本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種促進(jìn)哺乳動(dòng)物腸道發(fā)育的方法。
背景技術(shù)：
：哺乳動(dòng)物的腸道發(fā)育情況可以在一定程度上影響動(dòng)物的生長(zhǎng)特性和性狀，例如，提高仔豬在哺乳期的腸道發(fā)育，可以促進(jìn)仔豬對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和利用，進(jìn)而提高仔豬在哺乳期的生長(zhǎng)發(fā)育，使仔豬在斷奶時(shí)具有更高的體重，斷奶時(shí)體重較高的仔豬生長(zhǎng)速度比體重輕的仔豬要快，會(huì)更早地達(dá)到上市體重，縮短圈養(yǎng)時(shí)間，降低飼養(yǎng)成本。在哺乳動(dòng)物中，胰高血糖素-2(glucagon-likepeptide2，GLP-2)是以胰高血糖素原基因?yàn)槟０?，在腸道L細(xì)胞和中樞神經(jīng)元中經(jīng)過單鏈mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯后處理加工的33個(gè)氨基酸組成的保守多肽。GLP-2最顯著的功能是作為腸上皮特異性生長(zhǎng)因子，可以通過促進(jìn)隱窩細(xì)胞增殖和抑制隱窩細(xì)胞凋亡來(lái)達(dá)到促進(jìn)絨毛擴(kuò)張的效果，GLP-2還可以通過促進(jìn)麥芽糖酶-葡糖淀粉酶、蔗糖酶-異麥芽糖酶、鈉依賴性的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1、和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2的基因表達(dá)和蛋白活性來(lái)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)的吸收。二肽基肽酶-IV(diepeptidylpeptidase-IV，DPP-IV)DPP-IV是一種廣泛存在的位于細(xì)胞表面的絲氨酸肽酶(serinepeptidase)，活性狀態(tài)的GLP-2分泌之后很快會(huì)被DPP-IV切割N端的組氨酸和丙氨酸從而失去活性變成非活性狀態(tài)。因此有必要開發(fā)一種促進(jìn)哺乳動(dòng)物腸道發(fā)育的方法，通過降低二肽基肽酶對(duì)GLP-2的抑制作用，增加腸道內(nèi)GLP-2的含量，從而對(duì)哺 乳動(dòng)物的腸道發(fā)育進(jìn)行改善，提供一種改變動(dòng)物體的生長(zhǎng)特性的畜牧業(yè)生產(chǎn)方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于開發(fā)一種促進(jìn)哺乳動(dòng)物腸道發(fā)育的方法。為達(dá)到以上目的，本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)二肽基肽酶-IV(diepeptidylpeptidase-IV，DPP-IV)的性質(zhì)和活性進(jìn)行了深入的研究，希望找到一種二肽基肽酶-IV的抑制方法，DPP-IV蛋白在腸道和血液中具有相對(duì)較高的含量。本發(fā)明的發(fā)明人通過大量分析研究發(fā)現(xiàn)，在乳蛋白的序列中含有大量的多肽序列與具有DPP-IV抑制作用的序列相吻合。因此想到利用乳蛋白的水解產(chǎn)物對(duì)DPP-IV的活性進(jìn)行抑制。為了證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的發(fā)明人用胃蛋白酶處理牛乳清蛋白的四種主要成分，即牛α-乳清白蛋白，牛β-乳球蛋白，牛血清白蛋白和牛乳鐵蛋白，發(fā)現(xiàn)上述四種蛋白的水解產(chǎn)物均可以在體外抑制DPP-IV的酶切活性，其中α-乳清白蛋白(α-LA)的水解產(chǎn)物具有最高的抑制效率?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種促進(jìn)哺乳動(dòng)物腸道發(fā)育的方法，所述方法包括，利用α-乳清白蛋白的水解產(chǎn)物抑制二肽基肽酶-IV的酶切活性?？蛇x的，所述水解產(chǎn)物為利用蛋白酶對(duì)α-乳清白蛋白進(jìn)行水解獲得的，所述蛋白酶為胃蛋白酶或胰蛋白酶?？蛇x的，所述蛋白酶為胃蛋白酶?？蛇x的，所述水解產(chǎn)物是利用哺乳動(dòng)物胃液或腸液對(duì)α-乳清白蛋白進(jìn)行水解所獲得的水解產(chǎn)物。可選的，所述方法包括：將所述水解產(chǎn)物在36-38℃，pH為8.0-8.4的條件下與二肽基肽酶-IV接觸?？蛇x的，相對(duì)于1ng的二肽基肽酶-IV，所述水解產(chǎn)物的用量為50μg-150μg?？蛇x的，其特征在于，所述α-乳清白蛋白為人α-乳清白蛋白。本發(fā)明的一個(gè)方面還提供了所述促進(jìn)哺乳動(dòng)物腸道發(fā)育的方法在抑制二肽基肽酶-IV的酶切活性中的應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)方面還提供了所述促進(jìn)哺乳動(dòng)物腸道發(fā)育的方法在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的方法通過利用α-乳清白蛋白的水解產(chǎn)物特別是人α-乳清白蛋白的水解產(chǎn)物抑制DPP-IV的酶的外切活性減少了DPP-IV對(duì)GLP-2的切割作用，從而提高了GLP-2的半衰期，能夠達(dá)到促進(jìn)動(dòng)物腸道發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)吸收的目的。附圖說(shuō)明圖1為人α-乳清白蛋白和人乳鐵蛋白在體外模擬胃腸道中的消化情況；其中，A為模擬胃液消化產(chǎn)物；B為模擬腸液消化產(chǎn)物；M:購(gòu)自NEB公司的彩色蛋白預(yù)染Marker(7-175kD)；1：人α-乳清白蛋白；2：人α-乳清白蛋白水解產(chǎn)物；3：人乳鐵蛋白；4：人乳鐵蛋白水解產(chǎn)物。圖2為rHLA和rHLF在模擬胃腸道消化之后的水解產(chǎn)物對(duì)DPP-IV酶活性的抑制效率；A：rHLA和rHLF經(jīng)過模擬胃液消化之后的水解產(chǎn)物對(duì)DPP-IV酶活性的抑制效率；B:rHLA和rHLF經(jīng)過模擬腸液消化之后的水解產(chǎn)物對(duì)DPP-IV酶活性的抑制效率；數(shù)值為最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；實(shí)驗(yàn)重復(fù)了2次。圖3為轉(zhuǎn)基因克隆豬和非轉(zhuǎn)基因豬飼喂的仔豬在哺乳期中不同時(shí)間的血液中DPP-IV的酶活性；將轉(zhuǎn)基因克隆豬和非轉(zhuǎn)基因豬飼喂的仔豬在出生后的7天，14天和21天時(shí)，在進(jìn)食1小時(shí)后采集血樣，離心得到血清后檢測(cè)DPP-IV的酶活。**，p＜0.01具有顯著差異，***，p<0.001，具有極顯著差異。圖4為轉(zhuǎn)基因克隆豬和非轉(zhuǎn)基因豬飼喂的仔豬在哺乳期結(jié)束后腸道組織中DPP-IV的酶活轉(zhuǎn)基因豬和非轉(zhuǎn)基因豬飼喂的仔豬在哺乳期結(jié)束時(shí)對(duì)仔豬進(jìn)行屠宰，采集十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸和直腸的組織樣品檢測(cè)DPP-IV的酶活性，*,p＜0.05,具有顯著差異，**,p＜0.01,具有極顯著差異。圖5為轉(zhuǎn)基因克隆豬和非轉(zhuǎn)基因豬飼喂的仔豬在哺乳期結(jié)束時(shí)的腸道長(zhǎng)度轉(zhuǎn)基因豬和非轉(zhuǎn)基因豬飼喂的仔豬在哺乳期結(jié)束時(shí)對(duì)仔豬進(jìn)行屠宰，將小腸，結(jié)腸和直腸分離并測(cè)量長(zhǎng)度，*,p＜0.05,具有顯著差異。具體實(shí)施方式下面將通過具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明提供了一種促進(jìn)哺乳動(dòng)物腸道發(fā)育的方法，所述方法包括，利用α-乳清白蛋白的水解產(chǎn)物抑制二肽基肽酶-IV的酶切活性。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述水解產(chǎn)物為利用蛋白酶對(duì)α-乳清白蛋白進(jìn)行水解獲得的，所述蛋白酶為胃蛋白酶或胰蛋白酶。優(yōu)選的情況下，所述蛋白酶為胃蛋白酶。本發(fā)明所提供的方法中，對(duì)于蛋白酶的添加量沒有特別的限制，只要能夠使得α-乳清白蛋白充分水解獲得水解產(chǎn)物即可，優(yōu)選的，相對(duì)于100ng的α-乳清白蛋白，所述蛋白酶的添加量為4ng。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述水解產(chǎn)物是利用哺乳動(dòng)物胃液或腸液對(duì)α-乳清白蛋白進(jìn)行水解所獲得的水解產(chǎn)物。其中，所述胃液既包括獲得自哺乳動(dòng)物胃部的胃液，也包括通過人工模擬方式獲得的與哺乳動(dòng)物胃液成分、酸堿度接近或一致的 含有胃蛋白酶的模擬胃液，本發(fā)明中，pH為1.2，100mL模擬胃液中的胃蛋白酶的添加量按照以下公式1計(jì)算：公式1：A=5×10619×B]]>A—胃蛋白酶添加量，單位為毫克(mg)；B—胃蛋白酶活力，單位為單位活力每毫克(U/mg)；所述腸液、既包括獲得自哺乳動(dòng)物腸部的腸液，也包括通過人工模擬方式獲得的與哺乳動(dòng)物腸液成分、酸堿度接近或一致的含有胰蛋白酶的模擬腸液。在本發(fā)明中，所使用的胰蛋白酶(pancreatin)應(yīng)滿足40℃5min內(nèi)，能將其質(zhì)量的25倍的淀粉轉(zhuǎn)化為水溶性的碳水化合物；40℃60min內(nèi)(pH7.5)，消化掉其質(zhì)量的25倍的酪蛋白；37℃(pH9.0)，每毫克胰酶每分鐘能夠從橄欖油中至少水解生成2μmol脂肪酸。本發(fā)明所提供的方法中，對(duì)于哺乳動(dòng)物胃液、腸液的添加量沒有特別的限制，只要在不過量的情況下能夠使得α-乳清白蛋白充分水解獲得水解產(chǎn)物即可，優(yōu)選的，相對(duì)于100ng的α-乳清白蛋白，所述哺乳動(dòng)物腸液的總添加量為4ng。本發(fā)明中，對(duì)α-乳清白蛋白的水解的條件只要滿足所使用的胃蛋白酶、胰蛋白酶、胃液、腸液的水解反應(yīng)條件即可。本發(fā)明中，所述哺乳動(dòng)物胃液和腸液可以為任何年齡段哺乳動(dòng)物的胃液和腸液，優(yōu)選的情況下，所述哺乳動(dòng)物胃液和腸液為發(fā)育成熟的哺乳動(dòng)物的胃液或腸液。本發(fā)明中所述的胃液為胃內(nèi)分泌物的總稱。包括水、電解質(zhì)、脂類、蛋白質(zhì)和多肽激素。純凈胃液為無(wú)色透明液體，pH0.9～1.5，比重為1.006～1.009，每日分泌量為1.5～2.5升，含固體物約0.3～0.5％，無(wú)機(jī)物主要為Na+、K+、H+和Cl-，有機(jī)物為胃粘膜層各種不 同上皮細(xì)胞分泌額胃蛋白酶原、粘液蛋白和“內(nèi)因子”。腸液：由腸腺和上皮細(xì)胞分泌的，離心處理時(shí)黃色透明，堿性(pH7.7)，比重在1.007上下，大部分為水分，含NaCl0.58—0.67％，碳酸鈉0.22％，含有磷蛋白性粘液。這個(gè)腸液是消化食物的酶，含有氨肽酶、蔗糖酶、乳糖酶、麥牙糖酶、核酸分解酶以及卵磷脂酶等，此外也含有磷酸酯酶。所述哺乳動(dòng)物可以為人類、豬、?；蜓颍瑑?yōu)選的所述哺乳動(dòng)物為豬或人類。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法包括：將所述水解產(chǎn)物在36-38℃，pH8.0-8.4，的條件下與二肽基肽酶-IV接觸。優(yōu)選的，接觸過程在0.1MTris-HCl緩沖液中進(jìn)行。本發(fā)明中，對(duì)于接觸的方式?jīng)]有特別的限制，只要能夠使得二者混合均勻、水解充分進(jìn)行即可，可選的，在接觸的過程中可以在恒溫箱中對(duì)混合物進(jìn)行攪拌，接觸的時(shí)間可以為45-70min，當(dāng)接觸的時(shí)間為50-60分鐘時(shí)，獲得的水解產(chǎn)物對(duì)DPP-IV的抑制效率最高。在本發(fā)明中，所述含有α-乳清白蛋白的底物包括含有α-乳清白蛋白的動(dòng)物乳汁或含有α-乳清白蛋白的水溶液。本發(fā)明所述的含有α-乳清白蛋白的底物還包括含有α-乳清白蛋白的制劑，所述制劑包括但不限于動(dòng)物飼料、保健食品、添加劑、蛋白粉、乳制品等。在本發(fā)明所提供的方法中，相對(duì)于1ng的二肽基肽酶-IV，所述水解產(chǎn)物的用量為50μg-150μg，優(yōu)選的，相對(duì)于1ng的二肽基肽酶-IV，所述蛋白酶水解產(chǎn)物的用量為80μg-120μg，特別優(yōu)選的，所述水解產(chǎn)物的用量為100μg。本發(fā)明所提供的α-乳清白蛋白包括但不限于牛α-乳清白蛋白、豬α-乳清白蛋白和人α-乳清白蛋白，當(dāng)所述α-乳清白蛋白為人α-乳清白蛋白時(shí)，所獲得的抑制DPP-IV的效果最好。本發(fā)明中，所述的人α-乳清白蛋白基因基因位于第十二號(hào)染色體短臂上(Daviesetal.,1987)，編碼區(qū)的全長(zhǎng)為2363bp，包括四個(gè)外顯子和三個(gè)內(nèi)含子。本發(fā)明還提供了所述促進(jìn)哺乳動(dòng)物腸道發(fā)育的方法在促進(jìn)哺乳動(dòng)物腸道發(fā)育中的應(yīng)用。下面通過實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，在以下實(shí)施例中：胃蛋白酶、胰蛋白酶、Gly-Prop-nitroanilidehydrochloride為Sigma公司產(chǎn)品；人α-乳清白蛋白(humanα-lactalbumin，rHLA)和人乳鐵蛋白(humanlactoferrin，rHLF)由北京濟(jì)福霖生物技術(shù)公司提供。實(shí)施例1在體外對(duì)人α-乳清白蛋白和乳鐵蛋白進(jìn)行模擬胃腸道消化(1)按照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品食用安全檢測(cè)模擬胃腸液外源蛋白質(zhì)消化穩(wěn)定性試驗(yàn)方法》配置模擬胃液和腸液。(2)分別取1.5g人α-乳清白蛋白和乳鐵蛋白，溶于10ml水溶液中，并且每種蛋白溶液分別調(diào)節(jié)成pH1.2和pH7.5兩種類型，按照酶和底物的比例為4：100加入模擬消化液(胃液和腸液)和蛋白水溶液，之后放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)1小時(shí)；吸取500μL樣品用于SDS-PAGE檢測(cè)水解程度；將模擬腸液的消化液pH使用0.2MNaOH調(diào)節(jié)為9.5使酶失活；上述消化液以12100g離心10min(25℃)，收集上清液進(jìn)行冷凍干燥。(3)將4種消化液(人α-乳清白蛋白的胃液消化液、人α-乳清白蛋白的腸液消化液、乳鐵蛋白的胃液消化液、乳鐵蛋白的)分別和5×變性上樣緩沖液等體積混合，上樣；連接電源，開始電壓設(shè)置為60V，待溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠后，提高電壓至110V，至預(yù)染Marker 中最小的的條帶跑到底部，將凝膠從膠板中取出，用蒸餾水漂洗后，放入考馬斯亮藍(lán)染色液中，將微波爐調(diào)至最大功率，加熱凝膠和染色液1min，重復(fù)一次，最后轉(zhuǎn)到搖床，溫和搖動(dòng)，染色6-8h；用蒸餾水漂洗染色后的凝膠，加入脫色液，置于搖床上，溫和搖動(dòng)，脫色至背景清晰，進(jìn)行拍照和分析，結(jié)果如圖1A所示，人α-乳清白蛋白和乳鐵蛋白的消化性良好。實(shí)施例2人-α-乳清白蛋白水解產(chǎn)物對(duì)DPP-IV酶活的抑制(1)將實(shí)施例1中獲得的冷凍干燥后的水解產(chǎn)物使用0.1MTris-HCl(pH8.0)分別稀釋成終濃度為6mg/mL，2mg/mL和0.2mg/mL的溶液，反應(yīng)緩沖液為0.1MTris-HCl(pH8.0)。DPP-IV酶活檢測(cè)反應(yīng)體系見表1(單位μL)表1分組底物DPP-IV提取物水解產(chǎn)物反應(yīng)緩沖液實(shí)驗(yàn)組76.162561.84實(shí)驗(yàn)組對(duì)照7—2568酶活性組76.16—86.84酶對(duì)照組7——93(2)在96孔板中，先加入底物，水解產(chǎn)物和反應(yīng)緩沖液，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中10分鐘，之后加入DPP-IV提取物，將反應(yīng)體系放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)10分鐘；加入25％的冰醋酸使反應(yīng)停止，在分光光度計(jì)的405nm波長(zhǎng)讀取數(shù)據(jù)作為酶活指標(biāo)，結(jié)果如圖2A和2B所示，人α-乳清白蛋白和乳鐵蛋白的模擬胃液和模擬腸液的消化產(chǎn)物均對(duì)DPP-IV酶活具有抑制作用。實(shí)施例3以轉(zhuǎn)基因克隆豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)體內(nèi)的DPP-IV酶活。(1)以乳腺表達(dá)人α-乳清白蛋白的轉(zhuǎn)基因克隆長(zhǎng)白豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)基因克隆豬乳中人α-乳清白蛋白的平均表達(dá)量為2567.0±1276.39μg/ml，轉(zhuǎn)基因克隆豬與非轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)白母豬一起 配種，之后檢測(cè)受孕的母豬用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。分娩之后，母豬和出生的仔豬要仔細(xì)護(hù)理；在分娩后的24小時(shí)內(nèi)，確保每窩仔豬的數(shù)量為6只。仔豬的哺乳期為21天，在這期間，豬乳是仔豬唯一的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，所有仔豬自由飲水。(2)哺乳期的第7、14和21天，在仔豬進(jìn)食1小時(shí)后，對(duì)仔豬進(jìn)行前腔靜脈采血0.5ml，3000g離心10min得到血清，儲(chǔ)存于-80℃，用于檢測(cè)DPP-IV酶活。(3)在仔豬出生后的第22天，對(duì)其進(jìn)行屠宰，將小腸和大腸分離出來(lái)，測(cè)量其長(zhǎng)度(結(jié)果如圖5所示，實(shí)驗(yàn)組仔豬的小腸，結(jié)腸和直腸長(zhǎng)度要長(zhǎng)于對(duì)照組)，之后采集十二指腸，空腸，回腸，結(jié)腸和直腸的組織樣品，儲(chǔ)存于-80℃，用于提取蛋白，檢測(cè)DPP-IV酶活。(4)取組織樣，按照每20毫克組織加入150-250μlNP-40裂解液的比例加入裂解液。勻漿器1500g，5分鐘，重復(fù)3次；充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清；使用BCA法測(cè)量蛋白濃度。(5)對(duì)血清樣品和腸道蛋白樣品進(jìn)行DPP-IV酶活檢測(cè)。反應(yīng)體系中血清樣品上樣量10μL，組織樣蛋白樣品上樣量為100μg，反應(yīng)體系如表2和表3所示：表2分組底物血清樣品反應(yīng)緩沖液實(shí)驗(yàn)組7μL10μL83μL實(shí)驗(yàn)組對(duì)照—10μL90μL表3分組底物組織樣反應(yīng)緩沖液實(shí)驗(yàn)組7μL100μg適量實(shí)驗(yàn)組對(duì)照—100μg適量在96孔板中，先加入樣品和反應(yīng)緩沖液，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中10分鐘，再加入底物，將反應(yīng)體系放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)10分鐘；加入25％的冰醋酸是反應(yīng)停止，在分光光度計(jì)的405nm波長(zhǎng)讀 取數(shù)據(jù)作為酶活指標(biāo)(結(jié)果如圖3和4所示)，實(shí)驗(yàn)組仔豬在第14天和21天的血液中DPP-IV酶活要低于對(duì)照組，同時(shí)第22天中，實(shí)驗(yàn)組的空腸，回腸，結(jié)腸和直腸中的DPP-IV酶活也低于對(duì)照組。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3