本申請(qǐng)案分別主張?jiān)?014年5月29日和2014年12月19日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)案第62/004,738號(hào)和第62/094,923號(hào)的優(yōu)先權(quán)以及權(quán)利，且其全文通過引用并入本文中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明大體上涉及用于傳遞治療劑(例如，靶向藥物釋放)的納米粒子結(jié)合物，所述治療劑用于檢測(cè)、預(yù)防和治療癌癥以及其它疾病。

背景技術(shù)：

納米治療傳遞媒劑通常為尺寸在1到1,000nm范圍內(nèi)的巨或超分子多組分系統(tǒng)，其本身具有治療性(例如，無活性藥物成分)或充當(dāng)治療性傳遞系統(tǒng)。迄今為止，脂質(zhì)體納米粒子和生物制劑包含大部分?jǐn)?shù)量的經(jīng)美國(guó)食品藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的產(chǎn)品或臨床試驗(yàn)中的產(chǎn)品，其用于治療各種癌癥類型，而許多基于聚合物的粒子制劑目前正處于早期試驗(yàn)。

用于納米治療傳遞系統(tǒng)的所要理想對(duì)象具有共同特征：以控制方式并入和釋放藥物化合物，其可在使偏離目標(biāo)毒性降到最低時(shí)，有利地改變藥物生物可用性和藥物動(dòng)力學(xué)。理想地，將成像標(biāo)記并入其中，以評(píng)估其精確定位和在疾病部位的保留。

但是，此等系統(tǒng)使用不同機(jī)制起作用。例如，抗體藥物結(jié)合物(ADC)主要通過主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞和條件性釋放藥物分子來達(dá)成較低藥物毒性。當(dāng)結(jié)合細(xì)胞表面抗原時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)化和內(nèi)體吸收后出現(xiàn)活性藥物釋放。另一方面，相較于被動(dòng)地負(fù)載有更大有效負(fù)載(阿霉素(Doxil)為約10,000藥物分子量)的組合復(fù)合物(直徑為約20到150nm)，通常大得多的脂質(zhì)體和基于聚合物的藥物傳遞系統(tǒng)已普遍缺乏靶向能力(BIND-014除外)。因此，此等復(fù)合物主要依賴于公認(rèn)增強(qiáng)的滲透和保留(EPR)作用來成功傳遞納米調(diào)配藥物。盡管因?yàn)橹|(zhì)體的尺寸其填隙式滲透可能較差，但通過各種未完全理解的機(jī)制來釋放自由藥物。例如，蛋白結(jié)合型紫杉醇(Abraxane，約140nm)依賴于不同方法，以增強(qiáng)疏水性化合物的生物可用性。在此情況下，清蛋白和藥物(太平洋紫杉醇)的特定制劑形成初始復(fù)合物，反過來當(dāng)注入時(shí)估計(jì)其分散成更小蛋白藥物凝集物。

因此，需要一種用于藥物傳遞的獨(dú)特平臺(tái)，其提供足夠生物穩(wěn)定性，且顯示生物活性化合物在所要部位的控制釋放。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本文呈現(xiàn)納米粒子藥物結(jié)合物(NDC)的方法和組合物，具體地說，呈現(xiàn)共價(jià)連接有藥物分子的基于二氧化硅的納米粒子平臺(tái)。NDC已展現(xiàn)為納米治療劑。尺寸、分子組成和化學(xué)方法(例如，藥物釋放模式)的組合可充分利用見于其它納米治療產(chǎn)品中的有利特性，以便克服阻礙傳統(tǒng)制劑的關(guān)鍵障礙物，包括狹小治療性指數(shù)、劑量限制毒性和有限臨床效用。

一方面，本發(fā)明涉及一種納米粒子藥物結(jié)合物(NDC)，其包含：納米粒子(例如，直徑在1nm到25nm范圍內(nèi))；鍵聯(lián)基團(tuán)部分；和藥物部分(例如，達(dá)沙替尼(dasatinib)或吉非替尼(gefitinib)，包括其任何類似物)，其中納米粒子包覆有有機(jī)聚合物(例如，其中有機(jī)聚合物包含至少一個(gè)雙官能化順丁烯二酰亞胺硅烷基-聚乙二醇基團(tuán)，其連接到至少一個(gè)鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體上)，且其中藥物部分和鍵聯(lián)基團(tuán)部分形成可裂解(例如，經(jīng)由蛋白酶)鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體，其共價(jià)鍵聯(lián)到納米粒子上(例如，通過鍵聯(lián)基團(tuán)部分)(例如，其中藥物部分與納米粒子的平均比率在1到20范圍內(nèi))。

在某些實(shí)施例中，鍵聯(lián)基團(tuán)部分包含一或多種氨基酸(例如，肽或多肽)(例如，1到10種氨基酸)。在某些實(shí)施例中，鍵聯(lián)基團(tuán)部分包含(氨基-(間隔基)_x)_y-肽或(間隔基)_z-肽[例如，二肽(例如，苯丙氨酸-精氨酸(Phe-Arg)或苯丙氨酸-賴氨酸(Phe-Lys))]，其中間隔基具有2到50個(gè)原子(例如，其中間隔基為PEG)，其中x為整數(shù)1到5，其中y為整數(shù)1到5，其中z為整數(shù)5到15，且其中鍵聯(lián)基團(tuán)部分在鍵聯(lián)基團(tuán)部分與藥物部分之間包含可降解部分(例如，酰胺鍵)(例如，在蛋白酶存在下使藥物部分裂解)。在某些實(shí)施例中，鍵聯(lián)基團(tuán)部分在肽與藥物部分之間包含間隔基(例如，聚乙二醇(PEG)、PEG₂、氨基甲酸對(duì)氨基芐氧酯(PABC))。在某些實(shí)施例中，NDC進(jìn)一步包含熒光化合物(例如，與納米粒子相連，例如，在納米粒子的核心內(nèi))。在某些實(shí)施例中，NDC進(jìn)一步包含放射性標(biāo)記。

在某些實(shí)施例中，鍵聯(lián)基團(tuán)部分能夠在蛋白酶(例如，絲氨酸蛋白酶(例如，胰蛋白酶)、半胱氨酸蛋白酶(例如，組織蛋白酶B))結(jié)合時(shí)，在C端進(jìn)行水解，由此自納米粒子釋放藥物部分。

在某些實(shí)施例中，藥物部分包含受體酪氨酸激酶(RTK)抑制劑(例如，達(dá)沙替尼或吉非替尼，包括其任何類似物(例如，其任何藥物和/或治療性等效物)，其經(jīng)改質(zhì)以在不擾亂藥物部分活性結(jié)合位點(diǎn)的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)的情況下，連接到鍵聯(lián)基團(tuán)部分)。

在某些實(shí)施例中，NDC進(jìn)一步包含1到20種靶向部分(例如，環(huán)狀精氨?；拾滨；於彼?cRGD))，其中靶向部分結(jié)合到腫瘤細(xì)胞上的受體上。

在某些實(shí)施例中，NDC為診療一體化的。

在某些實(shí)施例中，熒光化合物為Cy5.5。

在某些實(shí)施例中，將藥物部分連接到放射性標(biāo)記上。

在某些實(shí)施例中，納米粒子進(jìn)一步包含基于二氧化硅的核心和包圍至少一部分核心的二氧化硅外殼。

關(guān)于本發(fā)明的給定方面描述的實(shí)施例的要素可用于本發(fā)明另一方面的各種實(shí)施例中。例如，在此考慮了，取決于一個(gè)獨(dú)立權(quán)利要求的附屬權(quán)利要求項(xiàng)的特征可用于任何其它獨(dú)立權(quán)利要求的設(shè)備和/或方法中。

附圖說明

圖1A描繪吉非替尼(gefitinib)和類似物(APdMG 1和dPEG₂APdMG 2)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖1B描繪通過酰胺鍵直接連接的鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物(Phe-Arg-APdMG 3)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖1C描繪通過dPEG₂間隔基連接的鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物(Phe-Arg-dPEG₂APdMG 4)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖1D描繪通過可降解PABC間隔基連接的鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物(Phe-Lys-PABC-APdMG 5)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖2A到2C顯示鍵聯(lián)基團(tuán)類型。

圖2A描繪Phe-Arg-APdMG將酰胺鍵用于藥物連接。酶類識(shí)別出且結(jié)合二肽序列(Phe-Arg)，隨后水解二肽C端的酰胺鍵，且釋放APdMG 1。

圖2B顯示Phe-Arg-dPEG₂APdMG使用dPEG₂APdMG 2，其在藥物和二肽之間并入10個(gè)原子的較長(zhǎng)PEG間隔基，以增強(qiáng)藥物釋放。

圖2C顯示Phe-Lys-PABC-APdMG在二肽(Phe-Lys)和氨基丙基-dMG之間使用氨基甲酸對(duì)氨基芐酰氧酯(或PABC)間隔基團(tuán)。在經(jīng)酶催化釋放間隔基-藥物后，間隔基自藥物中自發(fā)地分解。

圖3A到3C為自鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體中經(jīng)酶(胰蛋白酶)催化的代表性藥物釋放。數(shù)據(jù)表明APdMG和dPEG₂APdMG自構(gòu)筑體中釋放。在括弧中表明保留時(shí)間。在10mM磷酸鹽緩沖液(7.2pH值)中，在37℃下進(jìn)行胰蛋白酶試驗(yàn)。

圖3A顯示Phe-Arg-APdMG 3(頂部)和60min的Phe-Arg-APdMG+胰蛋白酶(底部)的LCMS數(shù)據(jù)。

圖3B顯示Phe-Arg-dPEG₂-APdMG 4(頂部)和10min的Phe-Arg-dPEG₂-APdMG+胰蛋白酶(底部)的LCMS數(shù)據(jù)。

圖3C顯示Phe-Arg-PABC-APdMG 5(頂部)和10min的Phe-Arg-PABC-APdMG+胰蛋白酶(底部)的LCMS數(shù)據(jù)。

圖4A和4B顯示自由鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體Phe-Arg-APdMG、Phe-Arg-dPEG₂APdMG和Phe-Lys-PABC-APdMG的活體外藥物釋放試驗(yàn)，其通過HPLC在348nm處隨時(shí)間推移而監(jiān)測(cè)。自由藥物％為釋放的藥物除以在348nm處測(cè)定的初始鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體的藥物負(fù)荷。

圖4A描繪用胰蛋白酶處理的自由鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體。在10mM磷酸鹽緩沖液(7.2pH值)中，在37℃下進(jìn)行胰蛋白酶試驗(yàn)。

圖4B描繪用組織蛋白酶B處理的自由鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體。在25mM乙酸鈉緩沖液(5.0pH值)中進(jìn)行組織蛋白酶B試驗(yàn)。

圖5A和5B顯示在胰蛋白酶存在下自NDC的活體外藥物釋放的代表性HPLC圖譜。用胰蛋白酶處理NDC，隨后在5和120min后通過HPLC進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)表明化合物2或3自碳點(diǎn)(C'dots)釋放。在10mM磷酸鹽緩沖液(7.2pH值)中，在37℃下進(jìn)行胰蛋白酶試驗(yàn)。在348nm處進(jìn)行HPLC分析。

圖5A顯示NDC 6的HPLC圖譜。

圖5B顯示NDC 7的HPLC圖譜。

圖6A和6B描繪在酶類存在下自NDC的活體外藥物釋放。通過HPLC在348nm處隨時(shí)間推移監(jiān)測(cè)酶反應(yīng)。在10mM磷酸鹽緩沖液(7.2pH值)中，在37℃下進(jìn)行胰蛋白酶試驗(yàn)；在25mM乙酸鈉緩沖液(5.0pH值)中，在37℃下進(jìn)行組織蛋白酶B試驗(yàn)。

圖6A顯示用胰蛋白酶處理的碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-Phe-Arg-dPEG₂APdMG 6的藥物釋放。

圖6B顯示用組織蛋白酶B處理的碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-Phe-Lys-PABC-APdM 7的藥物釋放。

圖7顯示用吉非替尼、碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-Phe-Arg-dPEG₂APdMG 6和碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-Phe-Lys-PABC-APdMG 7處理的H1650細(xì)胞的西方墨點(diǎn)分析。在指定濃度下用吉非替尼或指定NDC處理細(xì)胞達(dá)18小時(shí)，隨后用EGF(50ng/mL)處理達(dá)5分鐘(pEGFR-磷酸化EGFR；tEGFR-總EGFR)。

圖8顯示碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-Phe-Arg-dPEG₂-Gly-D-Tyr(¹³¹I)-APdMG 8的放射性GPC。基于峰積分>90％的放射性化學(xué)產(chǎn)率。推測(cè)更小峰為殘余自由¹³¹I。

圖9A和9B顯示鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體Phe-Arg-dPEG₂-D-Tyr-氨基丙基-dMG和Phe-Lys-PABC-D-Tyr-氨基丙基-dMG，其將d-酪氨酸殘基與藥物組分合并以連接放射性標(biāo)記(化合物23和24)。

圖10顯示流程1，其說明自納米粒子藥物結(jié)合物(NDC)的酶介導(dǎo)的藥物釋放。

圖11顯示流程2，其說明碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-mal與鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體Phe-Arg-dPEG2APdMG 4和Phe-Lys-PABC-APdMG 5反應(yīng)，產(chǎn)生NDC碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-Phe-Arg-dPEG₂APdMG 6和碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-Phe-Lys-PABC-APdMG 7。

圖12顯示流程3，其說明APdMG 1的合成過程。

圖13顯示流程4，其說明dPEG₂APdMG 2的合成過程。

圖14顯示流程5，其說明Phe-Arg-APdMG 3和Phe-Arg-dPEG₂APdMG 4的合成過程。

圖15顯示流程6，其說明Phe-Lys-PABC-APdMG(5)的合成過程。

圖16A到16D顯示mal-PEG-碳點(diǎn)以及NDC 6和7的特性描述。

圖16A顯示在348nm處的分析性C18反相HPLC。

圖16B顯示TEM圖像。

圖16C顯示吸光度和發(fā)射光譜。

圖16D顯示FCS相關(guān)性曲線。

本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)將自以下在結(jié)合圖式時(shí)所闡述的詳細(xì)描述變得更顯而易見，其中相似參考符號(hào)始終標(biāo)識(shí)對(duì)應(yīng)要素。在圖式中，相似參考標(biāo)號(hào)通常表明相同、功能上相似和/或結(jié)構(gòu)上相似的要素。

定義

為了使本發(fā)明更容易理解，在下文首先對(duì)某些術(shù)語進(jìn)行定義。在整個(gè)說明書中闡述以下術(shù)語和其它術(shù)語的其它定義。

在本申請(qǐng)案中，除非另外說明，否則使用“或”意味著“和/或”。如本申請(qǐng)案中所使用，術(shù)語“包含(comprise)”和所述術(shù)語的變體，諸如“包含(comprising、comprises)”并不意欲排除其它添加劑、組分、整數(shù)或步驟。如本申請(qǐng)案中所使用，術(shù)語“約”和“大約”用作等效物。在存在或不存在約/大約的情況下，用于本申請(qǐng)案中的任何數(shù)值皆意味著涵蓋相關(guān)領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所了解的任何正常波動(dòng)。

在某些實(shí)施例中，除非另行說明或另外自上下文顯而易見，否則術(shù)語“大約”或“約”是指落入所述參考值的任一方向(大于或小于)25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的一系列值(除了其中此等數(shù)值將超過100％的可能值)。

術(shù)語“投與”是指將物質(zhì)引入至個(gè)體中。一般來說，可使用任何投與途徑，包括例如不經(jīng)腸(例如，靜脈內(nèi))、口服、局部、皮下、經(jīng)腹膜、動(dòng)脈內(nèi)、吸入、經(jīng)陰道、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、引入至腦脊髓液中或滴注至身體區(qū)室中。在一些實(shí)施例中，投與為口服。另外或或者，在一些實(shí)施例中，投與為不經(jīng)腸投與。在一些實(shí)施例中，投與為靜脈內(nèi)投與。

術(shù)語“試劑”是指任何化學(xué)類別的化合物或?qū)嶓w，包括例如多肽、核酸、醣類、脂質(zhì)、小分子、金屬或其組合。如將自上下文而明確，在一些實(shí)施例中，試劑可為或包含細(xì)胞或生物體、或其部分、提取物或組分。在一些實(shí)施例中，因?yàn)樵噭┰谧匀恢邪l(fā)現(xiàn)和/或從自然中獲得，所以試劑為或包含天然產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，因?yàn)樵噭┦峭ㄟ^人手的行為所設(shè)計(jì)、工程化和/或制造，且/或并非在自然中發(fā)現(xiàn)，所以試劑為或包含一或多種人造實(shí)體。在一些實(shí)施例中，可以分離或純凈形式使用試劑；在一些實(shí)施例中，可以粗產(chǎn)物形式使用試劑。在一些實(shí)施例中，提供潛在試劑作為集合或庫(kù)，例如可對(duì)其進(jìn)行篩查以識(shí)別或特性化其中的活性劑。一些可使用的試劑的具體實(shí)施例包括小分子、抗體、抗體片段、適體、siRNA、shRNA、DNA/RNA混合物、反義寡核苷酸、核酶、肽、肽模擬物、肽核酸、小分子等。在一些實(shí)施例中，試劑為或包含聚合物。在一些實(shí)施例中，試劑含有至少一種聚合部分。在一些實(shí)施例中，試劑包含治療劑、診斷劑和/或藥物。

術(shù)語“肽”或“多肽”是指通過肽鍵鍵聯(lián)在一起的至少兩種(例如，至少三種)氨基酸的鏈帶。在一些實(shí)施例中，多肽包含天然產(chǎn)生的氨基酸；或者或另外，在一些實(shí)施例中，多肽包含一或多種非天然氨基酸(即，自然界中不存在但可并入到多肽鏈中的化合物；參見，例如http://www.cco.caltech.edu/～dadgrp/Unnatstruct.gif，其顯示已成功并入到官能離子通道中的非天然氨基酸的結(jié)構(gòu))，和/或可作為替代方案使用的本領(lǐng)域中已知的氨基酸類似物)。在一些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)中的氨基酸中的一或多者可例如通過添加諸如碳水化合物基團(tuán)、磷酸基、法呢基、異法呢基、脂肪酸基團(tuán)、用于結(jié)合的鍵聯(lián)基團(tuán)、官能化或其它改質(zhì)等進(jìn)行改質(zhì)。

如本文所使用，術(shù)語“相連”通常是指兩種或多于兩種實(shí)體彼此在物理上直接或間接地接近(例如，經(jīng)由充當(dāng)鍵聯(lián)基團(tuán)的一或多種其它實(shí)體)，以形成足夠穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，以使實(shí)體在相關(guān)條件，例如生理?xiàng)l件下保持物理上接近。在一些實(shí)施例中，相連部分彼此共價(jià)鍵聯(lián)。在一些實(shí)施例中，相連實(shí)體為非共價(jià)鍵聯(lián)。在一些實(shí)施例中，相連實(shí)體通過特定非共價(jià)相互作用彼此鍵聯(lián)(即，通過相互作用配位體之間的相互作用，其辨別其相互作用搭配物和使用上下文中所存在的其它實(shí)體，諸如抗生蛋白鏈菌素/抗生物素蛋白相互作用、抗體/抗原相互作用等)。或者或另外，足夠數(shù)量的較弱非共價(jià)相互作用可為部分提供足夠穩(wěn)定性以保持相連。例示性非共價(jià)相互作用包括(但不限于)靜電相互作用、氫鍵結(jié)、親和力、金屬配位、物理吸附、主體-客體相互作用、疏水性相互作用、π堆疊相互作用、凡得瓦爾力(van der Waals)相互作用、磁性相互作用、靜電相互作用、偶極-偶極相互作用等。

如本文所使用，“生物可降解”材料為當(dāng)引入至細(xì)胞中時(shí)，通過細(xì)胞機(jī)制(例如，酶降解)分解或通過水解成為細(xì)胞可再使用或處理的組分，且不對(duì)細(xì)胞造成顯著毒性作用的那些材料。在某些實(shí)施例中，由生物可降解材料分解所產(chǎn)生的組分不會(huì)在活體內(nèi)誘發(fā)發(fā)炎和/或其它不良作用。在一些實(shí)施例中，生物可降解材料以酶促方式分解?；蛘呋蛄硗?，在一些實(shí)施例中，生物可降解材料通過水解分解。在一些實(shí)施例中，生物可降解聚合材料分解成為其組份聚合物。在一些實(shí)施例中，生物可降解材料(包括例如生物可降解聚合材料)的分解包括酯鍵的水解。在一些實(shí)施例中，材料(包括例如生物可降解聚合材料)的分解包括氨基甲酸酯鍵的裂解。

如本文所使用，“官能性”生物分子為呈顯示其特性化特性和/或活性形式的生物分子。生物分子可具有兩種官能團(tuán)(即，雙官能)或許多官能團(tuán)(即，多官能)。

如本文所使用，術(shù)語“活體外”是指在人工環(huán)境，例如在試管或反應(yīng)器中、在細(xì)胞培養(yǎng)液中等，而非在多細(xì)胞生物體內(nèi)發(fā)生的現(xiàn)象。

如本文所使用，“活體內(nèi)”是指在多細(xì)胞生物體，諸如人類和非人類動(dòng)物內(nèi)發(fā)生的現(xiàn)象。在基于細(xì)胞的系統(tǒng)的情況下，所述術(shù)語可用于指代在活細(xì)胞(與例如活體外系統(tǒng)相反)內(nèi)發(fā)生的現(xiàn)象。

如本文所使用，術(shù)語“成像劑”是指任何元素、分子、官能團(tuán)、化合物、其片段或部分，其有助于檢測(cè)與其連接的試劑(例如，多醣納米粒子)。成像劑的實(shí)例包括(但不限于)：各種配位體、放射性核素(例如，³H、¹⁴C、¹⁸F、¹⁹F、³²P、³⁵S、¹³⁵I、¹²⁵I、¹²³I、⁶⁴Cu、¹⁸⁷Re、¹¹¹In、⁹⁰Y、^99mTc、¹⁷⁷Lu、⁸⁹Zr等)、熒光染料(針對(duì)特定例示性熒光染料，參見下文)、化學(xué)發(fā)光劑(諸如吖啶酯、穩(wěn)定化二氧雜環(huán)丁烷及類似者)、生物發(fā)光劑、光譜可解析無機(jī)熒光半導(dǎo)體納米晶體(即，量子點(diǎn))、金屬納米粒子(例如，金、銀、銅、鉑等)納米簇、順磁金屬離子、酶類(針對(duì)酶類的特定實(shí)例，參見下文)、色度標(biāo)記(諸如染料、膠態(tài)金及類似者)、生物素、地高辛(digoxigenin)、半抗原和抗血清或單株抗體可適用的蛋白質(zhì)。

如本文所使用，術(shù)語“納米粒子”是指直徑小于1000納米(nm)的粒子。在一些實(shí)施例中，如由美國(guó)國(guó)家科學(xué)基金會(huì)(National Science Foundation)定義，納米粒子具有小于300nm的直徑。在一些實(shí)施例中，如由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)定義，納米粒子具有小于100nm的直徑。在一些實(shí)施例中，納米粒子為微胞，因?yàn)槠浒ㄟ^微胞膜自主體溶液分離的閉合區(qū)室，其通常包括包圍且圍封空間或區(qū)室的兩親實(shí)體(例如，以定義內(nèi)腔)。在一些實(shí)施例中，微胞膜包括至少一種聚合物，諸如生物兼容性和/或生物可降解聚合物。

如本文所使用，術(shù)語“個(gè)體”包括人類和哺乳動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠、豬、貓、狗和馬)。在許多實(shí)施例中，個(gè)體為哺乳動(dòng)物，尤其是靈長(zhǎng)類動(dòng)物，尤其是人類。在一些實(shí)施例中，個(gè)體為家畜，諸如牛、綿羊、山羊、奶牛、豬及類似者；家禽，諸如雞、鴨、鵝、火雞及類似者；和家養(yǎng)動(dòng)物，尤其是寵物，諸如狗和貓。在一些實(shí)施例中(例如，尤其在研究背景中)，個(gè)體哺乳動(dòng)物將為例如嚙齒動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠)、兔、靈長(zhǎng)類動(dòng)物或豬，諸如近交豬及類似者。

如本文所使用，術(shù)語“治療(treatment)”(亦為“治療(treat)”或“治療(treating)”)是指物質(zhì)的任何投與，其部分或完全地緩解、改善、減輕、抑制一或多種癥狀、特征和/或具體疾病、病癥和/或病況的病因、延緩其發(fā)作、降低其嚴(yán)重性和/或減小其發(fā)病率。此類治療可為對(duì)并未顯示相關(guān)疾病、病癥和/或病況的征象的個(gè)體的治療，和/或?qū)H顯示疾病、病癥和/或病況的早期征象的個(gè)體的治療?；蛘呋蛄硗猓祟愔委熆蔀閷?duì)顯示相關(guān)疾病、病癥和/或病況的一或多種確定征象的個(gè)體的治療。在一些實(shí)施例中，治療可為對(duì)已診斷為患有相關(guān)疾病、病癥和/或病況的個(gè)體的治療。在一些實(shí)施例中，治療可為對(duì)已知具有一或多種在統(tǒng)計(jì)學(xué)上與相關(guān)疾病、病癥和/或病況發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)的易感性因素的個(gè)體的治療。

具體實(shí)施方式

本文描述納米粒子藥物結(jié)合物(NDC)，其在某些實(shí)施例中包含具有共價(jià)連接的藥物分子/部分的無毒、多形態(tài)、經(jīng)臨床證實(shí)的基于二氧化硅的納米粒子平臺(tái)。納米粒子藥物結(jié)合物(NDC)顯示出成像能力和通過腎臟有效清除的靶向配位體。此外，結(jié)合物并入治療劑用于癌癥檢測(cè)、預(yù)防和/或治療。例如，已合成含有特定受體酪氨酸激酶(RTK)抑制劑的NDC，且其展現(xiàn)以控制和可預(yù)測(cè)方式釋放藥物化合物。此外，西方墨點(diǎn)分析顯示細(xì)胞中RTK磷酸化水平降低，表明基于NDC的活體外藥物傳遞。

在一些實(shí)施例中，基于二氧化硅的納米粒子平臺(tái)包含超小納米粒子或“碳點(diǎn)”，其是可控制直徑低至10nm范圍、具有一系列模塊化官能團(tuán)的熒光、有機(jī)二氧化硅核-殼型粒子。碳點(diǎn)由美國(guó)專利第8298677B2號(hào)“基于二氧化硅的熒光納米粒子(Fluorescent silica-based nanoparticles)”、美國(guó)公開案第2013/0039848A1號(hào)“基于二氧化硅的熒光納米粒子(Fluorescent silica-based nanoparticles)”和美國(guó)公開案第US 2014/0248210 A1號(hào)“基于二氧化硅的多模態(tài)納米粒子(Multimodal silica-based nanoparticles)”來描述，所述專利的內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中。并入到核心的二氧化硅基質(zhì)中的是近紅外染料分子，諸如Cy5.5，其提供其獨(dú)特的光學(xué)特性。包圍核心的是二氧化硅層或二氧化硅殼。二氧化硅表面用硅烷基-聚乙二醇(PEG)基團(tuán)進(jìn)行改質(zhì)，以增強(qiáng)在水性和生物學(xué)上相關(guān)的條件中的穩(wěn)定性。已對(duì)此等粒子進(jìn)行活體內(nèi)評(píng)估，且主要由于其尺寸和惰性表面，其顯示出極佳清除特性。并入到碳點(diǎn)中的其它官能性為化學(xué)感測(cè)、非光學(xué)(PET)圖像對(duì)比度和活體外/活體內(nèi)靶向能力，使其能夠用于可視化淋巴結(jié)用于手術(shù)應(yīng)用和癌癥中的黑素瘤檢測(cè)中。

碳點(diǎn)因其物理特性以及展現(xiàn)出的人類活體內(nèi)特性而為藥物傳遞提供獨(dú)特平臺(tái)。在保持所要清除和藥物動(dòng)力學(xué)特性的同時(shí)，此等粒子為超小的，且受益于腫瘤微環(huán)境中的EPR效應(yīng)。為此目的，本文描述一種納米粒子藥物傳遞系統(tǒng)，其中在某些實(shí)施例中，藥物構(gòu)筑體共價(jià)連接到碳點(diǎn)(或其它納米粒子)。用于藥物傳遞的基于碳點(diǎn)的NDC提供良好生物穩(wěn)定性、使過早藥物釋放降至最低且顯示出生物活性化合物的控制釋放。在某些實(shí)施例中，基于肽的鍵聯(lián)基團(tuán)用于NDC應(yīng)用。這些鍵聯(lián)基團(tuán)在抗體和聚合物的情況下，活體外和活體內(nèi)皆為穩(wěn)定的，其具有依賴于通過溶酶體蛋白酶進(jìn)行酶催化水解的高度可預(yù)測(cè)釋放動(dòng)力學(xué)。例如，可使用組織蛋白酶B(一種在溶酶體中高度表現(xiàn)的蛋白酶)以促進(jìn)藥物自大分子釋放。通過在大分子主鏈與藥物分子之間并入短、對(duì)蛋白酶敏感的肽，可在酶存在下獲得藥物的控制釋放。

在某些實(shí)施例中，NDC為超小的(例如，平均直徑為約5nm到約10nm，(例如，約6nm))且使用對(duì)酶敏感的鍵聯(lián)基團(tuán)，例如其中通過蛋白酶催化藥物釋放。在一個(gè)例子中，對(duì)吉非替尼，一種重要表皮生長(zhǎng)因子受體突變體(EGFRmt+)-酪氨酸激酶抑制劑(TKI)癌癥藥物，進(jìn)行改質(zhì)且將其并入到粒子上。所得NDC顯示出極佳活體外穩(wěn)定性、可溶性，且被證明在EGFRmt+-表現(xiàn)NSCLC細(xì)胞中為活性的。

在某些實(shí)施例中，NDC包含一或多種靶向部分，例如以瞄準(zhǔn)特定組織類型(例如，特定腫瘤)。具有靶向部分的NDC增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞中藥物的內(nèi)化(例如，靶向配位體結(jié)合到腫瘤細(xì)胞上的受體上，和/或?qū)⑺幬飩魉偷侥[瘤細(xì)胞中(例如，通過提高的滲透性))。例如，為了制造具有其它靶向部分的粒子治療劑(例如，cRGD)，將二氧化硅納米粒子添加到cRGDY-PEG結(jié)合物與順丁烯二酰亞胺雙官能化PEG的混合物中。順丁烯二酰亞胺雙官能化PEG支持藥物-鍵聯(lián)基團(tuán)結(jié)合物的其它連接，以制造診療一體化產(chǎn)品。

在一些實(shí)施例中，超小粒子可與PET標(biāo)記和/或光學(xué)探針相連?？稍诨铙w內(nèi)觀測(cè)納米粒子(例如，經(jīng)由PET)，以評(píng)估靶向部位中的藥物累積。例如，可首先投與具有PET標(biāo)記(例如，在無藥物物質(zhì)的情況下)的納米粒子。隨后，通過分析納米粒子的活體內(nèi)PET圖像，可估算腫瘤中的藥物(例如，結(jié)合有納米粒子)濃度和累積率?；谒@得的估算量可確定劑量，以提供個(gè)體化用藥(例如，腫瘤尺寸而非患者體重)。在一些實(shí)施例中，可對(duì)受到放射性標(biāo)記的藥物進(jìn)行活體內(nèi)追蹤。如果未靶向高度濃縮的化學(xué)治療藥物，那么所述藥物具有潛在危險(xiǎn)。在一些實(shí)施例中，具有光學(xué)探針的納米粒子(例如，熒光團(tuán))可用于手術(shù)中成像(例如，當(dāng)暴露組織/腫瘤的表面時(shí))和/或腫瘤的活組織檢查。

可獨(dú)立地對(duì)治療劑和納米粒子進(jìn)行放射性標(biāo)記或光學(xué)標(biāo)記，從而允許獨(dú)立監(jiān)測(cè)治療劑和納米粒子。在一個(gè)實(shí)施例中，放射性氟化(即，¹⁸F)達(dá)沙替尼(dasatinib)經(jīng)由NHS酯鍵與連接到納米粒子上的PEG-3400部分偶合。放射性氟對(duì)于能夠獨(dú)立地監(jiān)測(cè)藥物自放射性碘標(biāo)記C24I)熒光(Cy5)納米粒子的分布和釋放中的時(shí)間依賴性變化來說為至關(guān)重要的。以此方式，可監(jiān)測(cè)前藥物(達(dá)沙替尼)和納米粒子。相較于不使用雙重標(biāo)記方法的先前技術(shù)中的方法，此準(zhǔn)許前藥設(shè)計(jì)的最佳化。在另一實(shí)施例中，放射治療性碘分子(例如，¹³¹I)或其它治療性γ或α發(fā)射體經(jīng)由順丁烯二酰亞胺官能團(tuán)與PEG結(jié)合，其中治療劑可能不在活體內(nèi)自PEG解離。

NDC為通過分子鍵聯(lián)基團(tuán)共價(jià)連接到碳點(diǎn)納米粒子(或其它納米粒子)的藥物化合物。在某些實(shí)施例中，鍵聯(lián)基團(tuán)并入對(duì)胰蛋白酶(對(duì)照酶)和/或組織蛋白酶B敏感的肽(例如，二肽)序列，所述酶主要是在細(xì)胞溶酶體中發(fā)現(xiàn)的酶。針對(duì)控制藥物釋放，本文中描述了包含兩種類別的鍵聯(lián)基團(tuán)化學(xué)物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)：其一者在鍵聯(lián)基團(tuán)與藥物之間并入酰胺鍵；且另一者在鍵聯(lián)基團(tuán)與藥物之間使用可降解部分。在一些實(shí)施例中，鍵聯(lián)基團(tuán)經(jīng)設(shè)計(jì)以在特定條件，例如蛋白水解下自納米粒子(例如，碳點(diǎn))釋放藥物。

可使用的例示性藥物包括RTK抑制劑，諸如達(dá)沙替尼和吉非替尼，其可靶向通過人類或鼠類源的原發(fā)腫瘤細(xì)胞(例如，高級(jí)神經(jīng)膠瘤的經(jīng)基因工程化小鼠模型、來自人類患者腦部腫瘤外植體的神經(jīng)球)和/或非神經(jīng)源的腫瘤細(xì)胞系所表現(xiàn)的血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)或EGFRmt+?？珊铣蛇_(dá)沙替尼和吉非替尼類似物，以在不擾亂界定活性結(jié)合位點(diǎn)的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)的情況下，能夠?qū)崿F(xiàn)與數(shù)種鍵聯(lián)基團(tuán)的共價(jià)連接。

合成方法得到證實(shí)，且獲得所要鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體和NDC。用于NDC特性描述的HPLC/LCMS方法和酶釋放試驗(yàn)也得到發(fā)展?；铙w外酶藥物釋放試驗(yàn)揭示了NDC設(shè)計(jì)中的許多重要結(jié)構(gòu)因素。例如，使用不同尺寸的PEG鏈，碳點(diǎn)與鍵聯(lián)基團(tuán)之間的間隔會(huì)不同，且揭示碳點(diǎn)與鍵聯(lián)基團(tuán)之間的足夠間隔對(duì)允許酶催化藥物釋放而言為至關(guān)重要的。類似地，同樣發(fā)現(xiàn)鍵聯(lián)基團(tuán)與藥物之間的間隔對(duì)酶介導(dǎo)的釋放而言為至關(guān)重要的。此外，相較于那些使用簡(jiǎn)單酰胺鍵的鍵聯(lián)基團(tuán)設(shè)計(jì)，在鍵聯(lián)基團(tuán)和藥物之間使用可降解部分的鍵聯(lián)基團(tuán)設(shè)計(jì)顯示出明顯更快的釋放動(dòng)力學(xué)。在一些實(shí)施例中，可降解部分可為碳水化合物和/或任何可以酶促方式裂解和/或活化的鍵聯(lián)基團(tuán)。

還進(jìn)行了基于細(xì)胞的試驗(yàn)。針對(duì)原生腦腫瘤細(xì)胞(神經(jīng)球)和/或轉(zhuǎn)移到腦部的腫瘤細(xì)胞系(例如，肺、鱗狀細(xì)胞癌)，測(cè)試并入有達(dá)沙替尼或吉非替尼類似物的鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體和NDC。在暴露于NDC以及自由鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體的細(xì)胞系中，EGFRmt+的磷酸化水平得到降低或消除，且在一些情況下，NDC展現(xiàn)出比天然藥物有效的抑制活性。

一方面，本文描述一種納米粒子藥物結(jié)合物(NDC)，其包含藥物部分、鍵聯(lián)基團(tuán)部分和納米粒子，其中藥物部分經(jīng)由鍵聯(lián)基團(tuán)部分共價(jià)鍵聯(lián)到納米粒子上。在某些實(shí)施例中，NDC在鍵聯(lián)基團(tuán)部分與藥物部分之間包含酰胺鍵和/或可降解部分。在某些實(shí)施例中，鍵聯(lián)基團(tuán)部分包含肽(例如，二肽)。在某些實(shí)施例中，鍵聯(lián)基團(tuán)部分在蛋白酶結(jié)合時(shí)提供C端水解，由此自納米粒子釋放藥物部分。在某些實(shí)施例中，藥物部分包含受體酪氨酸激酶(RTK)抑制劑(例如，達(dá)沙替尼或吉非替尼，包括其任何類似物，例如其任何藥物和/或治療性等效物，其經(jīng)改質(zhì)以在不擾亂藥物部分的活性結(jié)合位點(diǎn)的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)的情況下，連接到鍵聯(lián)基團(tuán)部分)。在某些實(shí)施例中，納米粒子為較新一代碳點(diǎn)。另一方面，本發(fā)明針對(duì)一種檢測(cè)、預(yù)防和/或治療疾病(例如，癌癥)的方法，其包含投與和/或檢測(cè)本文所述實(shí)施例中任一者的NDC。

納米尺寸藥物傳遞媒劑之所以吸引人，是因?yàn)?1)其尺寸小，能夠?qū)崿F(xiàn)在整個(gè)身體中以及在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸；(2)其表面積與體積的比率高，能夠?qū)崿F(xiàn)貨物負(fù)載和釋放；以及(3)其具有可調(diào)節(jié)的表面化學(xué)性質(zhì)，促進(jìn)可溶性、控制結(jié)合并且并入有生物活性官能團(tuán)。

活體內(nèi)納米粒子藥物傳遞充滿了大量生物物理學(xué)和生物化學(xué)挑戰(zhàn)，其可造成粒子吸收(調(diào)理作用)、排泄(腎臟)或非特異性損失(外滲)，且阻止治療性有效負(fù)載到達(dá)所要細(xì)胞。藥物傳遞構(gòu)筑體的關(guān)鍵參數(shù)之一為其物理尺寸，其中較小粒子(例如，小于或等于約5nm流體動(dòng)力直徑的粒子)可不明確外滲，而大得多的粒子或凝集物(例如，大于或等于約500nm直徑的粒子或凝集物)可寄宿在微脈管內(nèi)，而非經(jīng)運(yùn)輸?shù)狡漕A(yù)定目標(biāo)。針對(duì)非生物可降解材料，發(fā)現(xiàn)在限制腎臟清除率以實(shí)現(xiàn)所要藥物動(dòng)力學(xué)時(shí)，優(yōu)選直徑在5nm到10nm范圍內(nèi)，其允許腎臟過濾作為一種粒子去除手段。另外，發(fā)現(xiàn)此尺寸范圍的粒子還可利用增強(qiáng)的滲透和保留(EPR)作用，即因滲漏脈管導(dǎo)致的腫瘤微環(huán)境中的大分子被動(dòng)累積。

例如在某些實(shí)施例中，如美國(guó)公開案第2014/0248210A1號(hào)所描述，在人體中測(cè)試超小(例如，直徑在5nm到10nm范圍內(nèi))粒子，所述公開案的全文通過引用并入本文中。在此實(shí)例中，五位患者未產(chǎn)生不良現(xiàn)象，且試劑在研究期間耐受良好。藥物動(dòng)力學(xué)行為，其表示為每克組織所注射劑量的百分比(％ID/g)對(duì)比注射后時(shí)間和對(duì)應(yīng)平均器官吸收劑量，與針對(duì)其它常用診斷放射性示蹤劑所發(fā)現(xiàn)的藥物動(dòng)力學(xué)行為相當(dāng)。此代表性患者的連續(xù)PET成像顯示假定血池活性自主要器官和組織的進(jìn)展性損失，到注射后(p.i.)72小時(shí)未看到明顯的活性。估算此等患者中的全身清除半衰期在13到21小時(shí)范圍內(nèi)。有趣的是，與許多疏水性分子、蛋白質(zhì)和較大粒子平臺(tái)(大于10nm)相反，在肝臟、脾臟或骨髓中不存在顯著的定位。雖然患者經(jīng)碘化鉀(KI)預(yù)處理以阻斷甲狀腺組織吸收，但相對(duì)于其它組織，在此患者中獲得較高平均吸收甲狀腺劑量。粒子同樣主要通過腎臟經(jīng)腎和膀胱壁(在甲狀腺和腫瘤后，參見下文)排泄，其展現(xiàn)到注射后72小時(shí)最高％ID/g值之一；這常常是通過腎排泄的放射性藥物的情況，膀胱壁得到的平均吸收劑量高于其它主要器官和組織。此等發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了事實(shí)：腎臟而非肝膽排泄是自身體清除的主要途徑。

表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)用于靶向療法。已在10％到35％轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致構(gòu)成性活化的EGFR突變，且盡管EGFR抑制劑對(duì)全身性疾病有效，但藥物傳遞仍限制腦部癌轉(zhuǎn)移的控制。在40％到50％原生多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)中同樣發(fā)現(xiàn)EGFR突變-兩種普遍的腦部癌癥形式。盡管EGFR-酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，諸如吉非替尼，已在臨床前環(huán)境中顯示出前景，但可能由于較差組織或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)穿透和劑量限制毒性，其已展現(xiàn)在腦部癌癥患者中為基本上無效的。

吉非替尼結(jié)合且抑制EGFR的激酶結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)。為了在NDC的情況下使用吉非替尼，至關(guān)重要的是并入不會(huì)明顯干擾藥物與激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)。X射線結(jié)晶學(xué)和SAR研究揭示，用胺替換嗎啉基不會(huì)明顯改變藥物活性，而且為改質(zhì)和最終與碳點(diǎn)的共價(jià)連接提供所需的化學(xué)官能團(tuán)(胺)(圖1A)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例

一個(gè)實(shí)例展現(xiàn)納米粒子藥物結(jié)合物(例如，共價(jià)連接有藥物分子的基于二氧化硅的納米粒子平臺(tái))的例示性合成和其特性描述以及初步生物評(píng)估。

利用去嗎啉基-吉非替尼(dMG)的商業(yè)可用性，通過對(duì)受Boc保護(hù)的氨基丙基溴化物進(jìn)行親核性取代(例如，在一個(gè)步驟中)來獲得所要氨基丙基-dMG(APdMG)，隨后進(jìn)行酸式去除保護(hù)基(圖1A、圖10(流程1))。另外，通過偶合Fmoc-dPEG2-COOH，隨后進(jìn)行堿式去除保護(hù)基步驟，易于自1中獲得吉非替尼類似物2，在下文中進(jìn)一步詳細(xì)描述所述類似物(圖1A、圖11(流程2))。為了確保APdMG 1和dPEG₂APdMG 2針對(duì)EGFR已保留活性，用化合物處理H1650細(xì)胞，且通過西方墨點(diǎn)進(jìn)行分析，以評(píng)估EGFR中的磷酸-Tyr168水平。H1650細(xì)胞為衍生自人類腫瘤的模型非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)株(細(xì)支氣管肺泡癌)，其含有導(dǎo)致受體構(gòu)成性活性的突變EGFR(L858R和ΔE746-A750)。兩種化合物均顯示出類似于吉非替尼的作用，在1和10μM濃度下抑制磷酸-Tyr¹⁶⁸，而dPEG₂APdMG 2顯示出降低的活性。

針對(duì)基于碳點(diǎn)的藥物傳遞，研究了三種鍵聯(lián)基團(tuán)類型(圖1B到1D)。三種鍵聯(lián)基團(tuán)類型包括將蛋白酶用于藥物釋放的二肽序列。蛋白酶識(shí)別且結(jié)合二肽，導(dǎo)致在C端的水解，自鍵聯(lián)基團(tuán)中釋放藥物組份。兩種模型蛋白酶，胰蛋白酶和組織蛋白酶B，用于評(píng)估本文所述的鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體。胰蛋白酶選為代表性絲氨酸蛋白酶。其針對(duì)含有堿性氨基酸，諸如精氨酸和賴氨酸的肽具有高度活性，且裂解此等殘基的C端。組織蛋白酶B為具有較嚴(yán)格的基質(zhì)特異性的半胱氨酸蛋白酶。迄今為止所述最少基質(zhì)共同序列為含有疏水性和堿性殘基的二肽基序。類似于胰蛋白酶，組織蛋白酶B裂解堿性氨基酸的C端。二肽苯丙氨酸-精氨酸(Phe-Arg)和苯丙氨酸-賴氨酸(Phe-Lys)為胰蛋白酶和組織蛋白酶的胰蛋白酶/組織蛋白酶B識(shí)別基序，且包括在鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體中(圖1B到D)。

Phe-Arg-APdMG為用于獲得對(duì)鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體敏感的蛋白酶的方法的實(shí)例(圖2A和2B)。在此設(shè)計(jì)中，將吉非替尼類似物1直接連接到二肽序列的C端。使用固相肽合成(SPPS)方法合成化合物3，隨后用2對(duì)C端進(jìn)行改質(zhì)，且最終進(jìn)行去除保護(hù)基步驟來獲得3(圖11(流程3))。

考慮到藥物組份與二肽基序極為接近，可能阻礙酶結(jié)合和水解鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物的潛在空間問題得到解決。為了增加二肽與藥物之間的距離，對(duì)APdMG 1進(jìn)行改質(zhì)，以獲得dPEG₂APdMG 2(圖13，(流程4))。二肽組份和dPEG₂APdMG 2之間進(jìn)行偶合反應(yīng)，隨后進(jìn)行去除保護(hù)基步驟，得到Phe-Arg-dPEG₂APdMG 4，即在Phe-Arg與吉非替尼類似物之間含有10個(gè)原子的短鏈PEG間隔基的鍵聯(lián)基團(tuán)藥物構(gòu)筑體。

為了在不對(duì)APdMG 1造成結(jié)構(gòu)改變的情況下保留二肽與藥物組分之間增加的間隔，合成Phe-Lys-PABC-APdMG 5。此鍵聯(lián)基團(tuán)在肽和藥物之間并入自分解氨基甲酸對(duì)氨基芐氧酯(PABC)基團(tuán)(圖1D和2A到2C)。在酶水解時(shí)，此基團(tuán)進(jìn)一步分解成對(duì)氨基苯甲基醇和CO₂，由此釋放APdMG。以Fmoc-Lys(Mtt)-OH開始化合物5的合成(圖13(流程6))。用對(duì)氨基苯甲基醇對(duì)受保護(hù)的氨基酸進(jìn)行改質(zhì)，得到Fmoc-Lys(Mtt)-PABA 18。在去除Fmoc基團(tuán)且與Fmoc-Phe-OH偶合時(shí)，形成受保護(hù)的二肽Fmoc-Phe-Lys(Mtt)-PABA19。隨后用對(duì)硝基苯酚碳酸鹽氯化物活化-PABA的自由羥基，產(chǎn)生活化碳酸鹽20，其隨后與APdMG 1反應(yīng)，產(chǎn)生化合物21。在一輪去除保護(hù)基和偶合后，獲得化合物22。最終去除保護(hù)基步驟需要酸性條件。但是，氨基甲酸對(duì)氨基芐氧酯基團(tuán)本身在此類條件(例如，酸性條件)下容易發(fā)生分解。發(fā)現(xiàn)足夠溫和的條件(例如，0.5％TFA)以自賴氨酸中去除Mtt基團(tuán)且自封端硫醇中去除Mmt基團(tuán)，同時(shí)保留鍵聯(lián)基團(tuán)，以獲得所要產(chǎn)物16。掩蔽賴氨酸側(cè)鏈的Mtt基團(tuán)較適用于此整體合成方法，因?yàn)槠湓趯?duì)硝基苯酚碳酸鹽氯化物存在下為穩(wěn)定的，但在溫和酸性條件下對(duì)去除而言為不穩(wěn)定的。此與在對(duì)硝基苯酚碳酸鹽氯化物存在下易于去除的更為常用的超不穩(wěn)定Mmt基團(tuán)(其用于賴氨酸側(cè)鏈保護(hù))形成對(duì)比。

為了評(píng)估三種鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體，對(duì)化合物3到5進(jìn)行酶促水解(表1、圖3A到3C、4A和4B。)將藥物-鍵聯(lián)基團(tuán)構(gòu)筑體與胰蛋白酶或組織蛋白酶B一起培育，且通過HPLC或LCMS監(jiān)測(cè)反應(yīng)。針對(duì)所有三種構(gòu)筑體，胰蛋白酶為活性的：到60min觀測(cè)到Phe-Arg-APdMG 3的完全水解，其產(chǎn)生APdMG 1；僅到10min，觀測(cè)到dPEG₂APdMG 2自Phe-Arg-dPEG₂APdMG 4的完全釋放和APdMG 1自Phe-Lys-PABC-APdMG 5的釋放。但是，當(dāng)用組織蛋白酶B處理構(gòu)筑體時(shí)，對(duì)于Phe-Arg-APdMG 3觀測(cè)不到水解，同時(shí)Phe-Arg-dPEG₂APdMG 4完全水解，導(dǎo)致dPEG₂APdMG 2的釋放。

下文表1說明通過藥物釋放試驗(yàn)所獲得的鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體半衰期。

表1

NH-無水解

^a如通過HPLC在348nm處所測(cè)定，50％藥物自鍵聯(lián)基團(tuán)或粒子中釋放的時(shí)間。

對(duì)化合物3到5進(jìn)行活體外試驗(yàn)，以獲得藥物釋放圖譜，且在不同時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)構(gòu)筑體的酶介導(dǎo)的水解(圖4A和4B)。對(duì)于Phe-Arg-APdMG 3，50％藥物APdMG 1在9min內(nèi)釋放，而Phe-Arg-dPEG₂APdMG 4明顯更快，在2min內(nèi)釋放50％藥物?；衔?同樣快速，對(duì)于50％藥物釋放，其需要小于1min。在組織蛋白酶B存在下，因?yàn)槲从^測(cè)到藥物釋放，所以Phe-Arg-APdMG 3經(jīng)證明為較差基質(zhì)。對(duì)于Phe-Arg-dPEG₂APdMG 4，50％藥物在110min內(nèi)釋放。對(duì)于50％藥物，Phe-Lys-PABC-APdMG 5需要<1min，表明其對(duì)于酶而言為高效基質(zhì)。

對(duì)于胰蛋白酶和組織蛋白酶B二者，三種鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體的藥物釋放速率遵循相同大體趨勢(shì)：Phe-Lys-PABC-APdMG 5>Phe-Arg-dPEG₂APdMG 4>Phe-Arg-APdMG3(最快到最慢)。Phe-Arg-APdMG 3和Phe-Arg-dPEG₂APdMG 4的結(jié)果表明藥物與二肽單元的接近度影響酶活性和藥物釋放。當(dāng)通過併入10原子PEG基團(tuán)使藥物與二肽之間的間隔(距離)增加時(shí)，水解(藥物釋放)得到增強(qiáng)。通過不能夠水解構(gòu)筑體3的組織蛋白酶B，最顯著地觀測(cè)到此作用。但是，通過在藥物與二肽4之間并入10原子PEG間隔基，則觀測(cè)到水解和藥物釋放。

合成順丁烯二酰亞胺官能化碳點(diǎn)(碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-mal)來制備NDC。制備用Cy5熒光團(tuán)改質(zhì)的硅烷，且用四甲基正硅烷(TMOS)滴定到NH₄OH稀釋溶液中(摩爾比：TMOS:Cy5:NH3:H₂O為1:0.001:0.44:1215)，且使其混合達(dá)24小時(shí)(浦田C(Urata C),青山Y(jié)(Aoyama Y),利根川進(jìn)A(Tonegawa A),山內(nèi)Y(Yamauchi Y),黑田K(Kuroda K).用于去除表面活性劑以形成膠態(tài)間隙孔二氧化硅納米粒子的透析方法(Dialysis process for the removal of surfactants to form colloidal mesoporous silica nanoparticles).化學(xué)通訊(Chem Commun，Camb).2009；(34):5094-6)(山田H(Yamada H),浦田C(Urata C),青山Y(jié)(Aoyama Y),長(zhǎng)田S(Osada S),山內(nèi)Y(Yamauchi Y),黑田K(Kuroda K).制備具有不同直徑的膠態(tài)間隙孔二氧化硅納米粒子和其在靜態(tài)水性系統(tǒng)中的獨(dú)特降解行為(Preparation of Colloidal Mesoporous Silica Nanoparticles with Different Diameters and Their Unique Degradation Behavior in Static Aqueous Systems),化學(xué)材料(Chem.Mater).2012；24(8):1462-71.)(王J(Wang J),菅原-鳴瀧A(Sugawara-Narutaki A),深尾M(Fukao M),橫井T(Yokoi T),下島A(Shimojima A),大久保T(Okubo T).用胺或氨催化劑兩相合成單分散二氧化硅納米球和其控制自組裝(Two-phase synthesis of monodisperse silica nanospheres with amines or ammonia catalyst and their controlled self-assembly).ACS應(yīng)用材料交界(ACS Appl Mater Interfaces).2011；3(5):1538-44.)。此產(chǎn)生Cy5囊封二氧化硅粒子，通過用PEG-硅烷(500g/mol)(鈴木K(Suzuki K),碇K(Ikari K),今井H(Imai H).使用雙表面活性劑系統(tǒng)合成具有良序中孔結(jié)構(gòu)的二氧化硅納米粒子(Synthesis of silica nanoparticles having a well-ordered mesostructured using a double surfactant system).美國(guó)化學(xué)會(huì)志(J Am Chem Soc).2004；126(2):462-3.)和順丁烯二酰亞胺-PEG-硅烷(摩爾比：PEG-硅烷:TMOS:mal-PEG-硅烷為1:2.3:0.006)處理，用順丁烯二酰亞胺基團(tuán)使所述二氧化硅粒子表面進(jìn)一步聚乙二醇化且官能化。48小時(shí)后，通過凝膠過濾來透析、過濾和純化反應(yīng)混合物。分別通過熒光相關(guān)度光譜測(cè)定(FCS)、透射電子顯微法(TEM)和直徑、形態(tài)以及整體純度的分析性HPLC使納米粒子特性化。所得碳點(diǎn)直徑小于10nm，具有狹窄的粒度分布(圖16A到16D)。

通過將Phe-Arg-dPEG₂APdMG(4)和Phe-Lys-PABC-APdMG(5)添加到碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-mal中以使構(gòu)筑體上的封端硫醇與粒子上的順丁烯二酰亞胺基團(tuán)反應(yīng)來獲得并入鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物4和5(例如，碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-Phe-Arg-dPEG₂APdMG(6)和碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-Phe-Lys-PABC-APdMG(7))的NDC(流程2)。遵循通過凝膠過濾純化來分離NDC產(chǎn)物，且獲得NDC 6和7，且通過TEM和HLPC使其特性化(圖16A和圖16B)。分析性HPLC用于評(píng)估污染物的存在以及測(cè)定每粒子藥物分子的數(shù)量或藥物與粒子比率(DPR)(表2)。由于Cy5嵌入在碳點(diǎn)內(nèi)，所以可易于在348nm處測(cè)量吉非替尼類似物的濃度，同時(shí)可在650nm處獲得粒子濃度。盡管平均DPR經(jīng)證明為適中的，但NDC顯示出可測(cè)量的不均勻性，其中DPR估計(jì)值的范圍為小于1到大于15。因?yàn)榧翘婺犷愃莆锏妮^差可溶性，所以本可預(yù)料到沉淀，但未觀測(cè)到NDC沉淀。FCS用于評(píng)估因鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物結(jié)合而導(dǎo)致的粒度中的變化。如表2中顯示，NDC在基質(zhì)mal-碳點(diǎn)上顯示最小直徑增加量。

下文表2說明納米粒子特性描述的概述。

表2

DPR-藥物與粒子的比率

^a通過FCS測(cè)定

^b通過HPLC測(cè)定

為碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-Phe-Arg-dPEG₂APdMG和碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-Phe-Lys-PABC-APdMG測(cè)量隨時(shí)間推移的酶依賴性藥物釋放，以獲得活體外藥物釋放圖譜(圖6A和6B)。圖5A和5B中顯示代表性HPLC數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)展現(xiàn)使用胰蛋白酶的藥物釋放。對(duì)于胰蛋白酶而言，NDC 6和7為極佳基質(zhì)，其分別需要44min和6min以實(shí)現(xiàn)50％藥物釋放(圖6A、表1)。在組織蛋白酶B存在下，兩種NDC的釋放動(dòng)力學(xué)顯著減慢：NDC 6在560min內(nèi)實(shí)現(xiàn)50％藥物釋放，且NDC 7在510min內(nèi)內(nèi)實(shí)現(xiàn)50％藥物釋放(圖6B、表1)。綜合而言，數(shù)據(jù)展現(xiàn)粒子表面上鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體的可獲取性，其導(dǎo)致藥物組分的控制釋放。

在37℃下在酸性和中性pH值(5.0和7.2)下，在含水條件下評(píng)估NDC的穩(wěn)定性。如通過HPLC所測(cè)量，NDC 6和7到48小時(shí)均顯示無降解或藥物釋放。由于可在活體內(nèi)發(fā)生的可能反向邁克爾(Michael)或硫醇交換反應(yīng)，觀測(cè)到自抗體藥物結(jié)合物的鍵聯(lián)基團(tuán)藥物構(gòu)筑體損失，所以基于硫醇-順丁烯二酰亞胺的結(jié)合引起仔細(xì)檢查。為了評(píng)估在過量硫醇存在下NDC的活體外穩(wěn)定性，在7.2pH值下在37℃下將NDC 7與30mM谷胱甘肽一起培育達(dá)48小時(shí)。48小時(shí)后，小于5％的鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物自碳點(diǎn)分離(表4)。

下文表3說明通過藥物釋放試驗(yàn)所獲得的鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體半衰期。

表3

^a 50％藥物自鍵聯(lián)基團(tuán)或粒子中釋放的時(shí)間。通過HPLC測(cè)定。

下文表4說明NDC穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。

表4

^a 25mM乙酸鈉緩沖液

^b 50mM磷酸鹽緩沖液

^c 10mM谷胱甘肽(減少的)在50mM磷酸鹽緩沖液中

^d DEM，無血清，細(xì)胞處理后18小時(shí)

通過處理H1650細(xì)胞，隨后在EGFR中進(jìn)行磷酸-Tyr¹⁶⁸的西方墨點(diǎn)檢測(cè)，且與吉非替尼進(jìn)行比較來評(píng)估碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-Phe-Arg-dPEG₂APdMG和碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-Phe-Lys-PABC-APdMG的生物活性。將血清饑餓細(xì)胞與每種化合物一起培育達(dá)18小時(shí)時(shí)間段，隨后進(jìn)行EGF刺激。吉非替尼控制顯示EGFR的Tyr¹⁶⁸磷酸化中的劑量依賴性降低，其在1μM處具有完全剝蝕(圖7)。NDCs 6和7同樣顯示劑量依賴性抑制；用NDC 6處理的細(xì)胞在10μM處顯示出磷酸-Tyr¹⁶⁸的可檢測(cè)水平。相比之下，NDC 7顯示出良好活性，在100nM處磷酸-Tyr¹⁶⁸顯著降低，且在1μM NDC濃度下完全剝蝕。考慮到可能發(fā)生過早藥物釋放且導(dǎo)致磷酸-Tyr¹⁶⁸EGFR中所觀測(cè)到的降低的可能性，監(jiān)測(cè)用于此等試驗(yàn)中的NDC的穩(wěn)定性。通過HPLC分析用NDC 6或7(10μM)處理H1650細(xì)胞達(dá)18小時(shí)的媒質(zhì)等分試樣。因?yàn)樵诿劫|(zhì)中未檢測(cè)到自由藥物且NDC無破損，所以證明兩種粒子在此等條件下均為穩(wěn)定的(表3)。除NDC 6和7外，還研究了用于最終活體內(nèi)研究的二級(jí)成像形態(tài)的併入。合成具有Phe-Arg-dPEG₂-D-Tyr-氨基丙基-dMG的鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體，其將D-酪氨酸殘基與藥物組份結(jié)合來連接放射性標(biāo)記(化合物23和24)。制備NDC碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-Phe-Arg-dPEG₂-D-Tyr-APdMG，且在>90％放射化學(xué)純度下用¹³¹I成功地進(jìn)行放射性碘標(biāo)記(圖8)。試劑：

購(gòu)自商業(yè)來源的溶劑和試劑不經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。乙腈、二乙醚、二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸乙酯、己烷、六氟異丙醇(HFIP)、甲醇、二氯甲烷(DCM)和三氟乙酸(TFA)獲自費(fèi)希爾(Fisher)。二甲亞砜(DMSO)、二異丙基乙胺(DIEA)、三乙胺(TEA)、碳酸鉀、N-(叔丁氧基羰基)-氨基丙基溴化物、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS)、正硅酸四甲酯(TMOS)、牛胰蛋白酶和購(gòu)自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)。O-去嗎啉基丙基吉非替尼獲自多倫多研究化工(Toronto Research Chemicals，TRC)。2-(7-氮雜-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HATU)購(gòu)自金斯瑞(Genescript)。氯三苯甲基-樹脂和受保護(hù)的氨基酸(Fmoc-Arg-OH、Fmoc-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-Phe-OH)獲自EMD化工(EMD Chemicals)。Fmoc-N-dPEG₂OH、Mmt-S-dPEG₈-OH、mal-dPEG₁₂-NHS購(gòu)自量子生物科學(xué)(Quanta Biosciences)。Cy5順丁烯二酰亞胺和休珀代克斯(Superdex)200(制備級(jí))獲自通用生命科學(xué)(GE Life Sciences)。DMSO-d和CDCl₃購(gòu)自劍橋同位素(Cambridge Isotopes)。在獲自托維克(Torviq)的聚丙烯燒結(jié)針筒中進(jìn)行固相合成。二氧化硅、TLC板、4g、12g、24g和40g RediSep Rf正相濾筒獲自特利丹伊斯科(Teledyne ISCO)。

快速色譜：

在特利丹伊斯科CombiFlash Rf上使用4g、12g、24g和40g濾筒進(jìn)行正相(硅膠)純化。

分析型HPLC：

在Waters Alliance HPLC系統(tǒng)或Autopure LCMS系統(tǒng)(2767樣品管理器、2996光二極管陣列檢測(cè)器、2420ELS檢測(cè)器、Micromass ZQ、2525二元梯度模塊、管柱流體整理器、515HPLC泵、泵控制模塊II)上，在C4或C18 4.6x 50mm反相XBridge分析柱(Waters)上使用5％到95％乙腈于水中(0.5％TFA)的線性梯度以1.2mL/min使樣品運(yùn)行達(dá)10分鐘。在348nm或650nm處分析樣品。

制備型HPLC：

在Waters制備性系統(tǒng)(2996光二極管陣列檢測(cè)器、2545二元梯度模塊)或Autopure LCMS系統(tǒng)上，在C18 19x 150mm反相XBridge制備性管柱(Waters)上使用5％到95％乙腈于水中(0.5％TFA)的線性梯度以20mL/min純化樣品達(dá)30分鐘。在220或348nm處分析樣品。

核磁共振(NMR)：

在Bruker Ultrashield 500加上獲得¹H-NMR和¹³C-NMR數(shù)據(jù)。

使用胰蛋白酶的藥物釋放試驗(yàn)：

用25μM NDC(例如，6或7)或自由鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物(例如，3、4或5)和200nM胰蛋白酶在37℃下在25mM磷酸鹽緩沖液(7.2pH值)中進(jìn)行試驗(yàn)。為了分析，在指定時(shí)間點(diǎn)(例如，5、15、30、60、120分鐘或更長(zhǎng))去除70μL份且用淬酸(HCl)滅，隨后在HPLC/LCMS上操作。在4℃下將NDC儲(chǔ)存在水中。如下制備胰蛋白酶儲(chǔ)備液：將1mg胰蛋白酶溶解在1mL水中，等分，隨后緊接著進(jìn)行快速凍結(jié)且儲(chǔ)存在-80℃下直至四周。在藥物釋放試驗(yàn)之前，使用Z-Arg-Arg-對(duì)硝基-苯胺基質(zhì)測(cè)試酶活性。對(duì)于鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體或NDC，自由藥物％(圖3和S3)為自由藥物量除以負(fù)載藥物的初始量。通過對(duì)應(yīng)于348nm處釋放藥物的HPLC峰的面積確定自由藥物量。對(duì)于酶處理之前的鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體或NDC，負(fù)載藥物量為348nm處HPLC峰的面積。因?yàn)樘键c(diǎn)-(Cy5)-PEG-mal在348nm處具有背景吸光度，所以NDC的背景減除為必要的。使用超純水(18MΩ-cm電阻率)制備所有緩沖劑和溶液。

使用組織蛋白酶B的藥物釋放試驗(yàn)：

用25μM NDC(例如，6或7)或自由鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物(例如，3、4或5)和200nM組織蛋白酶B，在37℃下在25mM乙酸鈉緩沖液(5.0pH值)中進(jìn)行試驗(yàn)。此試驗(yàn)不使用DTT。為了分析，在指定時(shí)間點(diǎn)(例如，5、15、30、60、120分鐘或更長(zhǎng))去除70μL份且用淬酸(HCl)滅，隨后在HPLC/LCMS上操作。在4℃下將NDC儲(chǔ)存在水中。如下制備組織蛋白酶B儲(chǔ)備液：經(jīng)1mg組織蛋白酶B溶解在1mL 50mM乙酸鈉和2.5mM EDTA中，等分，隨后緊接著進(jìn)行快速凍結(jié)且儲(chǔ)存在-80℃下達(dá)數(shù)周。在藥物釋放試驗(yàn)之前，使用Z-Arg-Arg-對(duì)硝基-苯胺基質(zhì)測(cè)試酶活性。如前述段落中所述，對(duì)于鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體或NDC，自由藥物％(圖4A、4B、6A和6B)為自由藥物量除以負(fù)載藥物的初始量。使用超純水(18MΩ-cm電阻率)制備所有緩沖劑和溶液。

NDC穩(wěn)定性試驗(yàn)：

用7.5μM NDC(例如，6或7)在25mM乙酸鈉緩沖液(5.0pH值)或50mM磷酸鹽緩沖液(7.2pH值)中進(jìn)行試驗(yàn)，且在37℃下培育直至48小時(shí)。同樣評(píng)估磷酸鹽緩沖液(7.2pH值)中的10mM谷胱甘肽(減少的)。隨后通過HPLC分析20μL等分試樣。對(duì)于一個(gè)實(shí)驗(yàn)，在無血清DEM中用10μM NDC處理H1650細(xì)胞(參見下文磷酸EGFR試驗(yàn))達(dá)18小時(shí)后，回收且通過HPLC分析媒質(zhì)。

使用H1650細(xì)胞的磷酸EGFR試驗(yàn)：

用2mL10％FBS DEM媒質(zhì)將H1650細(xì)胞(150萬個(gè)細(xì)胞)接種到6孔板中，且使其生長(zhǎng)24小時(shí)。用1mL無血清DEM媒質(zhì)洗滌細(xì)胞，隨后在指定濃度下與吉非替尼或NDC一起培育隔夜(18小時(shí))。隨后用50ng/mL EGF處理細(xì)胞達(dá)5分鐘，隨后用1mL PBS洗滌。將胰蛋白酶(0.5ml，0.25％)添加到每個(gè)孔中，且培育直到細(xì)胞分離(約5min)。將1mL10％FBS DEM媒質(zhì)添加到孔中，且將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有10mL 10％FBS DEM媒質(zhì)的15mL圓錐形試管中。在4℃下以3000rpm旋轉(zhuǎn)減慢細(xì)胞達(dá)5分鐘。用1mL冷PBS洗滌細(xì)胞團(tuán)，將其轉(zhuǎn)移到1.5mL試管中，且旋轉(zhuǎn)減慢。傾析PBS，且將70μL RIPA(含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑)添加到團(tuán)塊中，研磨成粉，且在冰上培育達(dá)10分鐘。在4℃下以最大速度旋轉(zhuǎn)試管達(dá)10分鐘。將裂解物轉(zhuǎn)移到新1.5ml試管中且儲(chǔ)存在-80℃下。通過布拉德福(Bradford)試驗(yàn)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。在生命技術(shù)(Life Technologies)設(shè)備上，使用Novex 8％三-甘氨酸凝膠(1.5毫米X 15孔)、三-甘氨酸SDS操作緩沖液、NuPAGE轉(zhuǎn)移緩沖液、0.1％Tween-20于1x TBS洗滌緩沖液和5％牛奶于洗滌緩沖液中作為阻斷緩沖液。如下應(yīng)用初級(jí)抗體：抗磷酸化-EGFR(pEGFR，Tyr¹⁰⁶⁸)(1:1000稀釋；賽信通(CellSignaling))、抗EGFR(D38B1)(1:5000稀釋；賽信通)、單克隆抗β-肌動(dòng)蛋白克隆株AC-15(1:5000稀釋；西格瑪-奧德里奇)。應(yīng)用的二級(jí)抗體為山羊抗小鼠IgG-HRP(1:10000稀釋；圣克魯茲生物技術(shù)(Santa Cruz Biotechnology))和山羊抗兔IgG-HRP(1:5000稀釋；圣克魯茲生物技術(shù))。

制備O-去嗎啉基-吉非替尼,dMG(8，圖12(流程3)中)：

商業(yè)上獲得化合物。

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ9.69(s,1H),9.47(s,1H),8.48(s,1H),8.22(dd,J＝6.9,2.7Hz,1H),7.84(ddd,J＝9.1,4.4,2.7Hz,1H),7.78(s,1H),7.41(t,J＝9.1Hz,1H),7.22(s,1H),3.98(s,3H)。¹³C-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ155.83,153.91,151.89,146.73,146.20,122.74,121.69,116.50,116.33,109.51,107.18,105.25,55.92。C₁₅H₁₁ClFN₃O₂的ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量319.1):[M+H]⁺計(jì)算值320.1，觀測(cè)值320.2。

合成N-(叔丁氧基羰基)-氨基丙基-dMG(9，圖12(流程3)中):

將500mg化合物8溶解在100mL無水DMF中。將K₂CO₃(mg，mmol)添加到溶液中。在60℃下進(jìn)行反應(yīng)達(dá)16小時(shí)，且通過TLC和/或HPLC檢驗(yàn)。在真空中去除溶劑，留下棕色油狀物，在24g RediSep Rf正相濾筒上使用20％MeOH于DCM中的DCM線性梯度進(jìn)行快速純化。分離最終產(chǎn)物呈白色固體狀(312mg，62％產(chǎn)率)。

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ9.57(s,1H),8.49(s,1H),8.12(dd,J＝6.8,2.7Hz,1H),7.81(m,1H),7.44(t,J＝9.1Hz,1H),7.20(s,1H),6.92(t,J＝5.7Hz,1H),4.17(t,J＝6.0Hz,2H),3.95(s,3H),3.15(q,J＝6.5Hz,2H),1.95(p,J＝6.5Hz,2H),1.38(s,9H)。¹³C-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ156.01,155.59,154.39,152.61,146.92,123.40,122.29,118.62,116.54,116.37,107.23,102.59,77.51,66.69,55.84,37.22,35.75,28.95,28.22。C₂₃H₂₆ClFN₄O₄的ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量476.2):[M+H]⁺計(jì)算值477.2，觀測(cè)值477.3。

制備氨基丙基-O-去嗎啉基-吉非替尼，APdMG(1，圖1A和圖12(流程3)中)

用1mL TFA:水(9:1)處理化合物9(100mg，0.21mmol)達(dá)30min。在真空中去除TFA:水，留下淡黃色油狀物。用二乙醚洗滌油狀物，隨后將其溶解在水:乙腈(1:1)溶液中，凍結(jié)且凍干。獲得茶色固體(TFA鹽，98mg，95％產(chǎn)率)。

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ10.73(s,1H),8.80(s,1H),8.03(s,1H),8.05-8.00(m,1H),7.88(s,3H),7.72(ddd,J＝9.0,4.3,2.6Hz,1H),7.54(t,J＝9.0Hz,1H),7.35(s,1H),4.27(t,J＝5.9Hz,2H),4.00(s,3H),3.04(p,J＝6.7,6.3Hz,2H),2.13(dt,J＝12.2,6.0Hz,2H)。¹³C-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ158.02,148.80,116.96,116.79,107.60,103.66,66.17,56.42,36.39,26.59。C₁₈H₁₈ClFN₄O₂的ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量376.1):[M+H]⁺計(jì)算值377.1，觀測(cè)值377.2。

制備9-芴基甲氧羰基-N-酰胺基-dPEG₂-氨基丙基-dMG，F(xiàn)moc-dPEG₂APdMG(10，圖13(流程4))：

制備含有dPEG₂APdMG 2(25mg，0.05mmol，TFA鹽)和Fmoc-N-酰胺基-dPEG₂-COOH(20mg，0.05mmol)于DMF(500μL)中的溶液。向DMF(100μL)中添加DIEA(19mg，0.15mmol，26μL)，隨后添加HATU溶液(19mg，0.05mmol)。在室溫下進(jìn)行反應(yīng)達(dá)30min，通過LCMS完全測(cè)定。在真空中減小體積，且通過硅膠色譜法，使用乙酸乙酯梯度和10％甲醇于乙酸乙酯中來進(jìn)行純化。收集部分，合并且在真空中去除溶劑。分離產(chǎn)物為白色固體(84％產(chǎn)率)。

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ9.55(d,J＝10.7Hz,1H),8.51(d,J＝2.4Hz,1H),8.18-8.07(m,1H),7.96(t,J＝5.5Hz,1H),7.87(d,J＝7.6Hz,2H),7.83-7.76(m,2H),7.67(d,J＝7.5Hz,2H),7.49-7.36(m,3H),7.31(td,J＝7.5,1.2Hz,3H),7.21(s,1H),4.28(d,J＝6.9Hz,2H),4.24-4.10(m,3H),3.94(s,3H),3.60(t,J＝6.4Hz,2H),3.46(s,4H),3.36(t,J＝6.0Hz,2H),3.27(q,J＝6.6Hz,2H),3.10(q,J＝5.9Hz,2H),2.32(t,J＝6.5Hz,2H),1.97(p,J＝6.5Hz,2H)。¹³C-NMR(500MHz,CDCl₃):δ170.08,143.85,127.54,126.98,125.10,120.05,102.60,69.42,69.04,66.78,66.58,55.87,46.69,40.01,39.94,39.85,39.77,39.68,39.60,39.51,39.43,39.35,39.25,39.18,39.07,39.01,36.16,35.69,28.67,0.08。C₄₀H₄₁ClFN₅O₇的ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量757.27):[M+H]⁺計(jì)算值758.3，觀測(cè)值758.4。

制備氨基-dPEG₂-氨基丙基-dMG，dPEG₂APdMG(2，圖1A和圖13(流程4)中)：

將化合物10(10mg，0.013mmol)溶解在含30％哌啶的DMF(1mL)中，且使其在室溫下反應(yīng)達(dá)15min。在真空中去除溶劑，將其溶解在水/乙腈中，且通過反相(C18)HPLC進(jìn)行純化。回收產(chǎn)物呈白色粉末狀(7mg，80％產(chǎn)率)。

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ10.66(s,1H),8.78(s,1H),8.05-7.97(m,3H),7.80(s,3H),7.72(ddd,J＝9.0,4.3,2.6Hz,1H),7.54(t,J＝9.1Hz,1H),7.32(s,1H),4.20(t,J＝6.1Hz,2H),4.00(s,3H),3.65-3.48(m,7H),3.27(q,J＝6.6Hz,2H),2.96(q,J＝5.5Hz,2H),2.34(t,J＝6.5Hz,2H),1.98(t,J＝6.5Hz,2H)。¹³C-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ116.96,69.55,69.29,66.73,66.61,56.38,38.57,36.03,35.63,28.58。C₂₅H₃₁ClFN₅O₅的ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量535.20):[M+H]⁺計(jì)算值536.2，觀測(cè)值536.3。

制備Boc-N-氨基-(dPEG₂)₃-Phe-Arg(Pbf)-OH(11，圖14(流程5)中)：

將氯三苯甲基樹脂(100mg，0.1mmol，1mmol/g)轉(zhuǎn)移到燒結(jié)注射器反應(yīng)器中，且使其懸浮于2mL無水DCM中達(dá)10min。施配溶劑，且將DIEA于無水DCM中的溶液、隨后Fmoc-Arg(Pbf)-OH(97.5mg，1.5當(dāng)量)于無水DCM中的溶液抽取到注射器中；且攪拌40min。施配溶液，且用DCM 2次洗滌樹脂2min，隨后用DMF洗滌2次。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成程序以獲得最終肽。簡(jiǎn)單地說，通過使用30％哌啶/DMF(1mL)2次洗滌樹脂10min來實(shí)現(xiàn)Fmoc去除保護(hù)基。隨后用DMF(1mL)洗滌4次各2min。使用3當(dāng)量過量的受保護(hù)氨基酸(于2mL DMF中)、9當(dāng)量過量DIEA(120mg，0.9mmol，160μL，于1mL DMF中)、3當(dāng)量過量HATU(mmol，mg，μL，于2mL DMF中)，以所述順序?qū)⑵涮砑拥阶⑸淦髦?，且搖晃1小時(shí)，以在室溫下進(jìn)行偶合反應(yīng)。隨后用DMF(1mL)洗滌4次各2min。添加Fmoc-Phe(116mg)，隨后添加Fmoc-N-dPEG₂-OH的三種殘基(120mg)。序列完整后，進(jìn)行最終Fmoc去除保護(hù)基且洗滌，使用BOC酐(mmol，mg)和DIEA(mmol，mg，μL)于2mL DMF中來封蓋N端胺。用DMF(1mL，2min，2次)洗滌肽-樹脂，隨后用DCM(1mL，2min，4次)洗滌。隨后通過將50％HFIP于DCM中(2mL)添加到注射器中且在室溫下?lián)u晃1小時(shí)，使受保護(hù)肽產(chǎn)物裂解脫離樹脂。隨后通過反相HPLC純化粗產(chǎn)物肽。C₅₄H₈₆N₈O₁₇S的ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量1150.56):[M+H]⁺計(jì)算值1151.6，觀測(cè)值1151.7。

制備Boc-N-酰胺基-(dPEG₂)₃-Phe-Arg(Pbf)-APdMG(12，圖14(流程5)中)：

制備含有化合物11(23mg，0.02mmol，1當(dāng)量)和APdMG 1(9mg，0.024mmol，1.2當(dāng)量)于DMF(1mL)中的溶液。向其中添加DIEA(10mg，0.08mmol，14μL，4當(dāng)量)，隨后添加HATU(9mg，0.024mmol，1.2當(dāng)量)。通過HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，且反應(yīng)在30分鐘內(nèi)完成。在真空中去除溶劑，隨后在DCM中進(jìn)行再懸浮。用水洗滌DCM溶液4次，隨后蒸發(fā)留下茶色油狀物。C₇₂H₁₀₂ClFN₁₂O₁₈S的ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量1508.68):[M+H]⁺計(jì)算值1509.7，觀測(cè)值1509.7；[M+2H]²⁺計(jì)算值755.4，觀測(cè)值755.0。

制備Boc-N-酰胺基-(dPEG₂)₃-Phe-Arg(Pbf)-dPEG₂APdMG(13，圖14(流程5)中)：

制備含有化合物11(30mg，0.026mmol，1當(dāng)量)和dPEG₂APdMG 2(18mg，0.034mmol，1.3當(dāng)量)于DMF(1mL)中的溶液。向其中添加DIEA(14mg，0.1mmol，18μL，4當(dāng)量)，隨后添加HATU(13mg，0.034mmol，1.3當(dāng)量)。通過HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，且反應(yīng)在30分鐘內(nèi)完成。在真空中去除溶劑，隨后在DCM中進(jìn)行再懸浮。用水洗滌DCM溶液4次，隨后蒸發(fā)留下茶色油狀物。C₇₉H₁₁₅ClFN₁₃O₂₁S的ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量1667.77):[M+2H]²⁺計(jì)算值834.9，觀測(cè)值834.7。

制備H₂N-(dPEG₂)₃-Phe-Arg-APdMG(14，流程6中)：

將化合物12(自前述步驟為約0.02mmol)添加到TFA/水(9:1，1mL)中，且在室溫下靜置1小時(shí)。蒸發(fā)反應(yīng)物，隨后將其溶解在ACN/水中，凍結(jié)且凍干，留下茶色固體。通過反相HPLC純化粗物質(zhì)。留下呈白色固體狀的最終產(chǎn)物(14mg)。C₅₄H₇₈ClFN₁₂O₁₃的ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量1156.55):[M+H]⁺計(jì)算值1157.6，觀測(cè)值1157.8；[M+2H]²⁺計(jì)算值579.3，觀測(cè)值579.1。

制備H₂N-(dPEG₂)₃-Phe-Arg-(dPEG₂)-APdMG(15，圖14(流程5)中)：

將化合物13(自前述步驟為約0.026mmol)添加到TFA/水(9:1，1mL)中，且在室溫下靜置1小時(shí)。蒸發(fā)反應(yīng)物，隨后將其溶解在ACN/水中，凍結(jié)且凍干，留下茶色固體。通過反相HPLC純化粗物質(zhì)。留下呈白色固體狀的最終產(chǎn)物(24mg)。C₆₁H₉₁ClFN₁₃O₁₆的ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量1315.64):[M+H]⁺計(jì)算值1316.7，觀測(cè)值1316.5；[M+2H]²⁺計(jì)算值658.6，觀測(cè)值658.5。

制備S-乙酰基-巰基乙酰胺基-(dPEG₂)₃-Phe-Arg-APdMG(16，圖14(流程5)中)：

制備含有化合物14(5mg，0.004mmol，1當(dāng)量)和DIEA(1.5mg，0.012mmol，2μL，3當(dāng)量)于DMF(200μL)中的溶液。隨后將SAMA-OPfp(2mg，0.006mmol，1.5當(dāng)量)于DMF(100μL)中添加到溶液中，且使其反應(yīng)達(dá)1小時(shí)。在真空中去除溶劑，隨后通過反相HPLC純化?；厥?mg白色固體。C₆₁H₉₁ClFN₁₃O₁₆的ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量1315.64):[M+H]⁺計(jì)算值1316.7，觀測(cè)值1316.5；[M+2H]²⁺計(jì)算值658.6，觀測(cè)值658.5。

制備S-乙?；?巰基乙酰胺基-(dPEG₂)₃-Phe-Arg-dPEG₂APdMG(17，圖14(流程5)中)：

制備含有化合物15(5mg，0.004mmol，1當(dāng)量)和DIEA(1.5mg，0.012mmol，2μL，3當(dāng)量)于DMF(200μL)中的溶液。隨后將SAMA-OPfp(2mg，0.006mmol，1.5當(dāng)量)于DMF(100μL)中添加到溶液中，且使其反應(yīng)達(dá)1小時(shí)。在真空中去除溶劑，隨后通過反相HPLC純化?；厥?mg白色固體。C₆₅H₉₅ClFN₁₃O₁₈S的ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量1431.63):[M+2H]²⁺計(jì)算值716.8，觀測(cè)值716.7。

制備巰基乙酰胺基-(dPEG₂)₃-Phe-Arg-APdMG，Phe-Arg-APdMG(3，圖1B和圖14(流程5)中)：

緊接在使用之前進(jìn)行此步驟。將1mg化合物16溶解在100μL水/MeOH(1:1)中，向其中添加2μL 1N NaOH。15分鐘后，添加2μL 1M HCl來中和。直接使用溶液。C₅₆H₈₀ClFN₁₂O₁₄S的ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量1230.53):[M+H]⁺計(jì)算值1231.5，觀測(cè)值1231.4；[M+2H]²⁺計(jì)算值616.3，觀測(cè)值616.3。

制備巰基乙酰胺基-(dPEG₂)₃-Phe-Arg-dPEG₂APdMG，Phe-Arg-dPEG₂APdMG(4，圖1C和圖14(流程5)中)：

緊接在使用之前進(jìn)行此步驟。將1mg化合物17溶解在100μL水/MeOH(1:1)中，向其中添加2μL 1N NaOH。15分鐘后，添加2μL 1M HCl來中和。直接使用溶液。C₆₃H₉₃ClFN₁₃O₁₇S的ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量1389.62):[M+H]⁺計(jì)算值1390.6，觀測(cè)值1390.5；[M+2H]²⁺計(jì)算值695.8，觀測(cè)值695.7。

制備Fmoc-Lys(Mtt)-PABOH(18，圖15(流程6)中)：

制備Fmoc-Lys(Mtt)-OH(748mg，1.2mmol，1當(dāng)量)和對(duì)氨基芐醇(300mg，2.4mmol，2當(dāng)量)于DMF(5mL)中的溶液。添加DIEA(465mg，3.6mmol，630μL，3當(dāng)量)，隨后添加HATU(502mg，1.3mmol，1.1當(dāng)量)于DMF(2mL)中的溶液。反應(yīng)在30分鐘內(nèi)完成，且通過HPLC/LCMS測(cè)定。在真空中部分去除溶劑，且用乙酸乙酯/水進(jìn)行萃取。用水洗滌乙酸乙酯層4次，隨后蒸發(fā)產(chǎn)生橙色固體。在40g RediSep Rf正相濾筒上，使用己烷和乙酸乙酯的線性梯度來純化粗物質(zhì)。分離最終產(chǎn)物呈白色固體狀(850mg，97％產(chǎn)率)。

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃):δ7.96(s,1H),7.73(d,J＝7.9Hz,2H),7.54(d,J＝7.5Hz,2H),7.47-7.41(m,6H),7.39-7.20(m,12H),7.18-7.11(m,2H),7.05(d,J＝7.9Hz,2H),5.29(s,1H),4.63(s,1H),4.44(d,J＝6.4Hz,2H),2.28(s,3H),2.11(t,J＝6.9Hz,2H),1.88(s,1H),1.58(s,5H),1.51(s,1H),1.38(s,2H)。¹³C-NMR(500MHz,CDCl₃):δ146.36,143.22,141.32,135.70,128.57,128.52,128.49,127.79,127.74,127.12,126.14,124.92,120.16,120.02,77.27,77.02,76.76,70.62,64.92,60.41,47.16,43.30,30.57,23.43,21.07,20.93,14.21,0.01。C₄₈H₄₇N₃O₄的ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量729.36):[M+H]⁺計(jì)算值730.4，觀測(cè)值730.2。

制備Fmoc-Phe-Lys(Mtt)-PABOH(19，圖15(流程6)中)：

使用9mL含30％哌啶的DMF，自Fmoc-Lys(Mtt)-PABOH 18(425mg，0.6mmol，1當(dāng)量)中去除Fmoc基團(tuán)達(dá)10分鐘。在真空中去除溶劑，且將所得油狀物再懸浮于10mLDMF中。制備Fmoc-Lys(Mtt)-OH(748mg，1.2mmol，1當(dāng)量)和對(duì)氨基芐醇(300mg，2.4mmol，2當(dāng)量)于DMF(5mL)中的溶液。添加DIEA(465mg，3.6mmol，630μL，3當(dāng)量)，隨后添加HATU(502mg，1.3mmol，1.1當(dāng)量)于DMF(2mL)中的溶液。反應(yīng)在30分鐘內(nèi)完成，且通過HPLC/LCMS測(cè)定。在真空中部分去除溶劑，且用乙酸乙酯/水進(jìn)行萃取。用水洗滌乙酸乙酯層4次，隨后蒸發(fā)，產(chǎn)生橙色固體。在40g RediSep Rf正相濾筒上，使用己烷和乙酸乙酯的線性梯度來純化粗物質(zhì)。分離最終產(chǎn)物呈白色固體狀(850mg，97％產(chǎn)率)。

¹H-NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.20(s,1H),7.73(d,J＝7.6Hz,2H),7.50(s,2H),7.48-7.34(m,8H),7.34-7.20(m,11H),7.20-7.07(m,7H),7.04(d,J＝8.1Hz,2H),6.28(s,1H),5.22(s,1H),4.62(s,2H),4.43(dd,J＝10.7,6.7Hz,1H),4.32(d,J＝11.5Hz,1H),3.05(s,2H),2.27(s,3H),2.11-2.02(m,2H),1.89(s,1H),1.46(d,J＝6.3Hz,1H),1.26(s,2H)。¹³C-NMR(500MHz,CDCl₃)δ146.35,141.31,136.97,135.70,129.10,128.93,128.57,128.50,127.82,127.74,127.71,127.39,127.12,126.14,124.91,124.84,120.10,120.04,77.28,77.23,77.02,76.77,70.60,67.15,64.96,54.06,47.08,43.35,31.30,30.60,23.52,20.93。C₅₇H₅₆N₄O₅的ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量876.43):[M+H]⁺計(jì)算值877.4，觀測(cè)值877.3。

制備Fmoc-Phe-Lys(Mtt)-PABC-APdMG(21，圖15(流程6)中)：

將化合物19(420mg，0.5mmol，1當(dāng)量)溶解在無水DCM(20mL)中。添加吡啶(216mg，2.7mmol，5.4當(dāng)量)，隨后添加氯甲酸4-硝基苯酯(180mg，0.9mmol，1.8當(dāng)量)于無水DCM中的溶液。在室溫下進(jìn)行反應(yīng)達(dá)2小時(shí)，隨后通過HPLC和TLC檢驗(yàn)。在真空中去除溶劑，隨后通過在24g RediSep Rf正相濾筒上使用己烷和乙酸乙酯的線性梯度來進(jìn)行純化。分離產(chǎn)物Fmoc-Phe-Lys(Mtt)-PABC-pNP(20)呈黃色固體狀(360mg，70％產(chǎn)率)。將Fmoc-Phe-Lys(Mtt)-PABC-pNP(50mg，0.05mmol，1當(dāng)量)溶解在無水DCM(3mL)中。隨后將APdMG 1(25mg，0.05mmol，TFA鹽，1當(dāng)量)與DIEA(65mg，0.5mmol，90μL，10當(dāng)量)于無水DCM中的溶液添加到Fmoc-Phe-Lys(Mtt)-PABC-pNP中。在室溫下進(jìn)行反應(yīng)達(dá)4小時(shí)，隨后通過HPLC和TLC檢驗(yàn)。在真空中去除溶劑，且在4g RediSepRf正相濾筒上用己烷和乙酸乙酯的線性梯度來純化粗物質(zhì)。分離最終產(chǎn)物呈黃色固體狀(38mg，60％產(chǎn)率)。C₇₆H₇₂ClFN₈O₈的ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量1278.51)：[M+H]⁺計(jì)算值1279.5，觀測(cè)值1279.4；[M+2H]²⁺計(jì)算值640.3，觀測(cè)值640.3。

制備Mmt-S-dPEG₈-Phe-Lys(Mtt)-pABC-dMG(22，圖15(流程6)中)：

用2mL含30％哌啶的DMF對(duì)18mg化合物21(0.014mmol，1當(dāng)量)進(jìn)行去除保護(hù)基。5分鐘后，通過HPLC/LCMS證實(shí)反應(yīng)完全，且在真空中去除溶劑。將所得油狀物溶解在DMF(0.5mL)中，向其中添加Mmt-S-dPEG₈-COOH(13mg，0.017mmol，1.2當(dāng)量)和DIEA(9mg，0.070mmol，13μL，5當(dāng)量)。制備HATU(6mg，0.014mmol，1.2當(dāng)量)于DMF(200μL)中的溶液，且將其添加到反應(yīng)物中。1小時(shí)后，通過HPLC/LCMS認(rèn)為反應(yīng)完全，且在真空中去除溶劑。在4g RediSep Rf正相濾筒上使用10％MeOH于DCM中的DCM線性梯度來快速純化剩余油狀物。分離最終產(chǎn)物呈白色固體狀(23mg，92％產(chǎn)率)。C₁₀₀H₁₁₄ClFN₈O₁₆S的ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量1768.77):[M+2H]²⁺計(jì)算值885.9，觀測(cè)值886.0。

制備HS-dPEG₈-Phe-Lys-PABC-氨基丙基-dMG(5，圖15(流程6)中)：

用2mL 0.5％TFA/5％TIS于DCM中處理10mg化合物22(5.6μmol)達(dá)2小時(shí)，隨后通過HPLC/LCMS檢驗(yàn)以確認(rèn)完全去除保護(hù)基。在真空中去除溶液，且隨后用冷醚洗滌3次。將白色固體溶解在水/乙腈(1:1)中，凍結(jié)且凍干。不經(jīng)進(jìn)一步純化即使用所得白色固體(6mg，86％產(chǎn)率)。C₆₀H₈₂ClFN₈O₁₅S的ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量1240.53):[M+H]⁺計(jì)算值1241.5，觀測(cè)值1241.6；[M+2H]²⁺計(jì)算值621.3，觀測(cè)值621.3。

制備碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-順丁烯二酰亞胺：

用氨基硅烷(APTES)于DMSO中使順丁烯二酰亞胺和NHS酯官能化聚乙二醇(mal-dPEG₁₂-NHS)結(jié)合(摩爾比：PEG-NHS:APTES:DMSO為1:0.9:60)。在室溫下將反應(yīng)混合物靜置在氮?dú)庀逻_(dá)48小時(shí)以產(chǎn)生硅烷官能化mal-dPEG(mal-dPEG-APTES)。在DMSO中使順丁烯二酰亞胺官能化Cy5(mal-Cy5)與硫醇-硅烷(MPTMS)反應(yīng)(摩爾比：Cy5:MPTMS:DMOS為1:25:1150)。在室溫下將反應(yīng)物靜置在氮?dú)庀逻_(dá)24小時(shí)以產(chǎn)生硅烷官能化Cy5(Cy5-MPTMS)。隨后將TMOS和Cy5-MPTMS滴定到氫氧化氨溶液(pH值約為8)中(摩爾比：TMOS:Cy5:NH3:H₂O為1:0.001:0.44:1215)。在室溫下以600rpm攪拌溶液達(dá)24小時(shí)，以形成均相Cy5囊封二氧化硅納米粒子。隨后將mal-dPEG-APTES和硅烷官能化聚乙二醇(PEG-硅烷，約500MW，蓋勒斯特(Gelest))添加到合成溶液中，以使粒子聚乙二醇化和表面官能化(PEG-硅烷:TMOS:mal-PEG-APTES為1:2.3:0.006)。在室溫下以600rpm攪拌溶液達(dá)24小時(shí)，隨后在不攪拌的情況下在80℃下再培育24小時(shí)。用去離子水以2000mL透析溶液達(dá)兩天(10k MWCO)，用200nm注射器過濾器過濾，且最后進(jìn)行色譜純化(休珀代克斯200)，產(chǎn)生所要mal-碳點(diǎn)。

制備碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-Phe-Arg-dPEG₂-Gly-D-Tyr-APdMG：

使用用于獲得化合物6的相同整體合成策略。合成鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體Phe-Arg-dPEG₂-Gly-D-Tyr-APdMG(23)。C₇₄H₁₀₅ClFN₁₅O₂₀S的(ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量1609.71):[M+2H]²⁺計(jì)算值805.9，觀測(cè)值805.6)。如針對(duì)NDC 6和7所描述，此構(gòu)筑體連接到碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-mal上。

制備碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-Phe-Lys-PABC-Gly-D-Tyr-APdMG：

使用用于獲得化合物7的相同整體合成策略。合成鍵聯(lián)基團(tuán)-藥物構(gòu)筑體Phe-Lys-PABC-Gly-D-Tyr-APdMG(24)。C₇₁H₉₄ClFN₁₀O₁₈S的(ESI-MS(m/z)(準(zhǔn)確質(zhì)量1460.61):[M+H]⁺計(jì)算值1461.6，觀測(cè)值1461.3；[M+2H]²⁺計(jì)算值731.3，觀測(cè)值731.如針對(duì)NDC 6和7所描述，此構(gòu)筑體連接到碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-mal上。

制備放射性碘化碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-Phe-Arg-dPEG₂-Gly-D-Tyr-氨基丙基-APdMG：

使用Iodogen協(xié)定對(duì)碳點(diǎn)-(Cy5)-PEG-Phe-Arg-dPEG₂-Gly-D-Tyr-APdMG進(jìn)行放射性碘化。在PD10管柱上純化碘化反應(yīng)物，隨后通過GPC(Superdex)分析。