IgG效價(jià)(GMT)：脂質(zhì)體第14天第35天裸A317RNA111469A183430519B10505681C4304127D7794693E5866424F1212568HT387819982MLV138149480SUV415837526對(duì)于RV07DSPC的缺失導(dǎo)致免疫原性大大降低。用相同的方法測(cè)試其它脂質(zhì)（RV01、RV03、RV08、RV09、RV14）。脂質(zhì)體第14天第35天裸A317RNA35457G242110757H1552I1685J9911921K7610L10821421M146286N27212O469519773脂質(zhì)體N(含DC．膽固醇)表現(xiàn)不佳，甚至低于裸RNA對(duì)照。相比之下，剩余的陽離子脂質(zhì)得到有用的結(jié)果。用不同于脂質(zhì)體G的混合方法(微流體芯片)制備脂質(zhì)體O，并且該較小的脂質(zhì)體得到好于近乎相同包埋的結(jié)果。用相同的方法測(cè)試其它脂質(zhì)(RV01、RV10、RV11、RV15)。脂質(zhì)體第14天第35天裸A317RNA185982P278727416Q24161R6331715S4052733T7612459除了脂質(zhì)體Q，這些脂質(zhì)體中每種都表現(xiàn)優(yōu)于對(duì)照。脂質(zhì)體Q中的RV10脂質(zhì)的pKa為7.86，該值在體內(nèi)似乎過高而無用。然而即使在有用的pKa值范圍內(nèi)，雖然結(jié)果很好，具有一個(gè)烷基尾部和一個(gè)含類固醇的尾部的脂質(zhì)體得到的結(jié)果都沒有RV01好。用RV05制備其它脂質(zhì)體。所有脂質(zhì)體含有40%RV05和2%PEG化脂質(zhì)，但剩余組分可變化（雖然總是包含膽固醇）。物理特性是：αGC=α-半乳糖基神經(jīng)酰胺如前測(cè)試BALB/c小鼠：注射第14天第35天裸RNA321915U551955V3422531W11273881X3641741Y5675679Z12515303對(duì)于具有不對(duì)稱脂質(zhì)尾部（烷基和膽固醇）的陽離子脂質(zhì)，將中性脂質(zhì)從DSPC（飽和C18脂質(zhì)尾部）變?yōu)?8:2或18:3PC（每個(gè)尾部具有2和3個(gè)不飽和的雙鍵）提高總IgG效價(jià)。用DPyPE代替DSPC觀察到的結(jié)果相當(dāng)。在采用RV05脂質(zhì)的最終實(shí)驗(yàn)中，用40%RV05、10%18:2PC、40%DPyPE、8%膽固醇和2%PEGDMG2000制備脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體具有124.7nm的Zav直徑、0.17的pdI和61.5％的RNA包埋。這些脂質(zhì)體如前用于接種BALB/c小鼠(0.1μgRNA的劑量），與裸RNA(1μg)或基于RV01的脂質(zhì)體(40%DlinDMA、10%DPSC、48%膽固醇、2%PEGDMG2000)做比較。以下是F特異性血清IgG效價(jià)(GMT)。組第14天第35天裸RNA28721RV01223712407RV057031732因此該RV05脂質(zhì)體免疫原性強(qiáng)于裸RNA，但低于RV01脂質(zhì)體。在第49天收集脾臟用于T細(xì)胞分析。以下是平均凈F特異性細(xì)胞因子陽性T細(xì)胞頻率（CD4+或CD8+），其中只顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著大于0的數(shù)值（對(duì)RSV肽F51-66、F164-178、F309-323特異性的CD4+，或?qū)﹄腇85-93和F249-258特異性的CD8+）：因此在T細(xì)胞應(yīng)答方面，RV05得到優(yōu)于RV01的結(jié)果。應(yīng)理解，僅以舉例的方式描述了本發(fā)明，在本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)可對(duì)之進(jìn)行修改。表1：有用的磷脂參考文獻(xiàn)[1]Johanning等(1995)NucleicAcidsRes（《核酸研究》）23:1495-1501.[2]Heyes等(2005)JControlledRelease（《釋控雜志》）107:276-87.[3]WO2005/121348.[4]Liposomes:MethodsandProtocols（《脂質(zhì)體:方法與方案》）卷1:PharmaceuticalNanocarriers:MethodsandProtocols（《納米載體：方法與方案》）(Weissig編).胡馬納出版社,2009.ISBN160327359X.[5]LiposomeTechnology（《脂質(zhì)體技術(shù)》）,卷I、II和III.(Gregoriadis編).西文健康出版商（InformaHealthcare）,2006.[6]FunctionalPolymerColloidsandMicroparticles（《功能性聚合物膠體和微粒》）卷4，Microspheres,microcapsules&liposomes（《微球脂、微膠囊和脂質(zhì)體》）(Arshady和Guyot編).辭塔斯圖書公司（CitusBooks）,2002.[7]Jeffs等(2005)PharmaceuticalResearch（《藥物學(xué)研究》）22(3):362-372.[8]WO2011/076807.[9]Tarwadi等(2008)BioconjugateChem.（《生物共軛化學(xué)》）19:940-950.[10]WO2005/113782.[11]WO2011/005799.[12]ElOuahabi等(1996)FEBSLetts（《FEBS通信》）380:108-12.[13]Giuliani等(2006)ProcNatlAcadSciUSA(《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》)103(29):10834-9.[14]WO2009/016515.[15]WO02/34771.[16]WO2005/032582.[17]WO2010/119343.[18]WO2006/110413.[19]WO2005/111066.[20]WO2005/002619.[21]WO2006/138004.[22]WO2009/109860.[23]WO02/02606.[24]WO03/018054.[25]WO2006/091517.[26]WO2008/020330.[27]WO2006/089264.[28]WO2009/104092.[29]WO2009/031043.[30]WO2007/049155.[31]Gennaro(2000)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy（《雷明登:藥物科學(xué)和實(shí)踐》），20版，ISBN:0683306472.[32]MethodsInEnzymology(《酶學(xué)方法》)(S.Colowick和N.Kaplan編,學(xué)術(shù)出版社有限公司（AcademicPress,Inc.）)[33]HandbookofExperi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