本發(fā)明屬于活性物質(zhì)及其制品研究開發(fā)領(lǐng)域，涉及一種中藥藥物物質(zhì)，特別涉及一種具有降血脂降血糖活性的中藥藥物物質(zhì)組合物及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
高脂血癥是指血脂水平過高，可直接引起一些嚴(yán)重危害人體健康的疾病，如動脈粥樣硬化、冠心病、胰腺炎等，包括原發(fā)性和繼發(fā)性兩類。目前上市的大多數(shù)藥物對在治療高血脂癥的同時存在一定的副作用；糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。高血糖則是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起。糖尿病時長期存在的高血糖，導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙，目前呈現(xiàn)多發(fā)趨勢。然而市場藥物以化藥為主，并有一定副作用。中藥復(fù)方憑借其多成分、多靶點的優(yōu)勢，更具有發(fā)展前景。
本中藥復(fù)方由甜葉菊、三七、山楂、荷葉等藥味組成，其中藥藥物物質(zhì)化學(xué)組成架構(gòu)涉及：酚類、萜類、生物堿類、氨基酸類等。在研究中將本中藥復(fù)方進(jìn)行提取與大孔吸附樹脂富集，并進(jìn)行制備物優(yōu)化組合，經(jīng)藥效考察，其組合物顯示出顯著降血脂降血糖作用，具有進(jìn)一步進(jìn)行創(chuàng)新藥物及其健康產(chǎn)品研發(fā)的重要價值。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種具有顯著降血脂、降血糖活性的中藥藥物物質(zhì)組合物；本發(fā)明的第二個目的在于提供其制備方法；本發(fā)明的第三個目的在于提供其質(zhì)量檢測及控制方法；本發(fā)明的第四個目的在于提供本活性物質(zhì)的中藥方原組合，由三七、荷葉、山楂、甜葉菊等藥味組成；本發(fā)明的第五個目的在于為藥品或健康品等應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
本發(fā)明中藥藥物物質(zhì)組合主要由酚類、生物堿類、萜類、氨基酸類等組成，可由化學(xué)合成、制備，天然藥物提取制備組合制成；本發(fā)明中藥藥物物質(zhì)組合可由如下4組藥用植物及其代用品種，包括其藥用部位及非藥用部位，藥材及其飲片組合制成。
組1甜葉菊同屬植物及其炮制品：例如甜葉菊等，以及其他含酚酸類植物及其炮制品：例如菊花、金銀花、山銀花，等等。
組2荷葉同屬植物及其炮制品：例如蓮、黃葉蓮等；荷葉、荷葉炭，等等。
組3山楂同屬植物及其炮制品：例如阿爾泰山楂、橘紅山楂、黃果山楂、綠肉山楂、中甸山楂、野山楂、光葉山楂、山東山楂、湖北山楂、甘肅山楂、鈍裂葉山楂、毛山楂、滇西山楂、銳刺山楂、山楂、裂葉山楂、遼寧山楂、云南山楂、山東山楂、陜西山楂、準(zhǔn)噶爾山楂、多漿山楂、華中山楂等；山楂、炒山楂、焦山楂、山楂炭，等等。
組4三七同屬植物及其炮制品：例如人參、竹節(jié)參、三七、假人參、西洋參、屏邊三七、姜狀三七等；三七、三七粉、熟三七、三七片，等等。
本發(fā)明中藥藥物組合優(yōu)選為以下原料藥制成：
甜葉菊 10-600重量份 荷葉 10-600重量份
山楂 10-400重量份 三七 10-300重量份
本發(fā)明中藥藥物物質(zhì)組合物制備方法包括如下步驟：
步驟1：選取上述原料藥；
步驟2：醇或水提??；
步驟3：大孔吸附樹脂純化
上述步驟2中，將原料藥用水或5％～90％乙醇回流提取1～4次，每次提取0.5～3小時，合并提取液，回收溶劑，減壓干燥，即得提取物。
上述步驟3中，將步驟2所得提取物加水分散，使水分散液濃度為0.01～0.20g/mL，或提取液適當(dāng)回收溶劑的水溶液通過弱極性或非極性大孔吸附樹脂，吸附流速為0.1～9BV/h，樹脂柱徑高比為1∶1～10，上樣液濃度為0.01～0.20g/mL，收集上樣流出液，然后水洗脫1～10倍樹脂體積，洗脫流速為0.1～10BV/h，收集洗脫液，合并上樣流出液與水洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即得富集物I；5～50％乙醇洗脫1～15倍樹脂體積，洗脫流速為0.1～10BV/h，收集洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即得富集物II；50％～95％乙醇洗脫1～10BV，洗脫流速為0.1～10BV/h，收集洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即得富集物III。
以上所述的制備物按優(yōu)化比例配制即得組合物，其質(zhì)量控制為：總氨基酸含量達(dá)1～30％、總酚類含量達(dá)10～50％、總萜含量達(dá)1～40％、總生物堿含量達(dá)0.1％～10％、異綠原酸C含量達(dá)0.1～20％、金絲桃苷含量達(dá)0.1～20％、人參皂苷Rb1含量達(dá)0.01～10％、甜菊苷含量達(dá)1～30％、荷葉堿含量達(dá)0.01～5％。
將以上所得制備物組合物混合后，加入常規(guī)輔料，按常規(guī)的制劑工藝制成藥劑學(xué)可接受的任意常規(guī)劑型，包括膠囊劑、片劑、顆粒劑、凝膠劑、緩釋劑、口服液等。
以下對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
實驗例1本發(fā)明降血脂作用
(一)實驗材料
1.實驗動物
昆明小鼠，雄雌各半，體重18～22g。由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。
2.藥品與試劑
受試藥：本中藥藥物物質(zhì)組合物(簡稱組合物)。試劑：辛伐他汀片(批號：L026625)，杭州默沙東制藥有限公司；生理鹽水(批號：C13040602)，山東華魯制藥有限公司；小鼠甘油三酯酶聯(lián)試劑盒(貨號：E03T0018)，Bluegene公司；小鼠總膽固醇試劑盒(貨號：E03C0745)，Bluegene公司；小鼠低密度脂蛋白酶聯(lián)試劑盒(貨號：E03L0020)，Bluegene公司；小鼠高密度脂蛋白酶聯(lián)試劑盒(貨號：E03H0211)，Bluegene公司。
(二)實驗方法與結(jié)果
1.分組及給藥方式
小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨即分成4組，每組8只，雌雄各半，即分別為空白組、模型組、陽性藥組、組合物試藥組；空白組和模型組給生理鹽水，陽性藥組給辛伐他汀片，菊荷方組合物試藥組給菊荷方中劑量組合物。辛伐他汀制成濃度0.328mg/mL，按照5.25mg/kg灌胃給藥，蛋黃用生理鹽水制成75％蛋黃乳液，按照0.5mL/只腹腔注射給藥，造成高血脂模型。
2.高血脂模型試驗
空白組和模型組灌胃蒸餾水，給藥組分別灌胃各組藥物，共7天，在第6天給藥后，模型組和給藥組分別腹腔注射75％蛋黃乳液造高血脂模型，除空白組外，各組腹腔注射75％蛋黃乳液，同時，禁食不禁水，12h即末次給藥，1h后摘眼球取血，將血液樣品離心(4℃，3500r/min，離心15min)，分離血清，測定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量。
3.統(tǒng)計方法
使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用兩樣本t檢驗和非參數(shù)檢驗(Mann-Whitney Test)進(jìn)行兩兩比較，采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行多組間比較，組間差異采用LSD(方差齊)或者Games-Howell法(方差不齊)。
4.實驗結(jié)果
表1菊荷方高血脂模型藥效結(jié)果
(注：數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；**表示與模型組比較，P＜0.01，有極顯著性差異；*表示與模型組比較，P＜0.05，有顯著性差異；#表示和空白組比較，P＞0.05，沒有顯著差異)。
(三)結(jié)論
由表1可知：模型對照組小鼠HDL、LDL、TG、TC與空白對照組有極顯著性差異(P＜0.01)，說明用75％蛋黃乳液腹腔注射給藥造高血脂模型成功；陽性藥組指標(biāo)HDL和模型組比較，P＜0.05，有顯著性差異，陽性藥組指標(biāo)LDL、TG、TC和模型組比較，P＜0.01，有極顯著性差異，并且陽性藥組四項指標(biāo)和空白組比較，P＞0.05，沒有顯著差異，說明陽性藥對高血脂有良好的治療作用；組合物組指標(biāo)LDL、TG、TC和模型組比較，P＜0.01，有極顯著性差異，指標(biāo)HDL和模型組比較P＜0.05，有顯著性差異，并且組合物組四項指標(biāo)和空白組比較P＞0.05沒有顯著差異，說明組合物對高血脂有良好治療作用。
綜合實驗數(shù)據(jù)分析可知：組合物可起到顯著治療高血脂的作用，藥效優(yōu)于本次實驗所用陽性藥。
實驗例2本發(fā)明降血糖作用
(一)實驗材料
1.實驗動物
ICR小鼠，雄雌各半，體重18-22g。由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。
3.藥品與試劑
受試藥：組合物。試劑：四氧嘧啶(批號：2041558501；sigma-aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司)；鹽酸二甲雙胍片(批號1409054；華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司)；生理鹽水(批號：C13040602，山東華魯制藥有限公司)。
(二)實驗方法與結(jié)果
1.分組及給藥方式
小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨即分成4組，每組8只，雌雄各半，即分別為空白組、模型組、陽性藥組、組合物試藥組；空白組和模型組給生理鹽水，陽性藥組給鹽酸二甲雙胍片，組合物試藥組給菊荷方高劑量組合物試藥。鹽酸二甲雙胍片配成濃度14.063mg/mL，按照225mg/kg灌胃給藥，四氧嘧啶溶液濃度4.375mg/mL，按照70mg/kg小鼠尾部靜脈注射給藥，造成高血糖模型。
2.高血糖模型試驗
模型組及各給藥組按照70mg/kg小鼠尾部靜脈注射給藥，造成高血糖模型，空白組和模型組灌胃蒸餾水，給藥組分別灌胃各組藥物，共21天，給藥第21天，禁食不禁水6～12h，取血測定血糖作為服糖前的血糖值，立即灌胃葡萄糖2.5g/kg，測定給糖后1小時，2小時及3小時的血糖值。
3.統(tǒng)計方法
使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用兩樣本t檢驗和非參數(shù)檢驗(Mann-Whitney Test)進(jìn)行兩兩比較，采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行多組間比較，組間差異采用LSD(方差齊)或者Games-Howell法(方差不齊)。
4.實驗結(jié)果
表2菊荷方降血糖藥效結(jié)果
(注：數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差；**表示與模型組比較P＜0.01，有極顯著性差異；*表示與模型組比較P＜0.05，有顯著性差異；#表示和空白組比較，P＞0.05沒有顯著差異)。
(三)結(jié)論
由表2可知：模型對照組小鼠空腹血糖值、給糖1h血糖值、給糖2h血糖值、給糖3h血糖值與正常對照組有極顯著性差異(P＜0.01)，說明尾部靜脈注射四氧嘧啶造成高血糖模型成功；陽性藥組空腹血糖值、給糖2h血糖值、給糖3h血糖值指標(biāo)和模型組比較，P＜0.01，有極顯著性差異，并且和空白組比較，P＞0.05沒有顯著差異，給糖1h血糖值指標(biāo)和模型組比較，P＜0.01，有極顯著性差異，和空白組比較，P＜0.01，有極顯著差異，說明陽性藥對高血糖有治療作用；菊荷方組合物試藥組空腹血糖值、給糖1h血糖值、給糖2h血糖值、給糖3h血糖值指標(biāo)和模型組比較，P＜0.01，有極顯著性差異，并且和空白組及陽性藥組比較P＞0.05，均沒有顯著差異，并且經(jīng)藥效反應(yīng)后組合物試藥組和陽性藥組均值接近，即經(jīng)組合物高劑量治療后可基本恢復(fù)到正常，說明組合物對高血糖有良好的治療作用。
綜上，菊荷方組合物試藥組對高血糖有良好的治療作用，優(yōu)于該實驗用的陽性藥藥效。下述實施例均能實現(xiàn)上述實驗例的效果。
實施例1：膠囊劑
甜葉菊 300g 荷葉 300g
山楂 200g 三七 100g
按上述比例取原料藥飲片0.9kg，10倍量70％乙醇回流提取3次，每次提取3小時，減壓回收溶劑，得提取物，加水分散溶解，使水溶液濃度為0.08g/mL，水溶液通過弱極性或非極性大孔吸附樹脂，吸附流速為3.5BV/h，樹脂柱徑高比為1∶8，上樣液濃度為0.09g/mL，收集上樣流出液，然后水洗脫4BV，洗脫流速為6BV/h，收集洗脫液，合并上樣流出液與水洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即得富集物I；20％乙醇洗脫3BV，洗脫流速為3.5BV/h，收集洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即得富集物II；75％乙醇洗脫9BV，洗脫流速為4.5BV/h，收集洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即得富集物III。將制備物按比例配制即得組合物，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝制成膠囊劑；
總酚的含量測定方法：
對照品溶液的制備
取異綠原酸C對照品適量，精密稱定，加50％甲醇制成每1mL含75.2μg的溶液，即得。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
精密量取對照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL，分別置于25mL棕色量瓶中，加50％甲醇至5mL，加入0.3％十二烷基硫酸鈉溶液1.4mL，搖勻，加入新配置的0.6％三氯化鐵-0.9％鐵氰化鉀(1∶1)混合液4.0mL，在暗處放置5min，用0.1％的鹽酸定容至25ml，搖勻后于暗處靜置30min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(中國藥典附錄VA)，在766nm的波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測定法
取樣品適量，精密稱定，加50％甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100mL棕色量瓶中，加50％甲醇至刻度，搖勻既得供試品溶液，精密量取供試品溶液1mL，置25ml量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下方法，自“加50％甲醇至5mL”起依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中異綠原酸C重量，計算，即得。
總生物堿含量測定方法：
對照品溶液的制備
取荷葉堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含398μg的溶液，即得。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
精密量取對照品品溶液10μL、60μL、110μL、160μL、290μL，分別置于磨口圓底燒瓶中，60℃下減壓蒸干，依次加入pH2.2鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液1mL，溴甲酚綠溶液1mL，再精密加入5mL二氯甲烷，密塞，劇烈震搖2min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，靜置萃取2h，以相應(yīng)的試劑為空白，接收二氯甲烷層，照紫外-可見分光光度法(中國藥典附錄VA)在412nm的波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測定法
取樣品適量，精密稱定，加50％甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100mL棕色量瓶中，加50％甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密量取5mL，置于磨口圓底燒瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下方法，自“60℃下減壓蒸干”起，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中荷葉堿重量，計算，即得。
總萜含量測定方法：
對照品溶液的制備
取人參皂苷Rb1對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含136.8μg的溶液，即得。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
精密量取人參皂苷Rb1對照品溶液0.2mL、0.6mL、1.0mL、1.4mL、1.8mL、2.2mL、2.6mL，分別置于西林瓶中，沸水浴蒸干，冷卻至室溫，先加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.3mL，然后再加入高氯酸0.8mL，密塞，置于60℃水浴加熱15min，取出，置于冰水中冷卻3min，加入冰醋酸5mL，搖勻，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(中國藥典附錄VA)在552nm的波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測定法
取樣品適量，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取1mL，置于西林瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下方法，自“沸水浴蒸干”起依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中人參皂苷Rb1重量，計算，即得。
總氨基酸含量測定方法：
對照品溶液的制備
取三七素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含159.6μg的溶液，即得。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
精密量取對照品0.9mL、1.2mL、1.5mL、1.8mL、2.1mL、2.4mL、2.7mL、3.0mL，分別置于25mL棕色量瓶中，加水至6mL，再加入pH值為7的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液1mL，2％茚三酮乙醇溶液2mL，搖勻，置于沸水浴中20min，迅速冷卻至室溫，用水定容至25mL，搖勻，以相應(yīng)的溶劑為空白，照紫外-可見分光光度法(中國藥典附錄VA)在568nm的波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測定法
取樣品適量，精密稱定，加水溶解，轉(zhuǎn)移至50mL棕色量瓶中，加水至刻度，搖勻，既得供試品溶液。精密量取供試品溶液5mL，置于25mL棕色量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下方法，自“加水至6mL”起依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中三七素重量，計算，即得。
指標(biāo)性成分含量測定方法(1)：
對照品：異綠原酸C、金絲桃苷、甜菊苷、人參皂苷Rb1
色譜條件
Waters X-bridge TM shield C18色譜柱(4.6*250mm，5μm)，流動相為乙腈(A)-0.2％磷酸水(B)梯度洗脫(梯度條件見下表)，流速1.0mL/min，柱溫30℃，檢測波長203nm、254nm、327nm。
對照品溶液的制備
取異綠原酸C、金絲桃苷、甜菊苷、人參皂苷Rb1對照品適量，加50％甲醇制成每1mL含異綠原酸C24μg、金絲桃苷29μg、甜菊苷23μg、人參皂苷Rb113μg的混合溶液。
供試品溶液的制備
取本品100mg，精密稱定，50％甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL茶色量瓶中，加50％甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。
測定法
分別精密吸取對照品溶液50μL和供試品溶液50μL，注入液相色譜儀，測定，即得。
指標(biāo)性成分含量測定方法(2)：
對照品：荷葉堿
色譜條件
Waters X-bridge TM shield C18色譜柱(4.6*250mm，5μm)，流動相為乙腈-水-三乙胺-冰醋酸(26.5∶71.1∶1.6∶0.8)等度洗脫，流速1.0mL/min，柱溫30℃，檢測波長270nm。
對照品溶液的制備
取荷葉堿對照品適量，加50％甲醇制成每1mL含荷葉堿16μg的混合溶液。
供試品溶液的制備
取本品40mg，精密稱定，50％甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL茶色量瓶中，加50％甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。
測定法
分別精密吸取對照品溶液50μL和供試品溶液50μL，注入液相色譜儀，測定，即得。
實施例2：片劑
甜葉菊 100g 荷葉 100g
山楂 60g 三七 30g
按上述比例取原料藥飲片0.29kg，10倍量60％乙醇回流提取3次，每次提取1.5小時，減壓回收溶劑，得提取物，加水分散溶解，使水溶液濃度為0.07g/mL，水溶液通過弱極性或非極性大孔吸附樹脂，吸附流速為5BV/h，樹脂柱徑高比為1∶6，上樣液濃度為0.08g/mL，收集上樣流出液，然后水洗脫5BV，洗脫流速為4BV/h，收集洗脫液，合并上樣流出液與水洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即得富集物I；25％乙醇洗脫7BV，洗脫流速為3.5BV/h，收集洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即得富集物II；70％乙醇洗脫6BV，洗脫流速為3BV/h，收集洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即得富集物III。將制備物按比例配制即得組合物，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝制成片劑；
總酚的含量測定方法：
對照品溶液的制備
取異綠原酸C對照品適量，精密稱定，加50％甲醇制成每1mL含75.2μg的溶液，即得。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
精密量取對照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL，分別置于25mL棕色量瓶中，加50％甲醇至5mL，加入0.3％十二烷基硫酸鈉溶液1.4mL，搖勻，加入新配置的0.6％三氯化鐵-0.9％鐵氰化鉀(1∶1)混合液4.0mL，在暗處放置5min，用0.1％的鹽酸定容至25ml，搖勻后于暗處靜置30min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(中國藥典附錄VA)，在766nm的波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測定法
取樣品適量，精密稱定，加50％甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100mL棕色量瓶中，加50％甲醇至刻度，搖勻既得供試品溶液，精密量取供試品溶液1mL，置25ml量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下方法，自“加50％甲醇至5mL”起依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中異綠原酸C重量，計算，即得。
總生物堿含量測定方法：
對照品溶液的制備
取荷葉堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含398μg的溶液，即得。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
精密量取對照品品溶液10μL、60μL、110μL、160μL、290μL，分別置于磨口圓底燒瓶中，60℃下減壓蒸干，依次加入pH2.2鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液1mL，溴甲酚綠溶液1mL，再精密加入5mL二氯甲烷，密塞，劇烈震搖2min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，靜置萃取2h，以相應(yīng)的試劑為空白，接收二氯甲烷層，照紫外-可見分光光度法(中國藥典附錄VA)在412nm的波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測定法
取樣品適量，精密稱定，加50％甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100mL棕色量瓶中，加50％甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密量取5mL，置于磨口圓底燒瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下方法，自“60℃下減壓蒸干”起，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中荷葉堿重量，計算，即得。
總萜含量測定方法：
對照品溶液的制備
取人參皂苷Rb1對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含136.8μg的溶液，即得。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
精密量取人參皂苷Rb1對照品溶液0.2mL、0.6mL、1.0mL、1.4mL、1.8mL、2.2mL、2.6mL，分別置于西林瓶中，沸水浴蒸干，冷卻至室溫，先加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.3mL，然后再加入高氯酸0.8mL，密塞，置于60℃水浴加熱15min，取出，置于冰水中冷卻3min，加入冰醋酸5mL，搖勻，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(中國藥典附錄VA)在552nm的波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測定法
取樣品適量，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取1mL，置于西林瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下方法，自“沸水浴蒸干”起依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中人參皂苷Rb1重量，計算，即得。
總氨基酸含量測定方法：
對照品溶液的制備
取三七素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含159.6μg的溶液，即得。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
精密量取對照品0.9mL、1.2mL、1.5mL、1.8mL、2.1mL、2.4mL、2.7mL、3.0mL，分別置于25mL棕色量瓶中，加水至6mL，再加入pH值為7的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液1mL，2％茚三酮乙醇溶液2mL，搖勻，置于沸水浴中20min，迅速冷卻至室溫，用水定容至25mL，搖勻，以相應(yīng)的溶劑為空白，照紫外-可見分光光度法(中國藥典附錄VA)在568nm的波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測定法
取樣品適量，精密稱定，加水溶解，轉(zhuǎn)移至50mL棕色量瓶中，加水至刻度，搖勻，既得供試品溶液。精密量取供試品溶液5mL，置于25mL棕色量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下方法，自“加水至6mL”起依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中三七素重量，計算，即得。
指標(biāo)性成分含量測定方法(1)：
對照品：異綠原酸C、金絲桃苷、甜菊苷、人參皂苷Rb1
色譜條件
Waters X-bridge TM shield C18色譜柱(5μm，4.6*250mm)，流動相為乙腈(A)-0.2％磷酸水(B)梯度洗脫(梯度條件見下表)，流速1.0mL/min，柱溫30℃，檢測波長203nm、254nm、327nm。
對照品溶液的制備
取異綠原酸C、金絲桃苷、甜菊苷、人參皂苷Rb1對照品適量，加50％甲醇制成每1mL含異綠原酸C24μg、金絲桃苷29μg、甜菊苷23μg、人參皂苷Rb113μg的混合溶液。
供試品溶液的制備
取本品100mg，精密稱定，50％甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL茶色量瓶中，加50％甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。
測定法
分別精密吸取對照品溶液50μL和供試品溶液50μL，注入液相色譜儀，測定，即得。
指標(biāo)性成分含量測定方法(2)：
對照品：荷葉堿
色譜條件
Waters X-bridge TM shield C18色譜柱(4.6*250mm，5μm)，流動相為乙腈-水-三乙胺-冰醋酸(26.5∶71.1∶1.6∶0.8)等度洗脫，流速1.0mL/min，柱溫30℃，檢測波長270nm。
對照品溶液的制備
取荷葉堿對照品適量，加50％甲醇制成每1mL含荷葉堿16μg的混合溶液。
供試品溶液的制備
取本品40mg，精密稱定，50％甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL茶色量瓶中，加50％甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。
測定法
分別精密吸取對照品溶液50μL和供試品溶液50μL，注入液相色譜儀，測定，即得。
實施例3：丸劑
甜葉菊 300g 荷葉 200g
山楂 200g 三七 100g
按上述比例取原料藥飲片0.8kg，10倍量40％乙醇回流提取3次，每次提取2小時，減壓回收溶劑，得提取物，加水分散溶解，使水溶液濃度為0.067g/mL，水溶液通過弱極性或非極性大孔吸附樹脂，吸附流速為4BV/h，樹脂柱徑高比為1∶7，上樣液濃度為0.067g/mL，收集上樣流出液，然后水洗脫5BV，洗脫流速為4BV/h，收集洗脫液，合并上樣流出液與水洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即得富集物I；20％乙醇洗脫9BV，洗脫流速為3BV/h，收集洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即得富集物II；70％乙醇洗脫3BV，洗脫流速為4BV/h，收集洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即得富集物III。將制備物按比例配制即得組合物，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝制成丸劑；
總酚的含量測定方法：
對照品溶液的制備
取異綠原酸C對照品適量，精密稱定，加50％甲醇制成每1mL含75.2μg的溶液，即得。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
精密量取對照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL，分別置于25mL棕色量瓶中，加50％甲醇至5mL，加入0.3％十二烷基硫酸鈉溶液1.4mL，搖勻，加入新配置的0.6％三氯化鐵-0.9％鐵氰化鉀(1∶1)混合液4.0mL，在暗處放置5min，用0.1％的鹽酸定容至25ml，搖勻后于暗處靜置30min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(中國藥典附錄VA)，在766nm的波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測定法
取樣品適量，精密稱定，加50％甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100mL棕色量瓶中，加50％甲醇至刻度，搖勻既得供試品溶液，精密量取供試品溶液1mL，置25ml量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下方法，自“加50％甲醇至5mL”起依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中異綠原酸C重量，計算，即得。
總生物堿含量測定方法：
對照品溶液的制備
取荷葉堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含398μg的溶液，即得。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
精密量取對照品品溶液10μL、60μL、110μL、160μL、290μL，分別置于磨口圓底燒瓶中，60℃下減壓蒸干，依次加入pH2.2鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液1mL，溴甲酚綠溶液1mL，再精密加入5mL二氯甲烷，密塞，劇烈震搖2min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，靜置萃取2h，以相應(yīng)的試劑為空白，接收二氯甲烷層，照紫外-可見分光光度法(中國藥典附錄VA)在412nm的波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測定法
取樣品適量，精密稱定，加50％甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100mL棕色量瓶中，加50％甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密量取5mL，置于磨口圓底燒瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下方法，自“60℃下減壓蒸干”起，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中荷葉堿重量，計算，即得。
總萜含量測定方法：
對照品溶液的制備
取人參皂苷Rb1對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含136.8μg的溶液，即得。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
精密量取人參皂苷Rb1對照品溶液0.2mL、0.6mL、1.0mL、1.4mL、1.8mL、2.2mL、2.6mL，分別置于西林瓶中，沸水浴蒸干，冷卻至室溫，先加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.3mL，然后再加入高氯酸0.8mL，密塞，置于60℃水浴加熱15min，取出，置于冰水中冷卻3min，加入冰醋酸5mL，搖勻，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(中國藥典附錄VA)在552nm的波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測定法
取樣品適量，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取1mL，置于西林瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下方法，自“沸水浴蒸干”起依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中人參皂苷Rb1重量，計算，即得。
總氨基酸含量測定方法：
對照品溶液的制備
取三七素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含159.6μg的溶液，即得。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
精密量取對照品0.9mL、1.2mL、1.5mL、1.8mL、2.1mL、2.4mL、2.7mL、3.0mL，分別置于25mL棕色量瓶中，加水至6mL，再加入pH值為7的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液1mL，2％茚三酮乙醇溶液2mL，搖勻，置于沸水浴中20min，迅速冷卻至室溫，用水定容至25mL，搖勻，以相應(yīng)的溶劑為空白，照紫外-可見分光光度法(中國藥典附錄VA)在568nm的波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測定法
取樣品適量，精密稱定，加水溶解，轉(zhuǎn)移至50mL棕色量瓶中，加水至刻度，搖勻，既得供試品溶液。精密量取供試品溶液5mL，置于25mL棕色量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下方法，自“加水至6mL”起依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中三七素重量，計算，即得。
指標(biāo)性成分含量測定方法(1)：
對照品：異綠原酸C、金絲桃苷、甜菊苷、人參皂苷Rb1
色譜條件
Waters X-bridge TM shield C18色譜柱(5μm，4.6*250mm)，流動相為乙腈(A)-0.2％磷酸水(B)梯度洗脫(梯度條件見下表)，流速1.0mL/min，柱溫30℃，檢測波長203nm、254nm、327nm。
對照品溶液的制備
取異綠原酸C、金絲桃苷、甜菊苷、人參皂苷Rb1對照品適量，加50％甲醇制成每1mL含異綠原酸C24μg、金絲桃苷29μg、甜菊苷23μg、人參皂苷Rb113μg的混合溶液。
供試品溶液的制備
取本品100mg，精密稱定，50％甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL茶色量瓶中，加50％甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。
測定法
分別精密吸取對照品溶液50μL和供試品溶液50μL，注入液相色譜儀，測定，即得。
指標(biāo)性成分含量測定方法(2)：
對照品：荷葉堿
色譜條件：
Waters X-bridge TM shield C18色譜柱(4.6*250mm，5μm)，流動相為乙腈-水-三乙胺-冰醋酸(26.5∶71.1∶1.6∶0.8)等度洗脫，流速1.0mL/min，柱溫30℃，檢測波長270nm。
對照品溶液的制備
取荷葉堿對照品適量，加50％甲醇制成每1mL含荷葉堿16μg的混合溶液。
供試品溶液的制備
取本品40mg，精密稱定，50％甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL茶色量瓶中，加50％甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。
測定法
分別精密吸取對照品溶液50μL和供試品溶液50μL，注入液相色譜儀，測定，即得。