本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，具體涉及一種以聚己內(nèi)酯作為主要基體材料并在表面涂上藥物的引導(dǎo)肌組織再生的膜材料及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

骨骼肌是人體的重要組織，骨骼肌的受損特別是肌肉纖維化的主要成因是受損肌肉增殖能力低于纖維化，一直以來，治療骨骼肌受損面臨諸多挑戰(zhàn)和困難。對于組織工程而言，植入材料的選擇是相當(dāng)?shù)闹匾?。與天然高分子不同，合成高分子分子儀器理化特性可控可調(diào)、質(zhì)量穩(wěn)定性優(yōu)良、價格便宜，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得很好的應(yīng)用。目前，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用占絕對優(yōu)勢的是生物可降解聚酯，如PLGA、PLA、PCL和PGA，這些都是FDA批準(zhǔn)認(rèn)證的，特別是聚己內(nèi)酯是一種比PGA和PLGA相對容易得到和價廉的生物可降解高分子材料PCL也是一種彈性材料，其力學(xué)性能優(yōu)良，廣泛應(yīng)用于骨組織工程領(lǐng)域。由于存在5個亞甲基相連的短碳鏈?zhǔn)蛊溆泻軓?qiáng)的疏水性，為了增強(qiáng)親水性需要對其表面進(jìn)行處理。而去甲腎上腺素是一種臨床藥物，含有兒茶酚和羥基，聚去甲腎上腺素作為紐帶既能與基板PC以共價鍵牢固連接也能錨定黏附相關(guān)蛋白，改變基板親水性，促進(jìn)蛋白的吸附，從而促進(jìn)肌肉細(xì)胞的增殖舒展，更有利于骨骼肌受損修復(fù)。

靜電紡絲技術(shù)是一種制備納米及微米纖維的簡單通用方法，由于其藥物加載方式簡單易行，在靜電紡絲或紡絲后處理過程中不同的藥物及生物大分子很容易加載到纖維表面，另外，肌肉修復(fù)的藥物在涂到纖維表面后不會發(fā)生性能變化，仍能保持其肌肉修復(fù)的性能，可以用來修復(fù)手術(shù)等肌肉的創(chuàng)傷。因此，電紡絲制備的納米微米纖維功能膜具有良好的臨床應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明目的在于提供一種功能化引導(dǎo)肌組織再生膜及其制備方法和應(yīng)用。

實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案如下：

一種功能化引導(dǎo)肌組織再生膜，其是以聚己內(nèi)酯為主要基體材料，通過靜電紡絲技術(shù)制備成的膜。

進(jìn)一步地，在上述功能化引導(dǎo)肌組織再生膜上通過聚合反應(yīng)形成致密去甲腎上腺素層；及結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)。

優(yōu)選地，所述促進(jìn)細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)為堿性成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子家族(IGF)、肝素、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、血小板源相關(guān)的生長因子等中的一種或幾種。

其中,堿性成纖維細(xì)胞生長因子廣泛分布在骨骼肌細(xì)胞，可以調(diào)節(jié)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化活性，促進(jìn)其增殖效果。胰島素樣生長因子家族(IGF)，包括胰島素樣生長因子II和胰島素樣生長因子I兩種，在骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的損傷后，IGF發(fā)揮明顯的促進(jìn)再生作用。肝素是一個重要的細(xì)胞因子，能促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞增殖，還可以激活休眠的衛(wèi)星細(xì)胞。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)家族主要包括TGF-α和TGF-β，TGF-β又分為TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，它對外基質(zhì)的沉積促進(jìn)具有促進(jìn)作用。此外，血小板源相關(guān)的生長因子在維持組織生長和功能活性方面有重要作用。上述促進(jìn)細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)通過細(xì)胞間信號的相互傳遞，在骨骼肌損傷的修復(fù)過程中扮演重要的角色。

優(yōu)選地，所述再生膜具有無規(guī)排列的微米級纖維結(jié)構(gòu)，平均搭橋孔徑為1-16μm。

優(yōu)選地，所述再生膜是由直徑范圍為1-20μm的纖維組成的多層多孔膜。

優(yōu)選地，所述再生膜膜厚度為50-500μm。

本發(fā)明還提供上述功能化引導(dǎo)肌組織再生膜的制備方法，包括以下步驟：將聚己內(nèi)酯溶于有機(jī)溶劑中，制得A溶液；然后進(jìn)行靜電紡絲，制得電紡絲纖維膜，干燥即得功能化引導(dǎo)肌組織再生膜。

進(jìn)一步地，上述制備方法還包括將去甲腎上腺素和促進(jìn)細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)溶于Tris-HCl溶液或PBS緩沖液中，制得B溶液；將所得電紡絲纖維膜浸泡在上述B溶液中一定時間，取出后干燥，即得。

所述干燥可為風(fēng)干、冷凍干燥或真空干燥。

優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑為氯仿，或氯仿與乙醇的混合物。乙醇與氯仿的體積比為7:10-7:1，例如可以是7:10，7:9，7:8，7:7，7:6，7:5，7:4，7:3，7:2或7:1。將二者的摩爾比限定在上述范圍是為了避免因某種溶液過多或過少而影響紡絲過程。

優(yōu)選地，所述A溶液中聚己內(nèi)酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％-45％，例如可以是3％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％或45％。聚己內(nèi)酯濃度的高低直接影響纖維的直徑以及紡絲過程各項參數(shù)。

具體地，所述靜電紡絲包括以下步驟：

a、將上述A溶液置于注射器中，利用推進(jìn)器進(jìn)行推動，待液滴穩(wěn)定流下后調(diào)高電壓；

b、以不銹鋼滾軸為接收裝置，持續(xù)紡絲得到完整電紡絲纖維膜。

優(yōu)選地，步驟a所述推進(jìn)器的推進(jìn)速度(即紡絲液流動速率)為1-15mL/h，例如可以是1mL/h，2mL/h，3mL/h，5mL/h，6mL/h，8mL/h，10mL/h，12mL/h或15mL/h。研究發(fā)現(xiàn)，速度過快會導(dǎo)致紡絲溶液滴出或纖維直徑過大，速度過慢則會加長紡絲時間。

優(yōu)選地，步驟a所述電壓為7-20kV，例如可以是7kV，8kV，10kV，12kV，15kV，18kV或20kV。將電壓限制在此范圍內(nèi)是為了保證連續(xù)的纖維的順利形成，電壓過低紡絲溶液無法形成纖維，電壓過高則使紡絲過程不穩(wěn)定，導(dǎo)致紡絲不連續(xù)。

優(yōu)選地，步驟b所述接收距離為8-30cm，例如可以是8cm，10cm，12cm，15cm，18cm，20cm，22cm，25cm或30cm。

優(yōu)選地，步驟b所述不銹鋼滾軸的速度為100-2000rmp，例如可以是100rmp，200rmp，400rmp，500rmp，800rmp，1000rmp，1200rmp，1500rmp，1800rmp或2000rmp。

優(yōu)選地，步驟b所述紡絲時間為2-30h，例如可以是2h，4h，8h，10h，15h，20h，25h或30h。

優(yōu)選地，上述B溶液中溶劑為Tris-HCl溶液或PBS溶液，pH值分別為8-10，例如可以是8，8.5，9，9.5或10。其中，Tris-HCl溶液采用Tris配置，PBS緩沖液采用Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和KCl配置，用HCl或者NaOH調(diào)節(jié)pH值。

優(yōu)選地，上述B溶液中去甲腎上腺素和促進(jìn)細(xì)胞生長細(xì)胞因子的濃度分別為0.1-10mg/ml，例如可以是0.1mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml，1.5mg/ml，2mg/ml，4mg/ml，6mg/ml，8mg/ml或10mg/ml。

具體地，上述功能化引導(dǎo)肌組織再生膜的制備方法，包括以下步驟：

(一)纖維直徑為1-8微米的功能化引導(dǎo)肌組織再生膜的制備

(1)將聚己內(nèi)酯溶于氯仿中，室溫磁力攪拌12-24h，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3-45％的聚己內(nèi)酯溶液；

(2)將上述聚己內(nèi)酯溶液進(jìn)行靜電紡絲，以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉(zhuǎn)動速率為100-2000rpm，紡絲液流動速率為1-15mL/h，電壓7-20kV，接收距離8-30cm，紡絲2-30h，得到厚度50-500μm的電紡絲纖維膜；

(3)將所得電紡絲纖維膜浸泡在溶有去甲腎上腺素和促進(jìn)細(xì)胞生長細(xì)胞因子的Tris-HCl溶液中12-24h，取出后在通風(fēng)櫥中室溫放置2-7天，即得；

(二)纖維直徑為8-20微米的功能化引導(dǎo)肌組織再生膜的制備

(1)將聚己內(nèi)酯溶于氯仿與乙醇的混合溶劑中(優(yōu)選地，氯仿與乙醇的體積比為7:3)，室溫磁力攪拌12-24h，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14-30％的聚己內(nèi)酯溶液；

(2)將上述聚己內(nèi)酯溶液進(jìn)行靜電紡絲，以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉(zhuǎn)動速率為700-2600rpm，紡絲液流動速率為2-20mL/h，電壓12-25kV，接收距離10-35cm，紡絲1-30h，得到厚度100-600μm的電紡絲纖維膜；

(3)將所得電紡絲纖維膜浸泡在溶有去甲腎上腺素和促進(jìn)細(xì)胞生長細(xì)胞因子的Tris-HCl溶液中12-24h，取出后在通風(fēng)櫥中室溫放置2-7天，即得。

本發(fā)明還提供上述功能化引導(dǎo)肌組織再生膜的另一種制備方法，包括以下步驟：

(三)纖維直徑為1-8微米的功能化引導(dǎo)肌組織再生膜的制備

(1)將聚己內(nèi)酯溶于氯仿與乙醇的混合溶劑中(優(yōu)選地，氯仿與乙醇的體積比為7:3)，中，室溫磁力攪拌12-24h，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-19％的聚己內(nèi)酯溶液；

(2)將上述聚己內(nèi)酯溶液進(jìn)行靜電紡絲，以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉(zhuǎn)動速率為100-2000rpm，紡絲液流動速率為0.5-10mL/h，電壓7-20kV，接收距離8-30cm，紡絲0.5-30h，得到厚度25-250μm的電紡絲纖維膜；

(3)將所得電紡絲纖維膜浸泡在溶有去甲腎上腺素和促進(jìn)細(xì)胞生長細(xì)胞因子的PBS緩沖溶液中12-24h，然后將其在-60℃～-20℃下冷凍6-12h后，真空干燥4-12h，即得；

(四)纖維直徑為8-20微米的功能化引導(dǎo)肌組織再生膜的制備

(1)將聚己內(nèi)酯溶于氯仿與乙醇的混合溶劑中(優(yōu)選地，氯仿與乙醇的體積比為7:3)，室溫磁力攪拌12-24h，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13-29％的聚己內(nèi)酯溶液；

(2)將上述聚己內(nèi)酯溶液進(jìn)行靜電紡絲，以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉(zhuǎn)動速率為500-2000rpm，紡絲液流動速率為0.5-10mL/h，電壓14-30kV，接收距離10-30cm，紡絲1.5-30h，得到厚度70-400μm的電紡絲纖維膜；

(3)將所得電紡絲纖維膜浸泡在溶有去甲腎上腺素和促進(jìn)細(xì)胞生長細(xì)胞因子的PBS緩沖溶液中15-24h，然后將其在-60℃～-20℃下冷凍6-12h后，真空干燥4-12h，即得。

本發(fā)明還包括上述功能化引導(dǎo)肌組織再生膜在制備促進(jìn)肌組織再生修復(fù)的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述功能化引導(dǎo)肌組織再生膜是以聚己內(nèi)酯為主要原材料并涂上促進(jìn)肌肉修復(fù)的藥物，通過靜電紡絲的方法制備引導(dǎo)肌組織再生膜；本發(fā)明膜材料具有優(yōu)異的生物相容性、機(jī)械性能和能有效的促進(jìn)肌組織的再生修復(fù)。

附圖說明

圖1是實施例1-4制得膜的掃描電鏡(SEM)照片。2P、2PP分別表示1-3μm直徑的PCL纖維膜和表面聚合聚甲腎上腺素的1-3μm直徑的PCL纖維膜。10P、10PP分別表示8-12μm直徑的PCL纖維膜和表面聚合聚甲腎上腺素的8-12μm直徑的PCL纖維膜。

圖2是實施例1-4制得膜的X射線光電子譜XPS表征(a)和聚甲腎上腺素在膜上固定率(b)。

圖3是實施例3-4制得膜的聚去甲腎上腺素(PNE)在膜上釋放曲線。

圖4是實施例1-4制得膜體外降解99天的質(zhì)量損失圖。

圖5是實施例1-4制得膜降解33天后的掃描電鏡(SEM)圖。

圖6是實施例1-4制得膜的細(xì)胞毒性圖。

圖7是實驗例4細(xì)胞在膜上生長3d時的狀態(tài)圖。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購買得到的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1

1)將3g聚己內(nèi)酯(PCL)溶于20mL氯仿與乙醇(體積比7:3)的混合溶劑中，室溫磁力攪拌12h，得到聚己內(nèi)酯濃度為15％(w/v)的紡絲液。

2)將所述紡絲液進(jìn)行靜電紡絲，以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉(zhuǎn)速為200rpm，電壓20KV，接收距離為20cm，紡絲液進(jìn)液速率10mL/h，紡絲5h。得到厚度為250μm左右的電紡絲纖維膜。將膜在-60℃～-20℃下冷凍6-12h后，真空干燥4-12h，保證殘余溶劑充分揮發(fā)。此方法得到的膜命名為2P；其掃描電鏡結(jié)果如圖1所示，2P的纖維直徑在1-3μm左右。

實施例2

1)將3.5g聚己內(nèi)酯(PCL)溶于20mL氯仿溶劑中，室溫磁力攪拌12h，得到聚己內(nèi)酯濃度為17.5％(w/v)的紡絲液。

2)將所述紡絲液進(jìn)行靜電紡絲，以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉(zhuǎn)速為700rpm，電壓15KV，接收距離為15cm，紡絲液進(jìn)液速率3.6mL/h，紡絲4h。得到厚度為500μm左右的電紡絲纖維膜。將膜在-60℃～-20℃下冷凍6-12h后，真空干燥4-12h，保證殘余溶劑充分揮發(fā)。此方法得到的膜命名為10P；其掃描電鏡結(jié)果如圖1所示，10P的纖維直徑在8-12μm左右。

實施例3

1)將3g聚己內(nèi)酯(PCL)溶于20ml氯仿與乙醇(體積比7:3)的混合溶劑中，室溫磁力攪拌12h，得到聚己內(nèi)酯濃度為15％(w/v)的紡絲液。

2)將所述紡絲液進(jìn)行靜電紡絲，以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉(zhuǎn)速為200rpm，電壓20KV，接收距離為20cm，紡絲液進(jìn)液速率10mL/h，紡絲5h。得到厚度為250μm左右的電紡絲纖維膜。

3)將所得電紡絲纖維膜浸泡在溶有去甲腎上腺素和促進(jìn)細(xì)胞生長的細(xì)胞因子的PBS緩沖溶液(pH＝8.3，10mM)中，去甲腎上腺素和促進(jìn)細(xì)胞生長的細(xì)胞因子濃度分別為0.1mg/mL。將膜在-60℃～-20℃下冷凍6-12h后，真空干燥4-12h，保證殘余溶劑充分揮發(fā)。此方法得到的膜命名為2PP；其掃描電鏡結(jié)果如圖1所示，2PP表面聚合聚甲腎上腺素后，纖維直徑在8-12μm左右。

實施例4

1)將3.5g聚己內(nèi)酯(PCL)溶于20ml氯仿與乙醇(體積比7:3)的混合溶劑中,室溫磁力攪拌12h，得到聚己內(nèi)酯濃度為17.5w/v％的紡絲液。

2)將所述紡絲液進(jìn)行靜電紡絲，以不銹鋼滾筒為接收裝置，滾筒轉(zhuǎn)速為200rpm，電壓15KV，接收距離為15cm，紡絲液進(jìn)液速率3.6mL/h，紡絲5h。得到厚度為500μm左右的電紡絲纖維膜。

3)將所得電紡絲纖維膜浸泡在溶有去甲腎上腺素和促進(jìn)細(xì)胞生長的細(xì)胞因子的PBS緩沖溶液(pH＝8.3，10mM)中，所述去甲腎上腺素和促進(jìn)細(xì)胞生長的細(xì)胞因子的濃度為0.1mg/mL。將膜在-60℃～-20℃下冷凍6-12h后，真空干燥4-12h，保證殘余溶劑充分揮發(fā)。此方法得到的膜命名為10PP；其掃描電鏡結(jié)果如圖1所示，10PP表面聚合聚甲腎上腺素后，纖維直徑在8-12μm左右。

實驗例1

將實施例1-4中的4種膜(2P、2PP、10P、10PP)剪成2mm×2mm的尺寸，用鋁X射線源(hυ＝1486.6eV)作為發(fā)射源的X射線光電子能譜(XPS)，操作電壓15kV和電流15mA(225W)。采用混合電鏡模式在分析面積大約300μm×700μm的靜電和磁場作用。對于每一個樣品，相對于樣品表面射出角為0°，允許最大探測深度為10納米。用160eV的能量掃描樣品，獲得0–1200eV范圍的結(jié)合能，再根據(jù)每種元素都有特定的能量，從而確定表面元素組成及含量。上述4種膜(2P、2PP、10P、10PP)的X射線光電子譜XPS表征見圖2(a)，聚甲腎上腺素在膜上固定率見圖2(b)。

由圖2可知，在氮元素譜圖里2PP的氮元素的含量是10PP的2倍，而且在2PP的氮碳比為5.87比10PP的2.94更接近去甲腎上腺素本身的氮炭比，也說明前者涂PNE的量多，同樣在高分辨碳譜里，2PP的碳氮鍵是10PP的2倍，這主要是2P的直徑小于10P的緣故。

實驗例2

將實施例1-4中制備的4種膜(2P，10P，2PP，10PP)打成48孔板孔徑大小圓片，滅菌(紫外照射正反面各10min)，鋪在48孔板里，75％乙醇浸泡30min，紫外照射10min，用封口膜密封，存放在4℃。待細(xì)胞處于對數(shù)期時，消化L6細(xì)胞，接種在鋪有2種膜的48孔板里，培養(yǎng)1d、3d、5d、7d，每孔分別接種3×10⁵、2×10⁵、1×10⁵、8×10⁴個細(xì)胞，每孔加600μl(3d、5d和7d實行隔一天半換液)，每一種膜設(shè)6個平行和3個只加培養(yǎng)基的平行空白組。用鑷子取出膜分別放在新的48孔板里，吸出兩塊板子里的細(xì)胞液，再各向其加220μL的10％CCK-8，培養(yǎng)1-4h，對應(yīng)吸出110μL的10％cck8培養(yǎng)液加入到96孔板里，測OD₄₅₀值。上述4種膜(2P、2PP、10P、10PP)的細(xì)胞毒性結(jié)果見圖6。

如圖6所示，成肌細(xì)胞在四種膜的增殖情況不同，2P和2PP比10P和10PP更加促進(jìn)細(xì)胞的增殖，2PP和10PP比2P和10P更加促進(jìn)細(xì)胞的增殖，這與有關(guān)報道相符，即細(xì)胞的增殖和貼壁主要靠黏附斑，黏附斑的大小主要受黏附蛋白的影響，直徑越小，比表面積越大，吸附的PNE的量越多，其固定黏附蛋白的量越多，細(xì)胞增殖越強(qiáng)。但是在5天的時候2PP與2P增值幅度小于10P與10PP增值幅度小，主要是由于2PP的纖維由于細(xì)胞比10PP的細(xì)胞多，而細(xì)胞生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)有限及細(xì)胞的接觸抑制，使得2PP纖維膜上的細(xì)胞增值速度比10PP慢。

實驗例3膜的降解實驗：

1)質(zhì)損率：將已知質(zhì)量的實施例1-4中制備的4種膜(2P、2PP、10P和10PP)分別放入裝有20ml生理鹽水的瓶里，擰緊蓋并放在37度的恒溫培養(yǎng)箱里，每11天取出來干燥并分別稱其質(zhì)量，根據(jù)以下公式計算質(zhì)損率：質(zhì)損率％＝(m_t-m₀)/m₀，其中m_t是每種膜每個時間點取出來干燥后的質(zhì)量，m₀是每種膜的起始質(zhì)量。上述4種膜(2P、2PP、10P、10PP)的質(zhì)損率見圖4。

2)膜降解的SEM圖片：將一定量的實施例1-4中制備的四種膜(2P、2PP、10P和10PP)分別放入裝有20ml生理鹽水的瓶里，擰緊蓋并放在37度的恒溫培養(yǎng)箱里，每11天取出來，干燥兩天后用冷場發(fā)射掃描電鏡S4800做SEM。上述4種膜(2P、2PP、10P、10PP)的降解的SEM圖片表征見圖5。

3)聚去甲腎上腺素(PNE)殘余量測定：將已知質(zhì)量的實施例3，4中制備的2種膜(2PP和10PP)分別放入裝有20ml生理鹽水的瓶里，擰緊蓋并放在37度的恒溫培養(yǎng)箱里，每隔2天取出1ml生理鹽水，同時補(bǔ)充1ml新鮮的生理鹽水，利用熒光分光光度計測定取出的1ml生理鹽水中PNE濃度，激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為410nm和505nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到20ml生理鹽水中PNE的總質(zhì)量。根據(jù)以下公式計算PNE殘余量：PNE殘余量＝(m₁-m₂)/m₁，其中m₂是每種膜每個時間點降解下來的PNE的質(zhì)量，m₁是膜上PNE原始質(zhì)量。上述2種膜(2PP和10PP)的PNE殘余量表征見圖3。

為了解這4種膜在動物體內(nèi)的降解情況，模擬體內(nèi)的內(nèi)環(huán)境，將四種膜置于等量且充量的生理鹽水中，每隔11天稱重量及做SEM觀察形貌的變化。如圖4所示，4種膜在99天里質(zhì)量基本沒有變化，但是在280天的SEM圖里，4種纖維直徑變小，這也滿足了組織工程的可降解支架的要求。

實驗例4

細(xì)胞形態(tài)觀察實驗與實驗例2細(xì)胞培養(yǎng)的過程一致，每個時間點，無菌操作取出兩種膜(2PP和10PP)并放入新的48孔板，用PBS清洗三遍(血清影響多聚甲醛的固定)，每孔加入500微升的4％多聚甲醛室溫固定30min，吸凈液體，用PBS洗3遍，每次洗5min。將羅丹明標(biāo)記的PI(phallodin)的甲醇溶液以1:200比例用0.2％Triton/PBS稀釋，每孔加400μL，室溫避光0.5h，用PBS洗3遍，每次洗5min。吸干液體，每孔加入400μL的DAPI溶液，室溫避光15min，用PBS洗3遍，每次洗5min，然后把膜放到蓋玻片上，有細(xì)胞的那面朝上，滴上一滴防猝滅固封劑，然后蓋上載玻片，再倒置一下，使有細(xì)胞面朝下，室溫保持8min。使用confocal熒光顯微鏡在403nm和543nm通道下拍出藍(lán)色的細(xì)胞核及紅色的微管蛋白的照片。上述4種膜(2P、2PP、10P、10PP)對細(xì)胞形態(tài)的影響見圖7。

結(jié)果如圖7所示，在所有條件相同的條件下，2PP比10PP細(xì)胞數(shù)多及細(xì)胞伸展性更好。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。