本發(fā)明涉及短管兔耳草提取物其制備方法和應(yīng)用、含其的皮膚外用劑。

背景技術(shù)：

1956年Harman提出了自由基衰老學(xué)說[Harman,D.Aging:A theory based on free radical and radiation chemistry.J.Gerontol.1956,11:289-300.]，認(rèn)為過多的自由基是造成生物老化的重要原因。根據(jù)這一理論，體內(nèi)過量的活性氧自由基與不飽和脂肪酸作用產(chǎn)生丙二醛等物質(zhì)，丙二醛將與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)等作用生產(chǎn)褐色素，沉淀于皮膚便成為各種色斑。過量的自由基還能使皮膚內(nèi)的膠原纖維、彈性纖維發(fā)生交聯(lián)和變性、變脆、失去彈性，當(dāng)皮膚水分不足時(shí)，容易使彈性纖維斷裂，出現(xiàn)暗紋、細(xì)紋、皺紋等皮膚老化現(xiàn)象。此外，環(huán)境中的離子輻射以及諸如空氣污染與化學(xué)物質(zhì)等的環(huán)境污染物，也會(huì)使生物體內(nèi)不斷的產(chǎn)生自由基。例如環(huán)境中的紫外線會(huì)使皮膚真皮中的纖維母細(xì)胞及線粒體受到刺激，進(jìn)而釋放出超氧陰離子，而過量的超氧陰離子則會(huì)轉(zhuǎn)換成其它破壞性更強(qiáng)的自由基。雖然人體內(nèi)具有能夠維持氧化與抗氧化之間平衡狀態(tài)的抗氧化防御系統(tǒng)，用以減緩活性氧及自由基的產(chǎn)生，但若是長期過度的曝曬在陽光下，則人體內(nèi)大量產(chǎn)生的自由基會(huì)導(dǎo)致皮膚的抗氧化防御能力降低，造成皮膚的傷害，例如光老化、表皮皺紋、皮膚免疫力失調(diào)等?？寡趸瘎┦蔷哂胁蹲阶杂苫芰Φ奈镔|(zhì)，可以清除皮膚中的活性自由基，減輕自由基引起的皮膚氧化應(yīng)激損傷，從而改善由氧化應(yīng)激等造成的皮膚老化。目前已知有維生素E、維生素C等生物體內(nèi)的清除自由基型抗氧化劑，另外也報(bào)道了植物來源的抗氧化劑如蓮花、梅果提取物等(專利文獻(xiàn)CN201110158540含有蓮花提取物和烏梅提取物作為有效成分而具有抗氧化活性的皮膚外用劑組合物)。

關(guān)于皮膚黑色素的形成，目前研究表明主要是由于黑素細(xì)胞內(nèi)的生物化 學(xué)反應(yīng)引起，即酪氨酸在作為催化劑的酪氨酸酶的作用下，生成多巴醌，再通過酶的催化作用或非酶的氧化作用形成黑色素。關(guān)于抑制上述黑色素生成的美白活性物，通常以抑制酪氨酸酶活性為主要靶點(diǎn)。來源于植物提取物的酪氨酸酶抑制劑作為潛在的美白活性物，同時(shí)又具有安全性和對(duì)皮膚低刺激性的預(yù)期，目前已有各種開發(fā)的報(bào)道(專利文獻(xiàn)CN201310411195白蘞提取物美白功效的檢測(cè)方法；CN201310382406白木香果皮提取物在制備美白化妝品中的應(yīng)用)。

皮膚膠原約占干燥皮膚重量的75％，是皮膚細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，起著皮膚結(jié)構(gòu)的支撐體功能，并提供皮膚的抗拉和彈力等重要功能。正常皮膚中膠原的生成和分解在生物調(diào)節(jié)作用下處于平衡狀態(tài)，隨著年齡增長，以及紫外線輻射等環(huán)境因素引起生物調(diào)節(jié)功能減弱，膠原的分解作用大于生成作用時(shí)，皮膚中膠原含量的下降，皮膚相應(yīng)出現(xiàn)彈力減少、皺紋產(chǎn)生等皮膚老化現(xiàn)象。而通過合適的植物提取物調(diào)節(jié)膠原蛋白的生成，或者適當(dāng)增加可以產(chǎn)生的膠原蛋白的成纖維細(xì)胞的數(shù)量，就可以期待會(huì)對(duì)皮膚老化的現(xiàn)象有所改善，目前已有報(bào)道紅杉新芽、越桔新芽等來自植物提取物的抑制皮膚老化成分具有類似的改善皮膚老化機(jī)理(專利文獻(xiàn)CN200980106591.8含有植物的新芽提取物的用于抑制皮膚老化的組合物)。

短管兔耳草Lagotis brevituba Maxim是玄參科兔耳草屬植物，生于海拔3000～4850米的高山草甸及倒石堆、碎石帶上。主要分布于青海、西藏、甘肅等省區(qū)。全草入藥，具退熱、降血壓、調(diào)經(jīng)解毒之功效；治療全身發(fā)熱、腎炎、肺病、陰道流黃黑色液物、濕熱瀉痢、高血壓病、動(dòng)脈粥樣硬化癥、月經(jīng)不調(diào)、治癆熱咳嗽、霍亂、傷寒、黃疸、目赤、綜合性毒物中毒及“心熱”等疾病，《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥》(第1冊(cè))載入的兔耳草(藏名洪連)為玄參科植物短管兔耳草Lagotis brevituba Maxim(藏名紅林)或全緣兔耳草L.integra W.Smith(藏名洪連)的干燥全草。性味苦、甘、寒。具清熱解毒，行血調(diào)經(jīng)之功能。全身發(fā)熱、腎炎、肺病、高血壓病、動(dòng)脈粥樣硬化、月經(jīng)不調(diào)、綜合性毒物中毒及“心熱”癥。

史高峰等對(duì)短管兔耳草的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)的分析和研究，從中分離鑒定了5個(gè)已知化合物，分別為β-谷甾醇(β-sitosterol)，軟脂酸單甘油脂(palmitic monloglycerol ester)，琥珀酸(succinicacid)，木犀草素(luteolin)，木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷(luteolin-7-O-β-D-glucoside)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示短管兔耳草水提物對(duì)大鼠血清性關(guān)節(jié)腫有明顯的抑制作用，對(duì)大鼠頭部急性充血性水腫(急性炎癥)有顯著的抑制作用。短管兔耳草對(duì)大鼠甲醛性關(guān)節(jié)炎(亞急性炎癥)有明顯地預(yù)防作用；另有研究顯示短管兔耳草的總提取物對(duì)P388抑制率實(shí)驗(yàn)和小白鼠抗癌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)短管兔耳草具有一定的抗腫瘤作用。此外，青海省藥品檢驗(yàn)藥物研究所的姜平、楊娜等在1984年對(duì)大鼠進(jìn)行了胃潰瘍、鎮(zhèn)靜和毒性實(shí)驗(yàn)，將其分為短管兔耳草實(shí)驗(yàn)組、鹽水對(duì)照組和胃膜素對(duì)照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以潰瘍面積和潰瘍?nèi)莘e為指標(biāo)，短管兔耳草與鹽水對(duì)照組比較，有顯著差異，說明短管兔耳草水提物對(duì)大鼠慢性胃潰瘍的愈合有明顯的促進(jìn)作用，且較胃膜素對(duì)照組的療效為優(yōu)。通過鎮(zhèn)靜實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示短管兔耳草水提物可顯著延長戊巴比妥鈉的睡眠時(shí)間，說明其對(duì)小鼠有較好的鎮(zhèn)靜作用。

綜合短管兔耳草近年來的研究進(jìn)展，在其化學(xué)成分、提取分離、藥理活性方面的研究還處于初步研究階段。對(duì)藥效作用部位及作用機(jī)理方面的研究還只是一片空白。鑒于短管兔耳草在藏藥中的廣泛應(yīng)用及其豐富的自然資源，對(duì)短管兔耳草進(jìn)一步的研究及有效合理地開發(fā)利用是十分必要的。尤為重要的是，目前為止，未發(fā)現(xiàn)短管兔耳草在化妝品領(lǐng)域，尤其是抗衰老和美白的用途和報(bào)道。尋找安全有效、抗衰老和美白效果好的皮膚外用劑是目前急需解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中化妝品抗衰老和美白效果差、安全性低等缺陷而提供了短管兔耳草提取物其制備方法和應(yīng)用、含其的皮膚外用劑。本發(fā)明的含短管兔耳草提取物的組合物自由基清除率高、 酪氨酸酶抑制作用顯著、彈性蛋白酶抑制作用顯著、抗氧化和老化效果明顯、同時(shí)表現(xiàn)出優(yōu)良的美白性，并且天然、安全，可用作皮膚外用劑的美白活性成分和抗衰老活性成分。本發(fā)明的皮膚外用劑成分天然、安全，并具有美白、抗氧化和老化的功效，具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

本發(fā)明提供了一種短管兔耳草提取物的制備方法，其采用方法1或方法2：

所述的方法1包括如下步驟：將短管兔耳草粉末與體積濃度為50％～80％的乙醇水溶液形成的混合物，在10℃～35℃下提取0.5小時(shí)～5小時(shí)，固液分離得濾液，濾液脫除溶劑，即得短管兔耳草粗提物；其中，所述的短管兔耳草粉末與所述的乙醇水溶液的質(zhì)量體積比為(1：8)g/mL～(1：15)mg/mL；所述的體積濃度是指乙醇的體積與乙醇水溶液總體積的百分比。

所述的方法2包括如下步驟：將方法1得到的短管兔耳草粗提物，上樣到大孔樹脂填充柱，依次用溶劑Ⅰ、溶劑Ⅱ和溶劑Ⅲ洗脫，分別收集洗脫液，并脫除溶劑后，相應(yīng)地得到溶劑洗脫部位A、溶劑洗脫部位B和溶劑洗脫部位C。所述的溶劑I、所述的溶劑II和所述的溶劑III分別為體積濃度為20％～30％的乙醇水溶液、體積濃度為40％～50％的乙醇水溶液和體積濃度為60％～70％的乙醇水溶液。溶劑I對(duì)應(yīng)溶劑洗脫部位A；溶劑II對(duì)應(yīng)溶劑洗脫部位B；溶劑III對(duì)應(yīng)溶劑洗脫部位C。

方法1中，所述的短管兔耳草(Lagotis brevituba Maxim或者L.integra W.Smith)為玄參科(Scrophulariaceae)兔耳草屬(Lagotis)植物。

方法1中，所述的短管兔耳草粉末的粒度較佳地為20目～60目。

方法1中，所述的提取為本領(lǐng)域中該類操作的常規(guī)方法，較佳地為超聲提取。所述的超聲提取的功率較佳地為500w～1000w。

方法1中，所述的提取的溫度較佳地為20℃～25℃。

方法1中，所述的提取的時(shí)間較佳地為0.5小時(shí)～1小時(shí)。

方法1中，所述的提取的次數(shù)較佳地為1～2次。

方法1中，所述的短管兔耳草粉末與所述的乙醇水溶液的質(zhì)量體積比較 佳地為(1:10)g/mL～(1:15)g/mL，更佳地為(1:10)g/mL～(1:12)g/mL。

方法1中，所述的乙醇的體積濃度較佳地為70％。

方法1中，所述的固液分離的方法為本領(lǐng)域中該類操作的常規(guī)方法，較佳地為過濾、壓濾或離心。

方法1中或方法2中，所述的濾液脫除溶劑的方法為本領(lǐng)域中該類操作的常規(guī)方法，較佳地為減壓旋蒸。所述的減壓旋蒸的操作條件為本領(lǐng)域中該類操作的常規(guī)條件。

方法1中所述的“濾液脫除溶劑”，可以為脫除全部溶劑或者僅脫除乙醇。當(dāng)方法1中所述的“濾液脫除溶劑”為脫除全部溶劑時(shí)，方法2中所述的“將方法1得到的短管兔耳草粗提物，上樣到大孔樹脂填充柱”需要將方法1得到的短管兔耳草粗提物用水溶解后，再上樣到大孔樹脂填充柱。當(dāng)方法1中所述的“濾液脫除溶劑”為僅脫除乙醇時(shí)，得到的短管兔耳草粗提物中含有水，方法2中所述的“將方法1得到的短管兔耳草粗提物，上樣到大孔樹脂填充柱”就可以直接將方法1得到的短管兔耳草粗提物，上樣到大孔樹脂填充柱，而不需要將方法1得到的短管兔耳草粗提物用水溶解后，再上樣到大孔樹脂填充柱。

方法2中，所述的大孔樹脂填充柱為本領(lǐng)域常規(guī)的大孔樹脂填充柱，較佳地為D101、AB-8或ADS-8樹脂填充柱，更佳地為AB-8樹脂填充柱。

方法2中，所述的溶劑Ⅰ較佳地為體積濃度為30％的乙醇。所述的溶劑Ⅱ較佳地為體積濃度為50％的乙醇。所述的溶劑Ⅲ較佳地為體積濃度為70％的乙醇。

方法2中，所述的溶劑Ⅰ、溶劑Ⅱ、溶劑Ⅲ的用量分別較佳地為500mL～800mL。所述的溶劑Ⅰ、溶劑Ⅱ或溶劑Ⅲ的用量可以相同或不同，較佳地所述的溶劑Ⅰ、溶劑Ⅱ或溶劑Ⅲ的用量相同。

方法2中，所述的脫除溶劑的方法為本領(lǐng)域中該類操作的常規(guī)方法，較佳地為減壓旋蒸。所述的減壓旋蒸的操作條件為本領(lǐng)域中該類操作的常規(guī)條件。

本發(fā)明還提供了所述的制備方法制得的短管兔耳草提取物。所述的短管兔耳草提取物包括方法1制得的短管兔耳草粗提物、方法2制得的溶劑洗脫部位A、方法2制得的溶劑洗脫部位B和方法2制得的溶劑洗脫部位C中的一種或多種。所述的短管兔耳草提取物較佳地為方法2制得的溶劑洗脫部位C。

本發(fā)明還提供了所述的短管兔耳草提取物在制備皮膚外用劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明中，所述的短管兔耳草提取物在制備皮膚外用劑時(shí)作為美白活性成分、抗老化活性成分和抗氧化活性成分中的一種或多種，較佳地作為抗氧化活性成分。

本發(fā)明中，所述的皮膚外用劑包括本領(lǐng)域常規(guī)的具備疾病治療用途的藥物，或者不具備疾病治療用途的化妝品。

本發(fā)明還提供了一種包括所述的短管兔耳草提取物的皮膚外用劑。

在不違背本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明的短管兔耳草提取物具有較好的美白、抗老化和抗氧化的功效，有良好的市場(chǎng)化前景。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。

實(shí)施例1以體積濃度為50％的乙醇水溶液為提取溶劑(方法1)

短管兔耳草干燥粉末20g(短管兔耳草粉末的粒度為20目)，室溫下(25℃)下以體積濃度為50％的乙醇水溶液200ml、超聲提取2次，每次30min(功率500W)，取濾液合并，減壓(50℃)回收溶劑至干，取提取物適量，加DMSO(二甲亞砜)配制成0.05mg/ml的溶液備用，測(cè)定其自由基清除作 用，其自由基清除率為15％。

實(shí)施例2以體積濃度為60％的乙醇水溶液為提取溶劑(方法1)

短管兔耳草干燥粉末20g(短管兔耳草粉末的粒度為30目)，室溫(25℃)下以體積濃度為60％的乙醇水溶液200ml、超聲提取2次，每次30min(功率500W)，取濾液合并，減壓(50℃)回收溶劑至干，取提取物適量，加DMSO(二甲亞砜)配制成0.05mg/ml溶液備用，測(cè)定其自由基清除作用，其自由基清除率為17％。

實(shí)施例3以體積濃度為70％的乙醇水溶液為提取溶劑(方法1)

短管兔耳草干燥粉末20g(短管兔耳草粉末的粒度為40目)，室溫(25℃)下以體積濃度為70％的乙醇水溶液200ml、超聲提取2次，每次30min(功率500W)，取濾液合并，減壓(50℃)回收溶劑至干，取提取物適量，加DMSO(二甲亞砜)配制成0.05mg/ml溶液備用，測(cè)定其自由基清除作用，其自由基清除率為48％。

實(shí)施例4以體積濃度為80％的乙醇水溶液為提取溶劑(方法1)

短管兔耳草干燥粉末20g(短管兔耳草粉末的粒度為50目)，室溫(25℃)下以體積濃度為80％乙醇200ml、超聲提取2次，每次30min(500W)，取濾液合并，減壓(50℃)回收溶劑至干，取提取物適量，加DMSO(二甲亞砜)配制成0.05mg/ml溶液備用，測(cè)定其自由基清除作用，其自由基清除率為23％。

實(shí)施例5短管兔耳草與所述的乙醇水溶液的質(zhì)量體積比為(1:8)g/mL進(jìn)行提取

短管兔耳草干燥粉末20g(短管兔耳草粉末的粒度為60目)，室溫(25℃)下以體積濃度為70％的乙醇水溶液160ml、超聲提取2次，每次30min(功率500W)，取濾液合并，減壓(50℃)回收溶劑至干，取提取物適量，加DMSO(二甲亞砜)配制成0.05mg/ml溶液備用，測(cè)定其自由基清除作用，其自由基清除率為28％。

實(shí)施例6短管兔耳草與所述的乙醇水溶液的質(zhì)量體積比為(1:10)g/mL 進(jìn)行提取

短管兔耳草干燥粉末20g(短管兔耳草粉末的粒度為60目)，室溫(25℃)下以體積濃度為70％的乙醇水溶液200ml冷浸、超聲提取2次，每次30min(功率500W)，取濾液合并，減壓(50℃)回收溶劑至干，取提取物適量，加DMSO(二甲亞砜)配制成0.05mg/ml溶液備用，測(cè)定其自由基清除作用，其自由基清除率為48％。

實(shí)施例7短管兔耳草與所述的乙醇水溶液的質(zhì)量體積比為(1:12)g/mL進(jìn)行提取

短管兔耳草干燥粉末20g(短管兔耳草粉末的粒度為60目)，室溫(25℃)下以體積濃度為70％乙醇水溶液240ml、超聲提取2次，每次30min(500W)，取濾液合并，減壓(50℃)回收溶劑至干，取提取物適量，加DMSO(二甲亞砜)配制成0.05mg/ml溶液備用，測(cè)定其自由基清除作用，其自由基清除率為48％。

實(shí)施例8短管兔耳草與所述的乙醇水溶液的質(zhì)量體積比為(1:15)g/mL進(jìn)行提取

短管兔耳草干燥粉末20g(短管兔耳草粉末的粒度為60目)，室溫(25℃)下以體積濃度為70％的乙醇水溶液300ml、超聲提取2次，每次30min(功率500W)，取濾液合并，減壓(50℃)回收溶劑至干，取提取物適量，加DMSO(二甲亞砜)配制成0.05mg/ml溶液備用，測(cè)定其自由基清除作用，其自由基清除率為39％。

實(shí)施例1-8的結(jié)果表明：選取以體積濃度為70％的乙醇溶液為提取溶劑，短管兔耳草與乙醇水溶液的質(zhì)量體積比為1:10g/mL提取效果最佳。

實(shí)施例9

取短管兔耳草干燥粉末50g(短管兔耳草粉末的粒度為60目)，室溫(25℃)下以體積濃度為70％的乙醇水溶液500ml、超聲提取2次，每次30min(功率500W)，濾液合并(約900ml)，減壓(50℃)回收溶劑至無醇味(即僅除去乙醇)，過AB-8樹脂，依次以500ml體積濃度為30％的乙醇水溶液， 500ml體積濃度為50％的乙醇水溶液和500ml體積濃度為70％的乙醇水溶液洗脫，分別收集各洗脫液(各約400ml)，蒸干，分別得到洗脫部位A(對(duì)應(yīng)體積濃度為30％的乙醇水溶液的洗脫劑，1.85g)、溶劑洗脫部位B(對(duì)應(yīng)體積濃度為50％的乙醇水溶液的洗脫劑，1.05g)和溶劑洗脫部位C(對(duì)應(yīng)體積濃度為70％的乙醇水溶液的洗脫劑，0.78g)。

效果實(shí)施例1

本效果實(shí)施例考察的是短管兔耳草提取物的抗氧化活性。按照實(shí)施例1-9制備的短管兔耳草提取物，測(cè)定其清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基能力。

測(cè)定步驟為：將短管兔耳草提取物分別用去離子水配制成水溶液，移取2mL于10mL具塞試管中，加入2mL DPPH乙醇溶液(2×10^-4mol/L)，充分混勻，室溫靜置，30min后用分光光度計(jì)測(cè)定517nm波長的吸光度A₅₁₇；同時(shí)測(cè)定2mL提取物溶液與2mL乙醇混合后的吸光度A₀，2mL水與2mL DPPH乙醇溶液混合后的吸光度C以及2mL水與2mL乙醇溶液混合后的吸光度C₀。平行測(cè)定三次，取平均值，根據(jù)以下公式計(jì)算自由基清除率，清除率越大，說明提取物的抗氧化能力越強(qiáng)。

自由基清除率(％)＝[1-(A₅₁₇-A₀)/(C-C₀)]×100％。

表1 DPPH法自由基清除活性的測(cè)定結(jié)果

由表1可見，短管兔耳草提取物具有很強(qiáng)清除自由基的能力，經(jīng)大孔吸附樹脂分離后得到的短管兔耳草體積濃度為70％的乙醇水溶液洗脫部位清除自由基的活性最強(qiáng)。

效果實(shí)施例2

本效果實(shí)施例考察的是短管兔耳草提取物對(duì)于酪氨酸酶的抑制活性。按照實(shí)施例9制備的短管兔耳草提取物，溶于去離子水，配制成水溶液，用于測(cè)定酪氨酸酶抑制活性。測(cè)定步驟為：磷酸鹽緩沖溶液(pH6.8，30mM)70μL、1.66mM酪氨酸溶液80μL、樣品溶液80μL混合均勻，在37℃恒溫水槽中溫育5分鐘，加入酪氨酸酶溶液(125U/mL)10μL，在37℃恒溫10min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定475nm波長的吸光度A₄₇₅。用去離子水替換樣品水溶液，作為參比溶液同樣測(cè)定吸光度，結(jié)果見表2。

酪氨酸酶活性抑制率計(jì)算公式為：抑制率(％)＝(A₀-(A₄₇₅-B))/A₀×100％，其中A₀是參比溶液的吸光度，A₄₇₅是樣品溶液的吸光度，B是樣品空白水溶液的吸光度。

表2 酪氨酸酶抑制活性的測(cè)定結(jié)果

由表2可知，在本發(fā)明中使用的各短管兔耳草提取物都具有酪氨酸酶活性抑制作用。其中，經(jīng)大孔吸附樹脂分離后得到的短管兔耳草體積濃度為70％的乙醇水溶液洗脫部位抑制酪氨酸酶作用較強(qiáng)，可以將其配合在外用劑中，作為防止肌膚色素沉著的美白活性物使用。

效果實(shí)施例3

本效果實(shí)施例考察的是短管兔耳草提取物的抗老化活性。按照實(shí)施例9制備的短管兔耳草提取物，溶于去離子水，配制成水溶液，用于測(cè)定彈性蛋白酶抑制活性。測(cè)定方法按照文獻(xiàn)(Am.J.Pharmacol.Toxicol.,2009,4,127-129)方法進(jìn)行，測(cè)定步驟為：在96孔板中加入10μL樣品溶液和130μL含有1.015mM反應(yīng)底物Succ-Ala-Ala-Ala-p-硝基酰替苯胺的0.1M Tris-HCl緩沖溶液(pH8.0)，在25℃下溫育5分鐘，加入15μL彈性蛋白酶溶液(0.5U/mL)，繼續(xù)在25℃下溫育30min，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定410nm波長的吸光度A₄₁₀。用去離子水替換樣品水溶液，作為參比溶液同樣測(cè)定吸光度，結(jié)果見表3。

彈性蛋白酶活性抑制率計(jì)算公式為：抑制率(％)＝(A₀-(A₄₁₀-B))/A₀×100％，其中A₀是參比溶液的吸光度，A₄₁₀是樣品溶液的吸光度，B是樣品空白溶液的吸光度。

表3 彈性蛋白酶活性抑制的測(cè)定結(jié)果

由表3可知，在本發(fā)明中使用的短管兔耳草提取物均具有抑制彈性蛋白酶作用，其中，經(jīng)大孔吸附樹脂分離后得到的短管兔耳草體積濃度為70％的乙醇水溶液洗脫部位抑制彈性蛋白酶作用最強(qiáng)，可以將其配合在外用劑中，作為防止肌膚老化、維持年輕健康的肌膚狀態(tài)的抗老化劑使用。