本申請要求于2014年4月27日提交的美國臨時申請?zhí)?1/984,814的申請日的權益。

發(fā)明領域

本發(fā)明涉及可用于成型為修復性牙科產(chǎn)品和骨骼假體（包括用于修復牙面缺陷（例如腭裂）的假體）的釉質產(chǎn)品。所述釉質產(chǎn)品還可用于替換已經(jīng)被創(chuàng)傷或疾病損壞的其它骨骼的部分和用于整容手術。用于從釉質產(chǎn)品生產(chǎn)、成型為和植入牙修復物或骨骼假體的組合物和方法，包括在CAD/CAM技術的輔助下成型或用3D打印機組裝釉質產(chǎn)品的方法，也在本發(fā)明的范圍內。

背景

釉質是牙齒中的主要組織之一。它在早期發(fā)育期間、在牙齒突出牙齦之前形成，并且其覆蓋牙齒的可見部分。在發(fā)育期間，釉質器官內的上皮細胞分化為成釉質細胞，成釉質細胞產(chǎn)生硬化的高礦物質含量的釉質。更具體地，釉質器官在體內天然地以發(fā)育中牙齒的組織學切片中的細胞聚集體出現(xiàn)，并且其包括存有成釉質細胞的內釉質上皮、外釉質上皮、中間層和星網(wǎng)狀層。牙器官由釉質器官和間充質組成。

保護和修復釉質是牙科醫(yī)生和在牙科領域工作的其他人員的主要關注點。這是具有挑戰(zhàn)性的，因為釉質在口中去礦物質化并且不再生。雖然再礦物質化牙齒的機制是已知的，但是平衡狀態(tài)可以容易地傾向于去礦物質化。例如，牙菌斑內的細菌（例如變形鏈球菌（Streptococcus mutans））可以產(chǎn)生有機酸，特別是在糖的存在下，降低口中的pH，促進去礦物質化和齲齒。工程化釉質顯然是需要的，但這被證明是困難的，因為不僅在長出的牙齒中缺少成釉質細胞，而且是發(fā)育的要求；到目前為止，可以分化為成釉質細胞的上皮細胞必須與間充質細胞相互作用以正確發(fā)育。以前的生產(chǎn)釉質的努力包括基于細胞的策略和無細胞策略兩種。通常，基于細胞的策略依賴于在Matrigel^TM（一種膠狀且含蛋白質的細胞培養(yǎng)基質）中與間充質細胞組合的穩(wěn)定細胞系的發(fā)育，并且其被移植到動物中并在此體內產(chǎn)生釉質（參見例如DenBesten et al.,Connect Tissue Res.38(1-4):3-8,1998；DenBesten et al.,Eur.J.Oral Sci.,107(4):276-81,1999；Nakata et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,308(4):834-839,2003；Honda et al.,Cells Tissues Organs 189(1-4):261-267,2009；Shinmura et al.,J.Cell.Physiol.217(3):728-738,2008；Nakagawa et al.,J.Dental Res.88(3):219-223,2009；Takahashi et al.,In Vitro Cell Dev.Biol.Anim.,46(5):457-468,2010；Liu et al.,J.Tissue Eng.Regen.Med.7:934-943,2012；Hu et al.,J.Dent.Res.,85(5):416-421,2006；and Chen,Arch.Oral Biol.37:771-778,1992）。由于釉質含有約97%的羥基磷灰石并且不含細胞，合成方法也是可能的（參見例如Yamagishi et al.,Nature 433:819,2005；and Brunton et al.,Br.Dental J.215:741,2013）。通過無細胞方案制備的釉質產(chǎn)品已經(jīng)在臨床試驗中得到測試，并且顯示其有效的治療了早期、輕微的齲齒（Yamagishi et al.,Nature 433:819,2005；and Brunton et al.,Br.Dental J.215:741,2013）。

概述

本發(fā)明部分地基于發(fā)明人開發(fā)的培養(yǎng)系統(tǒng)，其包括體外、3維（3D）、基于細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，為含有產(chǎn)生釉質產(chǎn)品的成釉質細胞樣細胞的釉質類器官生長提供環(huán)境。在這個意義上，本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)復制了釉質器官。與迄今為止所使用的方法不同，本文所述的培養(yǎng)系統(tǒng)可以生產(chǎn)釉質產(chǎn)品，而不使用天然存在的釉質器官或依靠牙間質或間充質細胞。

本發(fā)明的方法可以使用各種不同的細胞類型進行，這些細胞類型被置于細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，所述細胞培養(yǎng)系統(tǒng)被配置為允許所培養(yǎng)細胞3D生長為釉質類器官。當置于培養(yǎng)物中的細胞不產(chǎn)生釉質素（例如，其中最初培養(yǎng)的細胞是與成釉質細胞不同的分化細胞）時，所述方法包括使細胞去分化，然后再分化為成釉質細胞樣細胞的步驟。當置于培養(yǎng)物中的細胞是干細胞或前體細胞時，可以省略去分化步驟，并且當置于培養(yǎng)物中的細胞是產(chǎn)生釉質素的細胞（例如原代細胞）或由細胞系衍生的的細胞時，可以既省略去分化步驟又省略誘導釉質素產(chǎn)生。

因此，在第一方面，本發(fā)明的特征在于通過以下在體外產(chǎn)生釉質產(chǎn)品的方法：（a）在細胞培養(yǎng)物中提供分化的細胞；（b）將分化的細胞暴露于誘導去分化的試劑，從而產(chǎn)生去分化的細胞；（c）將去分化的細胞暴露于5-羥色胺受體激動劑，從而產(chǎn)生表達釉質素的成釉質細胞樣細胞（例如通過產(chǎn)生包含釉質素的細胞外基質）；和（d）將細胞外基質暴露于誘導礦物質化的組合物，從而產(chǎn)生釉質產(chǎn)品。在第二方面，本發(fā)明的特征在于通過以下在體外產(chǎn)生釉質產(chǎn)品的方法：（a）在細胞培養(yǎng)物中提供干細胞或前體細胞；（b）將干細胞或前體細胞暴露于5-羥色胺受體激動劑，從而產(chǎn)生生產(chǎn)細胞外基質的成釉質細胞樣細胞；和（c）將細胞外基質暴露于誘導礦物質化的組合物，從而產(chǎn)生釉質產(chǎn)品。在第三方面，本發(fā)明的特征在于通過以下在體外產(chǎn)生釉質產(chǎn)品的方法：（a）提供細胞（例如，分離的成釉質細胞，永生化的成釉質細胞或工程化以表達釉質素的細胞）；和（b）將成釉質細胞置于培養(yǎng)系統(tǒng)（例如，二維或三維培養(yǎng)系統(tǒng)）中?？梢员３峙囵B(yǎng)物以允許細胞生長和分裂，并且可以增加培養(yǎng)物中類器官的密度（例如，通過收獲和再鋪板或重新培養(yǎng)它們），以促進較大的類器官的形成，這將更容易聚集形成聚集體。為了促進細胞增殖和/或增加在培養(yǎng)中形成的釉質類器官的大小，可以將細胞暴露于如下進一步闡述的含有血清和/或生長因子或生長因子組合的組合物（例如細胞培養(yǎng)基）。一旦細胞增殖并產(chǎn)生包含釉質素的細胞外基質，它們可用作釉質產(chǎn)品，并且我們可以指定這樣的產(chǎn)品為未礦物質化的釉質產(chǎn)品。這些未礦物質化的釉質產(chǎn)品可用于通過例如三維打印成型為修復物和假體。可以將未礦物質化的釉質產(chǎn)品暴露于誘導礦物質化的試劑，從而產(chǎn)生礦物質化的釉質產(chǎn)品，其也可用于形成修復物和假體（例如通過3D打?。?。礦物質化的釉質產(chǎn)品可以通過暴露于減少釉質類器官中的有機物質的量的試劑來進一步開發(fā)。因此，任何方法可以進一步包括一旦已經(jīng)達到期望的尺寸就從釉質類器官去除有機物質的步驟。礦物質化并缺乏有機物質（例如，不含或基本上不含有機物質）的釉質類器官可尤其適于CAD/CAM技術以產(chǎn)生修復物和假體。

在使用分化細胞的任何實施方案中，細胞可以是上皮細胞（例如，口腔上皮角質形成細胞），但是本發(fā)明不限于此；可以使用可以在細胞培養(yǎng)物中去分化和/或重編程以開始表達釉質素（例如在細胞外基質中）的任何分化的細胞。在任何實施方案中，細胞培養(yǎng)物（例如，3D培養(yǎng)物）中的細胞可以是原代細胞。也就是說，無論產(chǎn)生釉質產(chǎn)品的方法是否包括培養(yǎng)分化的細胞、干細胞或前體細胞或成釉質細胞，細胞可以是從動物收獲并置于細胞培養(yǎng)物中的細胞。在其他實施方案中，可以從動物收獲細胞（分化的細胞、干細胞、前體細胞或成釉質細胞）并隨后永生化。因此，本發(fā)明的方法可以用原代細胞或細胞系的細胞進行。此外，細胞可以從各種來源獲得，包括哺乳動物，如人?？梢詫λ玫娜魏渭毎M行遺傳修飾（例如通過重組技術來改變由細胞表達的基因產(chǎn)物）。

當使用時，誘導去分化的藥劑可以是轉化生長因子（例如TGFβ（例如TGFβ1））。去分化的細胞可以是表達通常與干細胞相關的標記（例如，N-鈣粘著蛋白或八聚體結合轉錄因子4（Oct-4））而不是通常與成熟表型相關的標記（例如，去分化的上皮細胞可能不能表達上皮標志物E-鈣粘著蛋白）的細胞。

在使用時，5-羥色胺受體激動劑可以是5-羥色胺，氮雜唑酮（azapirone），曲坦（triptan），LY-334,370，拉西地酸（lasmiditan），麥角酰二乙胺（lysergic acid diethylamide），麥斯卡林（mescaline），2,5-二甲氧基-4-溴苯乙胺，氯卡色林（lorcaserin），西沙必利（cisapride），替加色羅（tegaserod），普盧卡必利（prucalopride）或AS-19；其鹽、水合物或類似物（例如N,N-二甲基色胺）；或其任何組合。

誘導礦物質化的組合物可包括鈣和/或磷酸鹽（例如，含有鈣或磷酸鹽的礦物質）。

為了多方面地支持細胞生長和分化，細胞培養(yǎng)物可以包括表皮生長因子（EGF）家族、胰島素樣生長因子（IGF）家、成纖維細胞生長因子（FGF）家族或其他生長因子（例如，血小板衍生生長因子；PDGF；還參見下文）的一種或多種生長因子。

任何細胞培養(yǎng)物均可以包括（例如在培養(yǎng)基質或培養(yǎng)基中）層粘連蛋白，膠原蛋白IV，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，巢蛋白（entactin/nidogen）或從Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤提取的溶解的基膜制備物。在任何實施方案中，細胞培養(yǎng)物可以被配置為允許細胞（例如成釉質細胞或成釉質細胞樣細胞）增殖成三維細胞簇，我們可以稱之為釉質類器官。成釉質細胞或成釉質細胞樣細胞可以在本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)中暴露于包括血清和/或一種或多種生長因子（例如，EGF、IGF、FGF、TGF或神經(jīng)生長因子）的組合物。

在本發(fā)明的任何方法中，可以處理釉質類器官以減少或去除其中的有機物質。例如，可以用次氯酸鈉和/或肥皂/去污劑（例如，Triton-X100）處理（例如浸漬）釉質類器官。如果需要，處理可包括將釉質類器官浸入超聲波浴中和/或將其暴露于熱（例如干熱）以促進有機物質的破壞和/或去除。因此，本文所述的釉質產(chǎn)品可以不含或基本上不含有機物質。

在另一方面，本發(fā)明的特征在于通過本文所述的方法制備的釉質產(chǎn)品。該產(chǎn)品可以被收獲和包裝以供銷售（與使用說明書一起），或者可以被成型為外科修復物，其然后也可以被包裝以供銷售。為了得到本發(fā)明的修復物，可以提供如本文所述的釉質產(chǎn)品，并使產(chǎn)品經(jīng)受進一步組裝或成形的工藝。例如，釉質產(chǎn)品可以進行如計算機輔助設計包所示的印?；虺尚?。在一個實施例中，釉質產(chǎn)品可以經(jīng)制型而包括凹陷（indentation）和/或突起（protrusion），并且可以在第一釉質產(chǎn)品上形成凹陷以嚙合第二釉質產(chǎn)品上的突起。因此，可以由多個較小的產(chǎn)品組裝更大的產(chǎn)品，然后可以將這些更大的產(chǎn)品進一步制型為適于修復較大缺陷的修復物（例如，長骨（例如股骨，扁平骨諸如肩胛骨，或不規(guī)則骨諸如骨盆或脊柱中的骨）中的缺陷）。

在一個實施方案中，外科修復物是牙修復物（例如，牙冠，鑲蓋（veneer），相應的支架，鑲嵌物，覆蓋物，全口拖牙，部分拖牙，橋等）。在另一個實施方案中，外科修復物是矯形假體。

在另一方面，本發(fā)明的特征在于細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其包括產(chǎn)生釉質素的細胞。該系統(tǒng)可以配置為允許細胞形成釉質類器官的三維系統(tǒng)。產(chǎn)生釉質素的細胞可以是天然即產(chǎn)生釉質素的細胞（例如原代成釉質細胞或永生化原代細胞）或已經(jīng)通過例如暴露于5-羥色胺受體激動劑或通過遺傳工程操作以表達釉質素的細胞。在各種實施方案中，本文所述的方法可以在3D培養(yǎng)物中進行，所述3D培養(yǎng)物包括包含生物聚合物（例如膠原蛋白，絲蛋白，藻酸鹽，殼聚糖，肽，透明質酸，其保留支持細胞三維生長能力的衍生物，或其任何混合或組合）的支架。在其他實施方案中，支架可以包括陶瓷。三維培養(yǎng)系統(tǒng)是本領域已知的。可以咨詢例如Sumita等人（Biomaterials 27:3238-3248,2006）和Zhang等人（Japanese Dental Science Rev.49:14-26,2013）。

基于我們迄今為止的研究，我們已經(jīng)確定了在體內自然發(fā)育的釉質器官和我們的體外3D培養(yǎng)系統(tǒng)中的釉質類器官之間的相似性。例如，在兩種情況下，形成包含表達釉質素的極化柱狀外周邊界細胞的球狀細胞簇。除了釉質素（或可選地），可以存在其它釉質標記物，包括成釉蛋白（ameloblastin），釉蛋白(enamelin)和釉叢蛋白（tuftelin）。還形成了含有釉質素的細胞外可礦物質化基質，為細胞提供結構和化學支持，包括剛剛提及的邊界細胞；這種細胞外基質充當將釉質產(chǎn)品礦物質化的基質。釉質素蛋白由釉質細胞高度表達，并且該蛋白質經(jīng)歷自組裝以形成與羥基磷灰石晶體相互作用并在垂直于表面的方向上定向晶體生長的納米球。本發(fā)明的釉質產(chǎn)品可以結晶，并且在各種實施方案中，它們的晶體結構將不同于天然存在的牙釉質。

在體內形成的球形釉質器官和本發(fā)明培養(yǎng)物中的釉質類器官二者均通過在三維中擴展而生長。當外周邊界細胞增殖時，它們產(chǎn)生包含礦物質化和釉質或釉質產(chǎn)品的基礎的細胞外基質。因為預期在我們的培養(yǎng)系統(tǒng)中生產(chǎn)的釉質的物理性質與在天然牙齒中發(fā)現(xiàn)的釉質的物理性質相似，我們預計當安裝在預制牙齒上時，我們的釉質產(chǎn)品將有效地最小化微滲漏，并因此降低齲齒的風險。此外，使用本發(fā)明的材料形成的修復物可以提供更自然的外觀，并且更容易被牙醫(yī)及其患者接受。金屬和瓷材料的成本上升也使得如本文所述生產(chǎn)的釉質產(chǎn)品的制造具有成本效益。

雖然用于釉質修復的產(chǎn)品目前由具有與天然存在的釉質不同的物理性質的材料制成，但是它們具有足夠相似的性質，以允許它們廣泛用于各種外科修復物。我們當前的期望是，本發(fā)明的釉質產(chǎn)品的物理性質將類似于天然存在的釉質產(chǎn)品的物理性質，使得使用如本文所述的釉質產(chǎn)品產(chǎn)生的修復物具有明顯的優(yōu)點。結合在外科修復物中的釉質產(chǎn)品的硬度可以通過改變礦物質化程度而變化。為牙齒表面準備的修復物可能需要最高的礦物質含量，而用于骨置換或增強的修復物可以更少程度地礦物質化。在應用修復物來置換軟骨或重塑軟骨特征（例如，鼻子或耳朵）時，礦物質含量甚至可以更低。因此，在各種實施方案中，釉質產(chǎn)品的硬度可以與牙釉質、骨或軟骨的硬度基本相同。

“約”是指加或減10%。例如，約10μg為9-11μg，包括端值。

“成釉質細胞樣細胞”是指產(chǎn)生含有釉質素的細胞外基質（ECM）用作本文所述的培養(yǎng)系統(tǒng)中礦物質化的支架的生物細胞。

“分化的細胞”是指可識別為除成釉質細胞之外的特化細胞類型的細胞。例如，分化的細胞可以是上皮細胞（例如，口腔上皮角質形成細胞），肝細胞，肌肉細胞或神經(jīng)元。如本文所定義的分化細胞不產(chǎn)生天然釉質，但可以在細胞培養(yǎng)物中重新編程以產(chǎn)生釉質產(chǎn)品?！叭シ只募毎笔窍惹翱勺R別為特化細胞類型但不再具有至少一種先前識別的性狀（例如，其中將其識別為分化細胞的一種性狀）的細胞。例如，去分化的口腔角質形成細胞可能不再表達上皮標志物，如E-鈣粘著蛋白，角蛋白，橋粒蛋白（例如橋粒粘蛋白或橋粒膠蛋白）或角質化的包膜蛋白；去分化的肝細胞可能不再表達主要血漿蛋白（例如血清白蛋白或C-反應蛋白），載體蛋白（例如白蛋白，血漿銅藍蛋白，運皮質激素蛋白，觸珠蛋白，血色素結合蛋白，IGF結合蛋白，視黃醇結合蛋白，甲狀腺素視黃質運載蛋白，或轉鐵蛋白），激素（例如IGF-1，血小板生成素或鐵調素）；或載脂蛋白；去分化的肌細胞可能不再表達肌動蛋白或肌球蛋白；并且去分化的神經(jīng)元可能不再表達神經(jīng)遞質。用于本發(fā)明方法的去分化的細胞包括表達5-羥色胺受體并且在暴露于5-羥色胺受體激動劑后能夠表達釉質素的細胞。去分化的細胞也可以，但不必然表達間充質標志物N-鈣粘著蛋白或干細胞標志物OCT4。

“釉質器官”是指在體內天然存在的細胞聚集體，而“釉質類器官”是指如本文所述在體外開發(fā)（在細胞培養(yǎng)物中，包括配置用于細胞在三維中擴增的細胞培養(yǎng)物）的細胞構建體。

“細胞外基質”是指由細胞分泌的分子的集合，其為細胞和其周圍的細胞提供結構和/或生物化學支持。ECM可以包括但不必然包括以下一種或多種：膠原蛋白（例如膠原蛋白IV），硫酸軟骨素，彈性蛋白，纖連蛋白，透明質酸，硫酸角蛋白，層粘連蛋白，蛋白聚糖（例如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）和巢蛋白。

除非上下文另有說明，否則我們使用術語“體外”來指細胞培養(yǎng)。

“原代細胞”是取自活生物體的細胞和未曾作為細胞系被永生化的細胞。

“干細胞”或“前體細胞”是指不產(chǎn)生天然釉質或釉質產(chǎn)品但在根據(jù)本文所述的方法培養(yǎng)時分化成可產(chǎn)生天然釉質或釉質產(chǎn)品的細胞的多能細胞（pluripotent cell或multipotent cell）；干細胞和前體細胞完全分化程度較低。通常，多能干細胞進一步特化成多能祖細胞，然后多能祖細胞產(chǎn)生功能性細胞?？捎糜诒景l(fā)明方法的干細胞和前體細胞表達5-羥色胺受體。

“外科修復物”是指植入或以其他方式施加到患者身體（例如，通過外科手術操作）以改善物理缺陷（例如，由疾病或創(chuàng)傷引起的牙齒或骨骼缺陷）或以增強物理結構（例如，在整容外科手術中）的組合物。例如，缺陷可以包括由退行性疾病、癌癥或損傷產(chǎn)生的裂縫、腔或縫隙。外科修復物可以是牙科修復物（即，在牙科操作中應用的組合物，其是或包括釉質產(chǎn)品）或骨骼假體（即，在外科手術操作中應用的組合物，以（完全或部分）修復牙面結構或長、扁平或不規(guī)則骨的一部分）?？梢允褂肅AD/CAM技術從釉質產(chǎn)品成型得到外科修復物?！靶迯托匝揽飘a(chǎn)品”或“牙科修復物”可以是用于（完全或部分）恢復牙齒的結構或外觀的組合物。這些組合物包括牙冠，鑲蓋，相應的支架，鑲嵌物，覆蓋物，部分拖牙，全口拖牙和橋（例如固定橋）。牙科修復是一種類型的外科修復，并且我們還可以使用術語“外科修復”來指代將本文所述的包含釉質產(chǎn)品或由釉質產(chǎn)品組成的組合物施用于患者的方法。本文所述的任何治療方法可包括鑒定需要治療的患者（例如，人類患者，無論是男人，女人還是兒童）的步驟。因此，所述方法可以包括鑒定具有牙科、面部或牙面缺陷（例如，腭裂）的患者；患有釉質發(fā)生不全病癥的患者；或具有需要修復的骨骼元件（例如，面部中的骨骼）的患者的步驟。該需要可以僅是患者感覺到的需要，如可能是整容外科的情況。

附圖簡要說明

圖1（a）-1（c）是用蘇木精和伊紅（a），抗釉質素抗體（b）和茜素紅（c）染色的本發(fā)明3D釉質類器官的顯微照片，其染鈣并指示礦物質化的類器官或釉質產(chǎn)品。

圖2（a）-2（d）是證明在培養(yǎng)中用TGFβ1處理的細胞系IMOK的口腔上皮角質形成細胞中，喪失E-鈣粘著蛋白表達且獲得N-鈣粘著蛋白表達的顯微照片。

圖3（a）-3（f）是用TGFβ1處理前后用抗Oct4、膠原蛋白1和釉質素的抗體染色的細胞系IMOK的口腔上皮角質形成細胞的一系列顯微照片。

圖4是一對顯微照片，其證明了用5-羥色胺處理后細胞系IMOK中的釉質表達的誘導。

圖5是顯示釉質產(chǎn)品的放射照片，其看起來是不透明的并且被圈表示。

圖6是培養(yǎng)物中釉質類器官的一系列照片。標記為“原始”的照片描繪了在用任何生長因子孵育之前的釉質類器官。其余的照片顯示了用胎牛血清（FBS）、FBS和EGF或FBS、EGF和PDGF培養(yǎng)接種的類器官的效果。

詳述

在下面的段落中，我們描述了用于在體外產(chǎn)生釉質類器官以及用于制備和使用來自這些類器官產(chǎn)生的釉質產(chǎn)品的外科修復物的組合物和方法。本文提供的描述用于示例但不限制本發(fā)明。

本文所述的組合物和方法可以不含天然存在的釉質器官、牙間質和間充質細胞，或者可以包括或通過使用這些部分與細胞類型（例如干細胞、前體細胞和分化的細胞（例如原代和永生化細胞））和如下所述的試劑（例如，5-羥色胺受體激動劑、生長因子和礦物質化物質）組合進行。

細胞和細胞類型：可以采用在本文所述的條件下將產(chǎn)生釉質產(chǎn)品（無論是未礦物質化的或礦物質化的或無論是否基本上不含有機物質（例如蛋白質、核酸和其他細胞物質））的任何細胞或細胞類型。這些細胞可以是分化的細胞，其在培養(yǎng)物中被誘導去分化，或者它們可以是干細胞或前體細胞。在任一情況下，細胞可以源自許多不同來源，包括任何數(shù)量的真核組織（例如，血液、骨髓、皮膚或粘膜組織）。例如，分化的細胞、干細胞或前體細胞可以從脊椎動物獲得，諸如哺乳動物（例如人或其他靈長類動物，狗，貓，馬，牛，綿羊，豬，山羊，或嚙齒動物）。干細胞或前體/祖細胞可以是例如造血干細胞，間充質干細胞，來自成體生物體的上皮干細胞，上皮干細胞，脂肪來源的干細胞或牙髓干細胞。分化的細胞可以是上皮細胞（例如，上皮角質形成細胞，例如口腔上皮角質形成細胞，或皮膚的上皮細胞）?？梢詮钠渌诘目谇坏娜魏螀^(qū)域（例如，腭）采集口腔上皮細胞。在任何實施方案中，細胞可以是永生化的和/或遺傳修飾的。

更具體地，釉質類器官可包括釉質器官上皮（EOE）細胞（例如，Chen等人（1992）使用的小鼠EOE細胞，也參見DenBesten et al.,Connect Tissue Res.38(1-4):3-8,1998）或由其產(chǎn)生。如上所述，細胞可以是永生化的，并且在這種情況下它們可以是例如由DenBesten等人產(chǎn)生的永生化的EOE細胞系，PABSo-E（DenBesten et al.,Eur.J.Oral Sci.,107(4):276-81,1999）。這些細胞已經(jīng)傳代超過55次，并保持成釉質細胞的特征，例如陽性表達釉質素、MMP-20和EMSP1mRNA（成釉質細胞的標記物）。細胞還可以自發(fā)地永生化（例如，由Nakata等人報道的自發(fā)永生化的小鼠成釉質細胞細胞系（Biochem.Biophys.Res.Commun.,308(4):834-839,2003）。另一種有用的細胞類型是Malassez的上皮細胞殘留物（ERM細胞；參見Shinmura et al.,J.Cellular Physiol.217:728-738,2008）。ERM細胞可以通過外植體培養(yǎng)從牙周韌帶組織獲得，用非血清培養(yǎng)基進行亞培養(yǎng)（sub-cultured），并在3T3-J2飼養(yǎng)細胞層上擴增。釉質類器官還可以包括皮膚上皮細胞或從皮膚上皮細胞產(chǎn)生（參見Liu et al.,J.Tissue Eng.Regen.Med.7:934-943,2012）。Hu等人在用牙間質培養(yǎng)這些細胞時證實了這些細胞的重編程（J.Dent.Res.,85(5):416-421,2006）。

遺傳修飾的細胞：在它們已經(jīng)被培養(yǎng)并且產(chǎn)生支持礦物質化的細胞外基質之前或之后，本發(fā)明構建體內的細胞可以被遺傳修飾以包括異源基因或基因構建體。用于遺傳工程改造細胞的方法是本領域公知的，并且包括例如由Chen對小鼠釉質器官上皮細胞（EOE）細胞所使用的電穿孔方法（Chen,Arch.Oral Biol.37:771-778,1992）。如果需要，可以工程改造細胞以表達由成骨細胞或骨細胞表達的一種或多種蛋白質。細胞還可以被遺傳修飾以產(chǎn)生釉質素或成釉質細胞的另一種標記物，或者產(chǎn)生或產(chǎn)生更多的ECM成分（包括ECM定義中列出的一種或多種成分）。因此，存在三種用于產(chǎn)生可用于本發(fā)明的方法中的細胞的方法：通過提供天然表達ECM和釉質素的細胞（例如通過分離成釉質細胞或永生化成釉質細胞系的細胞）；通過遺傳工程化細胞以產(chǎn)生ECM和釉質素；或通過重編程培養(yǎng)中的細胞（例如分化的細胞、干細胞或其他前體）以表達ECM和釉質素（例如通過暴露于包括血清和/或生長因子或本文所述的因子的培養(yǎng)基）。

基質和培養(yǎng)條件：對于本文所述的培養(yǎng)系統(tǒng)，可以將細胞最初置于常規(guī)的二維培養(yǎng)中，在此它們主要在單層中生長，然后轉移至3D培養(yǎng)，或者它們可以直接置于3D培養(yǎng)。例如，當所述方法使用通過基因或重組方法或通過去分化和再分化修飾以產(chǎn)生釉質素的分化細胞時，可以將細胞最初置于二維培養(yǎng)中，所述二維培養(yǎng)物未設計為支持三維生長。當需要3D生長時，本文所述的細胞或細胞類型可以與基質混合，所述基質例如基底膜基質（例如，來自BD Bioscience，San Jose CA的BD Matrigel TM；目錄＃356234；參見Hughes et al.,Proteomics 10(9):1886-1890,2010），并使用生長培養(yǎng)基（例如，DMEM-高蔗糖）在體外生長。BD Matrigel^TM基底膜基質是從Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤提取的可溶性制備物，其包含了包括層粘連蛋白、膠原蛋白IV、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白的細胞外基質蛋白。它還含有TGFβ、EGF、胰島素樣生長因子、成纖維細胞生長因子、組織纖溶酶原激活物和在EHS腫瘤中天然存在的其它生長因子。盡管基質的精確組成可以變化，但是其可以包括細胞外基質蛋白和生長因子的混合物，并且其可以源自腫瘤細胞（例如Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤細胞）。基質可以是在沒有其它因子（例如本文所述的轉分化因子）的情況下維持多能細胞在其多能狀態(tài)（即，其促進自我更新）的基質。還可以將細胞（例如原代或永生化口腔角質形成細胞）最初置于由其它培養(yǎng)基（例如CnT-02生長培養(yǎng)基（CELLNTEC））支持的培養(yǎng)物中。

在三維培養(yǎng)物中，細胞可以變成多層的或聚集的，其中層狀和/或聚集的細胞生長由支架引導。例如，3D培養(yǎng)物可以在AggreWell TM 400板（Stemcel Technologies，Grenoble，F(xiàn)rance）中生長。每個板具有六個孔，并且每個孔含有大約4,700個直徑為400μm的微孔。釉質類器官可以從這樣的孔轉移到ProtoTissue^TM生物反應器（MC2Biotek，Horsholm，Denmark），并在37℃下在濕潤的培養(yǎng)箱中在5%CO₂、95%空氣中培養(yǎng)，每2-5天更換培養(yǎng)基。這樣的生物反應器可以支持球體生長和細胞外基質的形成。更通常而言，可以使用基于以下或由以下產(chǎn)生的3D培養(yǎng)物：細胞外基質或支架（例如，采用水凝膠），改性表面，旋轉生物反應器，微載體，磁懸浮，懸滴板和/或磁性3D生物打印。在無支架技術中，可以使用低粘附力板和微圖案化表面。

細胞可以保持在培養(yǎng)中，直到它們達到一定水平的匯合度。例如，可以維持細胞直到它們?yōu)榧s10-90%（例如約30-40%，40-50%，50-60%，60-70%，70-80%或80-90%）匯合。

用去分化因子和再分化因子的處理：本文公開的方法可以包括：（1）分化的細胞（例如，口腔上皮角質形成細胞）通過暴露于TGFβ1（喪失E-鈣粘著蛋白；獲得N-鈣粘著蛋白+Oct4）的去分化；（2）通過暴露于5-羥色胺，將上述去分化（例如干細胞樣）的細胞再分化為成釉質細胞樣細胞（獲得釉質素）；（3）3D釉質類器官的形成；和（4）釉質類器官包括其細胞外基質（如通過陽性茜素紅染色所證明的）的礦物質化。上皮細胞通常形成片、管或囊泡，其中它們通過專門的接觸結構（包括由E-鈣粘著蛋白介導的粘附連接）彼此建立緊密的結合。上皮-間質轉化（EMT，也稱為轉分化）是其中細胞喪失上皮特征并獲得間質特征的過程。E-鈣粘著蛋白的丟失被認為是EMT的標志事件。與該丟失同時，轉分化細胞獲得間質特征，包括增加的N-鈣粘著蛋白的表達。總之，E-鈣粘著蛋白的下調和N-鈣粘著蛋白的上調作為EMT的標記（Xu et al.,Cell Res.19:156-172,2009）。已經(jīng)在發(fā)育過程中和在癌癥進展的背景下研究了EMT。在人類牙齒的發(fā)育研究中，Heymann報告說，雖然E-和N-鈣粘著蛋白均在胚胎牙組織中表達，但它們的表達模式顯著不同（Heymann et al.,Am.J.Pathol.160(6):2123-2133）。E-鈣粘著蛋白最初在帽狀期在牙上皮中表達，并且當在鐘狀期開始成釉質細胞分化時下調。N-鈣粘著蛋白顯示與E-鈣粘著蛋白相比的相反的梯度，并且在分化的上皮細胞中上調（Heymann，同上）。根據(jù)Heymann，增加的N-鈣粘著蛋白的表達和頂端定位在成釉質細胞轉化和極化中起重要作用，這是釉質基質分泌的先決條件。在癌癥進展的研究中，Araki等人采用了其中用重組TGFβ1誘導EMT的模型系統(tǒng)，并且發(fā)現(xiàn)在肝外膽管癌中通過TGFβ1誘導的EMT，從E-至N-鈣粘著蛋白的轉換促進了癌癥的進展（Br.J.Cancer 105:1885-1893,2011）。

在本發(fā)明的方法中，可以通過用轉化生長因子處理來誘導分化的細胞（例如原代或永生化的口腔上皮角質形成細胞）經(jīng)歷去分化和表達N-鈣粘著蛋白。如下所報道，我們觀察到在用TGFβ1處理的口腔上皮角質形成細胞中，E-鈣粘著蛋白表達減少和N-鈣粘著蛋白表達增加。我們還觀察到用5-羥色胺處理后釉質素表達的誘導。我們已經(jīng)證實用10μM的5-羥色胺處理10天后釉質素的誘導，并且可以調整該處理方案（例如，可以測試和觀察用約1-100μM（例如約5-80μM）處理約2-20天后的釉質素產(chǎn)生）。

可以測試在形成釉質產(chǎn)品過程中的任何時間，給定培養(yǎng)物中的細胞樣品中，上述標記或任何其他標記的表達。例如，培養(yǎng)細胞的樣品可以被固定（例如，在醇（例如，100%甲醇）中），并用定制的或可商購的抗體進行免疫組化。

在一些實施方案中（例如，當所培養(yǎng)的第一細胞是去分化的細胞時），生長因子可以從將細胞置于培養(yǎng)中的時間起存在。在其他實施方案中（例如，當最初置于培養(yǎng)物中的細胞是分化的細胞時），生長因子可以在稍后階段添加，例如在去分化后和/或在暴露于再分化劑（例如，5-羥色胺受體激動劑）后。

可以加入的促進細胞生長和釉質類器官擴張的生長因子和其它試劑包括以下任意組合：雙調蛋白（amphiregulin）；epigen；EGF；FGF（FGF1，F(xiàn)GF2，F(xiàn)GF3，F(xiàn)GF4，F(xiàn)GF5，F(xiàn)GF6，F(xiàn)GF7，F(xiàn)GF8，F(xiàn)GF9）；IGF（IGF1，IGF2）；胰島素；PDGF；肝細胞生長因子；WNT；TGFβ；趨化因子和細胞因子（例如，白細胞介素如IL1或IL6）；Notch配體；PGE；PGE₂；EP1，EP2，EP3，EP4；頭蛋白（Noggin）；煙酰胺-用在用于腫瘤的類器官中；A8301（TGFβ1型受體ALK5激酶、I型激活素/淋巴結受體ALK4和1型淋巴結受體ALK7的有效抑制劑）；R-Spondin；Flk1；BMP；激活素A；Oct4；SOX-9，SOX17；Runx；LEF1；鈣羥基磷灰石；釉叢蛋白；和牙本質涎磷蛋白（sialophosphoprotein）。

例如，釉質類器官的培養(yǎng)物可以包括培養(yǎng)基中0.1-100ng/ml的EGF，培養(yǎng)基中0.1-100ng/ml的可溶性E-鈣粘著蛋白，胎牛血清（10%）和/或0.1-10mM的鈣。生長因子可以首先添加到生長培養(yǎng)基中（即，在細胞置于培養(yǎng)中時），并且也可以在細胞從二維轉移到三維培養(yǎng)系統(tǒng)（例如，包括本文所述的支架材料的系統(tǒng)）之后存在。

細胞和/或從其形成的釉質類器官可以以不同的密度接種，這取決于用于聚集的所需接近度。為了產(chǎn)生更大的類器官（例如，具有大于1毫米直至例如50mm的直徑），可以更密集地接種細胞，使得當在培養(yǎng)物中生長時，它們彼此接觸（例如，在生長因子如FBS、EGF和PDGF存在下，如圖6所示）。

礦物質化：我們還已經(jīng)觀察到在用礦物質化溶液（鈣2.5mM，磷酸鹽1.5mM）處理時在細胞外基質中鈣的沉積?？梢允褂迷噭┘塁aCl₂·2H₂O（Sigma，>99.0%純）和KH₂PO₄（Sigma，>99.0%純）制備鈣（例如30mM）和磷酸鹽（例如3mM）的儲液。KH₂PO₄溶液可以使用小體積的KOH在25℃下調節(jié)至pH 7.4，并且可以在使用前過濾溶液?？捎糜诘V物質化的其它溶液包括10%葡萄糖酸鈣溶液、1%氟化鈉溶液和3%remodent溶液。

有機物質的去除：如上所述，在任何本發(fā)明的方法中，可以處理釉質類器官（例如礦物質化釉質產(chǎn)品）以減少或去除其中的一些（例如基本上全部）有機物質（例如，細胞物質，包括蛋白質、脂肪和核酸）。例如，釉質類器官可以用次氯酸鈉和/或肥皂/去污劑（例如，Triton-X100）處理（例如浸漬）。如果需要，處理可包括將釉質類器官浸入超聲波浴中和/或將其暴露于熱（例如干熱）以促進有機物質的破壞和/或去除。也可以通過暴露于包括合適的酶（諸如蛋白酶和核酸酶）的溶液中，去除有機物質。因此，本文所述的釉質產(chǎn)品可以不含或基本上不含（例如，大于90%，95%，98%或99%不含）有機物質。

可以在將任何釉質產(chǎn)品制成修復物或假體或并入修復物或假體中之前或之后，將另外的試劑（諸如著色劑）加入到任何釉質產(chǎn)品中。例如，用于改變顏色的著色劑或天然釉質或牙鑲蓋可以通過本領域已知的方法并入。

釉質類器官和由此產(chǎn)生的釉質的特征：如同天然存在的釉質器官，通過本方法產(chǎn)生的釉質類器官可具有球狀外觀；釉質類器官是通過三維擴增生長的球體，釉質類器官的外圍邊界細胞類似地生長。在構建體內，外周邊界細胞產(chǎn)生細胞外基質，其提供了礦物質化和釉質的基礎。構建體可以包括鈣化結節(jié)，并且可以通過轉化生長因子（例如TGFβ）促進這些結節(jié)的外觀（大小和/或數(shù)量）。生長因子（例如TGFβ）還可以影響分化標記物的表達，包括下面討論的那些。培養(yǎng)中的類器官通常具有球體形狀，并且它們可以被收獲并成形為立方體（例如～1cm³的立方體）。在本發(fā)明的方法中，立方體然后可以安裝在柱上，柱可以將釉質產(chǎn)品固定在銑床上，銑床將基于CAD/CAM方法對產(chǎn)品成形。在一些實施方案中，當釉質產(chǎn)品用于產(chǎn)生較大的外科修復物（例如，用于骨的實質性置換或強化現(xiàn)有骨結構的修復物）時，在培養(yǎng)中形成的類器官可以使用更小的互鎖件融合成基本上任何形狀。換句話說，如果必要或更方便，可以組裝成形（例如，塊狀）或不成形的類器官，并且這樣的組件以及制造和使用它們的方法在本發(fā)明的范圍內。

分化標記：釉質素，成釉蛋白，釉叢蛋白，釉蛋白，MMP-20（基質金屬蛋白酶-20）和EMSP1（釉質基質絲氨酸蛋白酶1）和細胞角蛋白14是體外和體內成釉質細胞分化的合適標記物。

像天然存在的釉質一樣，通過本文所述的方法產(chǎn)生的釉質產(chǎn)品可具有高礦物質含量，包括羥磷灰石，其是結晶磷酸鈣。以重量計，羥基磷灰石可以構成至少50%（例如至少50%，60%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或更多）的釉質產(chǎn)品。換句話說，在各種實施方案中，以重量計，釉質產(chǎn)品包含至少50%（例如至少50%，60%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，96%，97%98%，99%或更多）的羥基磷灰石。礦物質含量和其它性質可以通過進一步測試（諸如X射線晶體學）確定。釉質產(chǎn)品還可以含有選自兩種獨特類型的蛋白質中的至少一種類型的蛋白質，即，認為用作礦物質化框架的釉質素和釉蛋白類型的蛋白質（參見例如Catalano-Sherman et al.,Calcif.Tissue Int.54(1):76-80,1994）和/或其片段或其天然存在的小同種型。

如上所述，本發(fā)明的釉質產(chǎn)品可以進一步成形和操作，并且我們期望尺寸為約1cm³的塊對于許多應用來說將是方便的尺寸，并且易于適應CAD/CAM技術。為了使釉質類器官生長到適合于預期最終用途的適當尺寸，可以將體外產(chǎn)生的釉質類器官（如本文所述）暴露于用于生長的混合物，包括例如血清和一種或多種生長因子，包括但不限于FGF，EGF，IGF，胰島素和/或可溶性鈣粘著蛋白，例如可溶性E-鈣粘著蛋白（由Sabine M.Brouxhon博士；Stony Brook University提供）。

修復物成型的方法：如本文所述產(chǎn)生的釉質產(chǎn)品可用于適于從現(xiàn)有材料形成牙科修復物的任何技術。例如，印模（impression modeling）可用于手動地開發(fā)修復物?；蛘撸迯涂梢酝ㄟ^利用掃描技術的系統(tǒng)來進行，所述掃描技術諸如激光掃描，照相成像（參見美國專利號5,851,115，其內容在此并入本文）和機械感測（參見美國專利號5,652,709，其內容在此并入本文）。在一個實施方案中，該方法包括以下步驟：用單個成像裝置對身體區(qū)域和置換部分進行成像，所述單個成像裝置被布置成在一次曝光期間從不同角度同時拍攝身體區(qū)域的圖像。圖像顯影并使用讀取裝置來掃描圖像，該讀取裝置產(chǎn)生成像的身體區(qū)域和要在該區(qū)域中應用的置換部分的數(shù)字化數(shù)據(jù)。數(shù)字化數(shù)據(jù)被傳送到計算機設備，該計算機設備在屏幕上自動再現(xiàn)身體區(qū)域和置換部分。計算機程序計算身體區(qū)域和置換部分的表面的空間關系數(shù)據(jù)，并且該數(shù)據(jù)在制作和擬合身體（例如，人體）中的置換部分時用作對照數(shù)據(jù)。

掃描后，技術人員可以創(chuàng)建恢復物，任選使用計算機輔助設計包。已經(jīng)使用CAD/CAM（計算機輔助設計和計算機輔助制造）技術來提供許多當前可獲得的牙科修復物，包括牙冠，鑲蓋，相應的支架，鑲嵌物，覆蓋物和橋（例如固定橋）并且其可以類似地用于本發(fā)明的釉質產(chǎn)品。在該方法中歷史上使用的材料包括與天然牙齒具有顯著不同的機械性能的金屬、瓷和復合材料。例如，這些材料可以在硬度、彈性和其溫度系數(shù)方面顯著變化。這種差異可允許在修復物和隨后的齲齒周圍的微滲漏。本發(fā)明的優(yōu)點是通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的釉質產(chǎn)品更類似于天然釉質，并且還可以接受CAD/CAM研磨和牙科修復應用。因此，所得的牙科修復物表現(xiàn)出與天然牙齒的性質更相似的性質，并且在礦物質化被定制使得釉質產(chǎn)品的硬度更接近軟骨或骨的硬度的情況下也是如此。

因此，本發(fā)明的特征在于將本文所述的（或通過本文所述的方法制備的）釉質產(chǎn)品成型為修復性牙科產(chǎn)品和骨骼假體的方法。修復物可以是傳統(tǒng)的實驗室創(chuàng)建的固定修復物，或者可以在CAD/CAM設計和銑削系統(tǒng)（諸如由Sirona Dental Systems以商品名CEREC出售的系統(tǒng)）上生產(chǎn)。可與本發(fā)明的釉質一起使用的其它牙科軟件產(chǎn)品包括Delcam^TM、Renishaw^TM和WorkNC Dental^TM。CAD程序的使用在美國專利號5,338,198中描述，其內容通過引用并入本文。通常，常規(guī)牙科印?？梢酝ㄟ^計算機控制的激光掃描儀進行數(shù)字化，并且此類數(shù)字化步驟可以包括在形成釉質產(chǎn)品的本發(fā)明方法中。隨后，可以通過定制的計算機圖形軟件來轉換數(shù)據(jù)，從而可以在計算機屏幕上從各種視角和以各種放大倍數(shù)觀看導出的3D電子模型（例如，牙齒，牙弓或受損骨骼）。

在一個實施方案中，可以使用美國專利號8,612,037中描述的技術制造患者牙列和牙植入物類似物的快速原型，其內容通過引用并入本文。也可以使用仿型銑削（copy milling）方法。

牙科修復領域的普通技術人員熟悉諸如牙冠，鑲蓋，相應的支架，鑲嵌物，覆蓋物，假牙和橋的產(chǎn)品。簡而言之，牙冠是一種牙齒形的“帽”，當放置在牙齒上時，它改善牙齒的形狀和尺寸、強度和外觀。牙冠通常被結合到適當位置并完全包住牙齒的可見部分。需要牙冠的患者包括其牙齒變弱（例如，由于蛀牙，破裂或嚴重磨損）的患者和尋求美容性改善的患者。例如，牙冠可以放置在畸形或嚴重變色的牙齒上，并且它們也可以放置在牙科植入物上。

在其他實施方案中，修復性牙科產(chǎn)品和骨骼假體可以使用釉質產(chǎn)品的顆粒通過3D打印來制造以打印所需的修復物。換句話說，可以使用由本發(fā)明的釉質類器官產(chǎn)生的釉質晶體在3D打印機的幫助下形成更大的結構（即，基本上任何修復性牙科產(chǎn)品或骨骼假體），并且這樣的方法在本發(fā)明的范圍內?；蛘撸梢允褂?D打印機打印用作修復的框架的有機基質（例如，細胞外基質材料）。然后將框架置于培養(yǎng)物中，在此細胞如本文所述（例如，成釉質細胞樣細胞）將粘附到框架。一旦框架被填充，由細胞產(chǎn)生的支架和細胞外基質可以被礦物質化至所需的程度，并且可以去除有機物質，留下準備用于植入的最終釉質修復物。

關于植入操作，可以使用已知技術植入如本文所述制造的牙科修復物，包括允許最小量的粘合劑延伸超過邊緣的技術，如美國專利號8,641,419中所述，其內容通過引用并入本文。簡而言之，阻擋件（barrier）定位成與正被恢復的牙齒接觸，并且相鄰的牙齒覆蓋正被恢復的牙齒的一部分，并且產(chǎn)生正被恢復的牙齒和相鄰牙齒的分離。粘合劑（cement）施加到固定修復物的第一嚙合面和/或牙齒的第二嚙合面，并且固定修復物的第一嚙合面和牙齒的第二嚙合面彼此相鄰地定位，以將固定修復物安在牙齒上。該阻擋件覆蓋正被恢復的牙齒的一部分，以防止粘合劑粘合到牙齒的該部分。這消除了從牙齒的該部分去除硬化粘合劑的需要。

實施例

在下述研究中，成釉質細胞樣細胞起源于口腔上皮角質形成細胞。我們使用細胞系IMOK，一種來自小鼠的永生化口腔角化細胞系（immortalized oral keratinocyte cell line），這是Garrett-Sinha博士贈予的（SUNY-Buffalo；Parikh et al.,Arc.Oral Biol.53:1091-1100,2008）。

為了解凍冷凍的IMOK細胞，我們從液氮儲存中取出含有10⁶個冷凍細胞的冷凍小瓶，立即將其置于37℃水浴中，并輕輕旋轉小瓶。當細胞解凍時，我們將小瓶轉移到層流潔凈工作臺中，并加入10ml預溫熱的無血清CnT-02生長培養(yǎng)基（CELLNTEC；FPS 1:1000加入培養(yǎng)基）。我們離心細胞懸浮液（～1000rpm 4分鐘），然后目視檢查小瓶中是否存在完整的沉淀。無菌傾析上清液而不干擾細胞沉淀，輕輕地將細胞沉淀重懸于7ml CnT-02培養(yǎng)基中。我們將重懸的細胞轉移到T25培養(yǎng)瓶中，并用5%CO₂的濕潤氣氛在37℃下培養(yǎng)。每隔一天更換培養(yǎng)基，當細胞達到90%匯合時，我們將它們1:5分開，并如下將它們接種在12孔板中。在從培養(yǎng)瓶中棄去培養(yǎng)基后，我們用PBS洗滌細胞，然后加入2mL預溫熱的解離試劑（TrypLE；GIBCO），輕輕搖動培養(yǎng)瓶以完全覆蓋細胞層。我們將培養(yǎng)瓶轉移到培養(yǎng)箱（37℃，5%CO₂）中20分鐘，每5分鐘在顯微鏡下檢查細胞的解離。當≥90%的細胞脫離時，我們加入8ml預溫熱的CnT-02生長培養(yǎng)基（CELLNTEC），用移液管將其分散在細胞層表面上數(shù)次。將細胞懸浮液轉移至50ml錐形管中并離心（1000rpm，4分鐘）。我們將細胞沉淀重懸在5ml預溫熱的無血清CnT-02生長培養(yǎng)基（CELLNTEC）中，并以1:5的比例分開細胞。我們稀釋細胞懸液板并將合適體積用移液器吸至新的12孔板，將細胞返回培養(yǎng)箱（37℃，5%CO₂）。

當所分開的細胞達到30-40%匯合時，開始用5ng/ml TGFβ1（rhTGFβ1；R&D system）處理它們。我們將媒介物（4mM HCl+1mg/mL BSA）添加到對照側，將TGFβ1（5ng/mL）添加到實驗側，并輕輕混合。我們每隔一天更換培養(yǎng)基，持續(xù)10天。為了固定細胞，我們吸出培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞，然后用100%甲醇固定20分鐘。固定后，我們用PBS（x3）洗滌固定的細胞，并將其儲存在4℃。

免疫細胞化學通用步驟：（1）在0.15M PBS（pH 7.2；4×5分鐘）中洗滌樣品載玻片；（2）在4%正常山羊血清（NGS）中孵育20分鐘（2ml的0.15M PBS+80μL NGS）；（3）與一抗溶液孵育（細節(jié)如下；90分鐘）；（4）用0.5M PBS洗滌（3次×10分鐘）；（5）用在0.15M PBS中的4%NGS封閉（20分鐘）；（6）與二抗（生物素-SP-綴合的山羊抗兔IgG；60分鐘）孵育；（7）用0.15M PBS洗滌（3次×10分鐘）；（8）制備ABC溶液并在ABC溶液中孵育（以下詳述；60分鐘（5mL 0.15M PBS+ABC溶液600μL）；（9）用0.1M AI緩沖液（175mM乙酸鈉和10mM咪唑，pH7.2）洗滌3次×10分鐘[在1000mL H₂O中14.35g乙酸鈉，0.68g咪唑]；（10）進行DAB反應5-20分鐘，經(jīng)常檢查；和（11）在用含0.04%TritonX-100的0.05M PBS中洗滌15分鐘，以終止反應。

一抗溶液含有含0.5%Triton X-100的0.15M PBS；在含0.5%TritonX-100的0.15M PBS中的4%NGS；和1：500稀釋的一抗（2mL PBS+0.04%Tx 100+80μL NGS+4μL一抗）。二抗溶液含有含0.5%Triton X-100的0.15M PBS和1:2500稀釋的二抗（山羊抗兔IgG）[2ml PBS+0.04%Tx 100+0.8uL GαR]。為了制備ABC（抗生物素蛋白生物素復合物）溶液，在Eppendrof管中向500μL的0.15M PBS中加入1滴A，1滴B。將其在室溫下在振蕩平臺上放置30分鐘。DAB溶液含有50mL的125mM乙酸鈉緩沖液，pH 9.3，向其中加入10mg DAB（攪拌直到溶解）和16.5μL 30%H₂O₂。

N-鈣粘著蛋白，E-鈣粘著蛋白，膠原蛋白-1，釉質素(Amelogenin)和OCT4的免疫細胞化學：為了染色N-鈣粘著蛋白，我們使用兔多克隆N-鈣粘著蛋白抗體（以1:1000稀釋；ab12221）作為一抗，山羊抗兔抗體（1:2500）作為二抗。為了對E-鈣粘著蛋白染色，我們使用兔多克隆E-鈣粘著蛋白抗體（1:500；H-108[SC-7870]）作為一抗，使用山羊抗兔抗體（1:2500）作為二抗。為了染色膠原蛋白-1，我們使用山羊多克隆膠原蛋白抗體（1:500[Col 1A1（D13）][SC-25974]）和山羊抗驢二抗（1:2500）。為了對釉質素染色，我們使用兔多克隆釉質素抗體（1:500；Amelx；ab59705）作為一抗和山羊抗兔抗體（1:2500）作為二抗。為了對OCT4染色，我們使用兔多克隆Oct4抗體（1:1000）作為一抗和山羊抗兔抗體（1:2500）作為二抗。

如圖1（b）所示，用轉分化因子TGFβ1和5-羥色胺處理的釉質類器官的細胞和細胞外基質中的釉質素的表達作為證據(jù)證明，細胞承繼了成釉質細胞的特征。更具體地，如圖3（a）-3（f）所示，在TGFβ1的影響下，口腔上皮角質形成細胞獲得Oct4（b）的表達并失去膠原蛋白1（d）的表達。在TGFβ1處理之前（e）或之后（f），細胞不表達釉質素。然而，當進一步用5-羥色胺處理細胞時，它們表達釉質素（圖4）。

5-羥色胺，5-羥色胺受體和發(fā)育中的牙齒：已經(jīng)在小鼠釉質器官中在體內鑒定了5-羥色胺受體（Riksen et al.,Eur.J.Oral Sci.118:566-573,2010）。向含有發(fā)育中牙芽的器官型小鼠培養(yǎng)物中加入5-羥色胺誘導了下游途徑活化并加速了牙齒發(fā)育，這被拮抗劑逆轉（Moiseiwitsch and Lauder,Arc.Oral Biol.41:161-166,1996;Moiseiwitsch et al.,Arc.Oral Biol.43:789-800,1998）。小鼠中5-羥色胺5TH2B受體的靶向缺失導致小鼠牙齒組織的結構改變（Dimitrova-Nakov et al.,Calcif.Tissue Int.,94(3):293-300,2014）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)顯示5-羥色胺信號傳導在牙齒發(fā)育中發(fā)揮作用。

用TGFβ1和5-羥色胺處理：如上所述我們用TGFβ1（5ng/ml）處理了解凍和培養(yǎng)的IMOK細胞10天，然后用5-羥色胺（100μM）再處理10天。在最初的研究中，我們使用兩個12孔板，細胞在30-40%匯合。我們用TGFβ1（5ng/ml）處理實驗側10天，并且向對照側添加相同量的媒介物（4mM HCL+1mg/ml ABS）。我們每隔一天更換培養(yǎng)基。在用TGFβ1處理10天后，我們如下處理兩個平板。在IMOK板#1上，我們繼續(xù)TGFβ1處理（5ng/ml），并將5-羥色胺（100μM）加入實驗側。在IMOK板#2上，我們向實驗側添加100μM 5-羥色胺，并將媒介物添加至對照側。我們每隔一天更換培養(yǎng)基，持續(xù)8天。為了固定細胞，我們將它們暴露于100%甲醇20分鐘，用PBS（3x）洗滌它們并將其儲存在4℃。

我們還測試了不同5-羥色胺濃度對用TGFβ1處理10天的IMOK細胞的影響。細胞以1:8分開，我們每隔一天更換CnT-02無血清培養(yǎng)基。當細胞達到40%匯合時，將它們用TGFβ1（5ng/ml）處理10天，然后以1nM，10nM，100nM，1μM，10μM或100μM的濃度加入5-羥色胺到選擇的孔中。我們在平板的其他孔中繼續(xù)TGFβ1（5ng/ml）處理，作為對照。我們每隔一天更換培養(yǎng)基，持續(xù)另外10天，用100%甲醇固定細胞，并將它們儲存在4℃。

我們建立了IMOK細胞的2維和3維培養(yǎng)物，以研究礦物質化溶液對用TGFβ1和5-羥色胺處理的細胞的影響。在我們解凍細胞后，將它們置于具有無血清培養(yǎng)基CnT-02（每隔一天更換）的T25培養(yǎng)瓶中。當細胞達到40%匯合時，我們用TGFβ1（5ng/ml）處理它們10天，然后鋪板并用10μM 5-羥色胺處理10天（繼續(xù)每隔一天更換培養(yǎng)基）。2-D培養(yǎng)物用100%甲醇固定，3-D培養(yǎng)物用10%福爾馬林固定。我們添加了羥基磷灰石（HA）到未被固定的組，每隔一天更換培養(yǎng)基。

為了產(chǎn)生3-D培養(yǎng)物，我們使用BD Matrigel^TM Basement Membrane Matrix（cat#356234）并在4℃下預冷卻移液管、吸頭和組織培養(yǎng)物過夜。在一個我們稱為“厚凝膠法”的方法中，我們在4℃下在冰上解凍凝膠過夜，然后用無血清培養(yǎng)基（CnT-02）1:1（凝膠:培養(yǎng)基）稀釋，并充分混合。我們將培養(yǎng)板保持在冰上，并以150-200μl/cm²的生長表面向細胞培養(yǎng)孔（鋪板密度1:5分開）加入凝膠。在37℃下孵育細胞30分鐘后，我們向每個孔中加入1ml培養(yǎng)基。

我們將如上所述用TGFβ1和5-羥色胺處理的細胞暴露于Wiedemann-Bidlack等人描述的礦物質化溶液中（J.Struct.Biol.173(2):250-260,2011）。使用CaCl₂.2H₂O（Sigma）和KH₂PO₄（Sigma）制備鈣（30mM）和磷酸鹽（30mM）的儲液。在室溫下將KH₂PO₄溶液調節(jié)至pH 7.4，并且在使用前將兩種溶液通過0.22μm過濾器過濾。將終濃度為2.5mM的鈣和1.5mM的磷酸鹽加入到板中（從而產(chǎn)生礦物質化溶液）。我們用礦物質化溶液培養(yǎng)細胞10天，每隔一天更換培養(yǎng)基。

為了制備冷凍切片，我們用10%福爾馬林固定培養(yǎng)物過夜，然后用PBS洗滌1小時。我們在濾紙中收集凝膠，將其包埋在30%蔗糖中1小時，然后包埋在29℃的OCT中。使用標準技術將冷凍組織在低溫恒溫器（-29℃）上切片至約5μm，將切片置于Fisher Superfrost^TM載玻片上，并在室溫下干燥過夜。我們通過將載玻片浸入冷丙酮（-20℃）中2分鐘來固定載玻片。它們空氣干燥后，我們繼續(xù)將它們染色。其它合適的固定劑包括醇、甲醇、福爾馬林等。

通過標準方法進行H＆E（蘇木精和伊紅）染色。簡言之，我們：（1）在50ml錐形管中將經(jīng)空氣干燥的載玻片用過濾的0.1%蘇木精染色10分鐘；（2）在冷卻運行的ddH₂O中漂洗5分鐘；（3）將它們浸入0.5%伊紅（1.5g溶解在300ml的95%EtOH；12x）中，隨后用蒸餾水直到伊紅停止出條紋，然后是50%EtOH（10x）和70%EtOH（10x）；（4）在95%EtOH中平衡載玻片30秒，然后用100%EtOH平衡1分鐘；（5）將它們浸入二甲苯幾次，用面巾紙擦拭去過量二甲苯；和（6）封片并用Cytoseal XYL^TM蓋上蓋玻片。如圖1（a）所示，釉質類器官是球形簇，包括以柵欄布置為特征的外圍邊界細胞層。如圖所示，細胞是極化柱狀細胞，一些是立方體形的。細胞具有中等體積的細胞質和單個立方體形或卵形核。

我們用茜素紅染色來自2D培養(yǎng)物的福爾馬林固定的細胞。我們的工作溶液可以在黑暗中儲存長達三個月，并且包括1g Alizarin Res S（Sigma，Cat.#A5533）+100ml蒸餾水。我們使用0.1%氫氧化銨將pH調節(jié)至4.1-4.3，然后將溶液用無菌過濾器過濾。用自來水洗滌細胞后，我們用茜素紅工作溶液將它們染色5分鐘，然后再次用自來水洗滌。

我們還用茜素紅染色已暴露于羥基磷灰石（HA）或HA和5-羥色胺的3D細胞培養(yǎng)物的冷凍切片。我們用蒸餾水快速沖洗載玻片，然后是茜素紅溶液（2%）30秒至3分鐘，顯微鏡檢查橙紅色染色的顯色。在搖掉染料溶液后，我們將載玻片浸入丙酮（20次）和丙酮-二甲苯（20次）中，用二甲苯清除它們，并將它們在Permount^TM中封片。如圖1（c）所示，釉質類器官是茜素紅染色陽性，識別鈣并顯示細胞誘導礦物質化（與成釉質細胞一樣）。

如圖2a-2d所示，口腔上皮角質形成細胞通常在培養(yǎng)物中表達E-鈣粘著蛋白（a）。TGFβ1處理誘導E-鈣粘著蛋白表達的喪失（b）。相比之下，通常N-鈣粘著蛋白不表達（c），而是由TGFβ1（d）誘導。因此，源自口腔上皮的角質形成細胞可以經(jīng)歷與成為成釉質細胞的體內細胞相同的E-鈣粘著蛋白至N-鈣粘著蛋白轉換。在組織學上，這些細胞是圓形的并在匯合控制條件下彼此連接，而在TGFβ1處理后，細胞尺寸增大、分離并擴散。

如圖5所示，如本文所述產(chǎn)生的釉質產(chǎn)品樣品在射線照片中看起來不透明。

如上所述，支架可用于促進三維釉產(chǎn)品的生產(chǎn)。例如，我們在48孔培養(yǎng)皿中以每個支架接種3x 10⁶個成釉質細胞樣細胞（從如上所述，相信由IMOK細胞系制備）接種，并允許細胞在含有10%FCS的DMEM中附著到支架上。將培養(yǎng)物于37℃、5%CO₂下培養(yǎng)24小時。然后用冷的（4℃）DMEM替換培養(yǎng)基以除去未附著的細胞并冷卻支架。然后將支架結合的細胞轉移到含有冷（4℃）液體Matrigel^TM的新的細胞培養(yǎng)皿中。我們輕輕地搖動培養(yǎng)皿以促進支架暴露于Matrigel^TM，然后將培養(yǎng)皿在37℃下培養(yǎng)30分鐘。之后，我們向每個孔中加入1ml培養(yǎng)基，將細胞培養(yǎng)10天，然后在礦物質化培養(yǎng)基存在下再培養(yǎng)10天。