本發(fā)明涉及一種抗菌殼聚糖敷料，尤其涉及一種含納米金的抗菌殼聚糖敷料，以及該抗菌殼聚糖敷料的制備和應用。

背景技術(shù)：

殼聚糖是一種可降解的生物相容性材料，殼聚糖可在傷口處提供非蛋白基質(zhì)促進細胞增殖、組織生長。殼聚糖帶有正電荷，能與帶負電荷的紅細胞結(jié)合，促進紅細胞聚集而有助于止血。殼聚糖敷料是一類性能優(yōu)異的用生物材料做成的敷料。

單純的殼聚糖敷料不具有理想的殺菌抑菌作用。在殼聚糖敷料中添加抗菌劑將提高該敷料的抗菌性，更加完善其功能。納米銀有較強的抗菌性能，但是由于納米銀的不穩(wěn)定性以及對人體細胞的毒性較大，美國FDA已經(jīng)明確禁止納米銀在醫(yī)療方面的使用，我國CFDA在某些醫(yī)用方面限制了納米銀的使用。

近年來，穩(wěn)定性更好、對人體細胞毒性更小的納米金作為抗菌劑的研究逐漸被報道。Zhao yuyun等(Zhao Y,Tian Y,Cui Y,et al.Small molecule-capped gold nanoparticles as potent antibacterial agents that target gram-negative bacteria[J].Journal of the American Chemical Society,2010,132(35):12349-12356；Zhao Y,Chen Z,Chen Y,et al.Synergy of non-antibiotic drugs and pyrimidinethiol on gold nanoparticles against superbugs[J].Journal of the American Chemical Society,2013,135(35):12940-12943.和Zhao Y,Ye C,Liu W,et al.Tuning the composition of AuPt bimetallic nanoparticles for antibacterial application[J].Angewandte Chemie International Edition,2014,53(31):8127-8131.)報道的氨基嘧啶或氨基嘧啶/含氨基小分子的雙組份藥物修飾的納米金抗菌劑和納米金鉑雙金屬抗菌劑有很強的廣譜抗菌性，特別對多藥耐藥菌有很強的殺滅作用，其對人體細胞的毒性遠遠低于納米銀，并且不會產(chǎn)生細菌耐藥性，是一類非常有前途的抗菌劑。Anna Regiel-Futyra(Regiel-Futyra A,M,Sebastian V,et al.Development of Noncytotoxic Chitosan–Gold Nanocomposites as Efficient Antibacterial Materials[J].ACS applied materials&interfaces,2015,7(2):1087-1099.)報道的殼聚糖絡(luò)合的納米金也具有優(yōu)異的抗菌性和對人體細胞低的毒性。

上述報道合成的納米金需要透析處理，工藝較復雜，工藝有待進一步簡化；單純的納米金溶液不易用于臨床的傷口治療與修復，抗菌性能有待進一步提高。

目前，國內(nèi)外尚無公開文獻報道添加有廣譜抗菌性而細胞毒性小的納米金制作的抗菌殼聚糖敷料。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

因此，基于現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種具有廣譜抗菌性且對細胞毒性小的含納米金的抗菌殼聚糖敷料，還提供了所述含納米金的抗菌殼聚糖敷料的制備方法及其應用。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種含納米金的抗菌殼聚糖敷料，所述抗菌殼聚糖敷料為包含和/或附著有具有抗菌作用的含金納米顆粒的殼聚糖織物。

根據(jù)本發(fā)明的抗菌殼聚糖敷料，其中，所述殼聚糖織物可以為無紡織物、機織織物或針織織物。

根據(jù)本發(fā)明的抗菌殼聚糖敷料，其中，所述含金納米顆粒占所述抗菌殼聚糖敷料的0.01～3質(zhì)量％，可以優(yōu)選為0.01～1質(zhì)量％。

根據(jù)本發(fā)明的抗菌殼聚糖敷料，其中，所述含金納米顆粒的平均粒徑為50nm以下，可以優(yōu)選為2～10nm，例如4～6nm。

根據(jù)本發(fā)明的抗菌殼聚糖敷料，其中，所述具有抗菌性能的含納米金的納米顆粒選自納米金、由單組份或多組分小分子藥物或大分子修飾的納米金、以及含納米金的雙組份或多組分金屬納米顆粒中的一種或多種。

優(yōu)選地，所述由單組份或多組分小分子藥物或大分子修飾的納米金為以含氨基嘧啶類小分子作為單組份修飾的納米金顆?；蛞院被奏ゎ愋》肿?氨基類小分子作為雙組份修飾的納米金顆粒，所述含氨基嘧啶類小分子與金元素的摩爾含量比為0.5:1～2:1，所述氨基類小分子與金元素的摩爾含量比為0.5:1～2:1。最優(yōu)選地，所述含氨基嘧啶類小分子為4,6-2氨基-2-巰基嘧啶，氨基類小分子為二甲雙胍或1-(3-氯酚)雙胍。

或優(yōu)選地，所述含納米金的雙組份或多組分金屬納米顆粒為納米金-鉑雙金屬納米顆粒。最優(yōu)選地，所述納米金-鉑雙金屬納米顆粒由80％原子百分比的金和20％原子百分比的鉑組成。

本發(fā)明還提供了上述含納米金的抗菌殼聚糖敷料的制備方法，所述方法包括以下步驟：

(1)將殼聚糖溶解在乙酸溶液中，得到殼聚糖乙酸溶液；

(2)將納米金溶液與步驟(1)得到的殼聚糖乙酸溶液混合均勻，靜置消泡，然后用乙酸調(diào)節(jié)溶液pH值為4.5～5.5，得到納米金殼聚糖紡絲液；所述納米金溶液為含有所述具有抗菌作用的含金納米顆粒的分散液；

(3)將步驟(2)得到的納米金殼聚糖紡絲液通過噴絲帽擠出，進入凝固液中進行凝固，得到含納米金的抗菌殼聚糖纖維；

(4)將步驟(3)得到的含納米金的抗菌殼聚糖纖維進行拉伸、干燥，得到含納米金的抗菌殼聚糖長纖維，然后制備為所述含納米金的抗菌殼聚糖敷料。

通過在殼聚糖紡絲液中添加具有抗菌作用的含金納米顆粒，然后再紡絲得到含納米金的抗菌殼聚糖纖維，繼而制備為含納米金的殼聚糖敷料(例如殼聚糖織物)，可以使含金納米顆粒更均勻牢固地分布于殼聚糖纖維內(nèi)(本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，纖維表面也可能附著有含金納米顆粒)，從而使殼聚糖織物包含和/或附著有具有抗菌作用的含金納米顆粒。

所述含納米金的抗菌殼聚糖長纖維可以通過常規(guī)手段制備為殼聚糖織物，如無紡織物、機織織物或針織織物等。例如，含納米金的抗菌殼聚糖長纖維經(jīng)過開松、成網(wǎng)、針刺制得無紡織物。

所制得的殼聚糖敷料可經(jīng)進一步分切、包裝、滅菌等操作以按需制備敷料成品。

根據(jù)本發(fā)明的抗菌殼聚糖敷料的制備方法，其中，所述乙酸溶液的濃度為0.3～0.9mol/L。

根據(jù)本發(fā)明的抗菌殼聚糖敷料的制備方法，其中，所述凝固液包含選自氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液和堿性氨類溶液中的一種或多種，優(yōu)選為氫氧化鈉溶液。更優(yōu)選地，所述氫氧化鈉溶液的濃度為0.5～1.2mol/L。進一步優(yōu)選地，所述凝固液還包含有機溶劑，所述有機溶劑優(yōu)選為乙醇。

根據(jù)本發(fā)明的抗菌殼聚糖敷料的制備方法，其中，步驟(4)中的所述拉伸為2～5倍拉伸，所述拉伸在60～90℃下進行。優(yōu)選地，步驟(4)中所述干燥的溫度為60～90℃，時間為1～5h。

根據(jù)本發(fā)明的抗菌殼聚糖敷料的制備方法，其中，所述納米金溶液是通過以下步驟制得：

(a)按照配比，將氯金酸溶液與含氨基嘧啶類小分子和/或氨基類小分子的溶液或氯鉑酸鉀溶液混合，得到混合溶液；

(b)在攪拌下向所述混合溶液中快速加入還原劑，充分反應后即得到所述納米金溶液；

其中，所述還原劑的加入時間不超過5分鐘，優(yōu)選不超過1分鐘，更優(yōu)選5～60秒，進一步優(yōu)選5～30秒，例如25秒。

優(yōu)選地，步驟(a)中所述含氨基嘧啶類小分子和/或氨基類小分子的溶液還可以包括有機酸或無機酸。優(yōu)選為乙酸、丙酸或鹽酸。更優(yōu)選地，酸在所述混合溶液中的質(zhì)量百分比為0.01％～10％。

優(yōu)選地，步驟(a)中所述含氨基嘧啶類小分子和/或氨基類小分子的溶液中還可以包括非離子表面活性劑。優(yōu)選為吐溫或聚乙二醇。更優(yōu)選地，非離子表面活性劑在所述混合溶液中的質(zhì)量百分比為0.005～10％，優(yōu)選0.005～0.01％。

優(yōu)選地，步驟(b)中所述還原劑可以選自硼氫化鈉、檸檬酸鈉和抗壞血酸鈉中的一種或多種。步驟(b)中所述充分反應溫度可以為室溫或室溫以下，例如可以為25℃以下，時間可以為0.5～3小時，例如為1小時。

優(yōu)選地，步驟(b)中所述含納米金的納米顆粒在所述納米金溶液中的濃度為10～4000ppm，優(yōu)選為400～4000ppm，更優(yōu)選為800～4000ppm。更進一步優(yōu)選地，所述還原劑與氯金酸的摩爾比或者所述還原劑與氯金酸和氯鉑酸鉀的摩爾比為0.5～10:1，優(yōu)選為0.5～3:1。其中，1ppm通?？蓳Q算為1mg/L。

更優(yōu)選地，所述納米金溶液的制備方法不包含純化所述納米金溶液的步驟；進一步優(yōu)選地，純化所述納米金溶液的步驟包括用透析袋透析處理或離心過濾處理。換言之，本發(fā)明生產(chǎn)方法不需要用透析袋透析處理或離心過濾處理等方式來純化納米金溶液。作為更進一步的限定，上述納米金溶液的制備方法也可以表述為由步驟(a)和步驟(b)組成。

本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，在制備氯金酸溶液時使用的氯金酸原料可以為四水合氯金酸。

本發(fā)明還提供了上述含納米金的抗菌殼聚糖敷料或按照上述方法而制備的含納米金的抗菌殼聚糖敷料在制備用于治療燒傷、燙傷或褥瘡感染的藥物中的應用。

本發(fā)明制得的含納米金的抗菌殼聚糖敷料將具有優(yōu)異的廣譜抗菌性，無細菌耐藥性，對人體細胞毒性小的抗菌納米金添加到殼聚糖敷料中，使它兼具納米金的廣譜抗菌性而對人體細胞毒性小的作用和殼聚糖良好的促愈合、止血、生物可降解相容性?？捎糜谂R床的傷口處理，以及治療各種燒傷、燙傷、褥瘡感染等各種創(chuàng)傷感染，是一種極為優(yōu)良的醫(yī)用敷料。而且，本發(fā)明采用在殼聚糖紡絲液中添加抗菌納米金，然后紡絲得到含納米金的殼聚糖敷料，會使納米金更均勻牢固的分布于殼聚糖纖維內(nèi)，抗菌效果更佳。

現(xiàn)有技術(shù)已報道的抗菌納米金的制備方法中，還原劑是以滴加的方式加入，對于工業(yè)化生產(chǎn)，背景報道的滴加方式耗時太長，不能實現(xiàn)，而在本發(fā)明提供的納米金溶液的制備方法中，還原劑為一次性快速加入到所述混合溶液，因此更節(jié)約時間，有助于提升生產(chǎn)效率。

背景報道的納米金溶液在反應完成后需要用透析袋透析或離心沉淀，對于工業(yè)化生產(chǎn)，背景報道的后處理方法復雜，設(shè)備昂貴。而在本發(fā)明提供的納米金溶液的制備方法不需要透析或離心沉淀處理，因此工藝更為簡單，降低了生產(chǎn)成本，進一步提升了生產(chǎn)效率。

通過試驗檢測證明，本發(fā)明提供的制備方法所制備的納米金溶液的抗菌效果遠優(yōu)于還原劑滴加和/或經(jīng)過透析處理所制備的納米金溶液。本發(fā)明提供制備方法所制備的納米金溶液的細胞毒性明顯低于納米銀溶液和硝酸銀溶液。此外，本發(fā)明提供的含納米金的抗菌殼聚糖敷料與含同一類型同一質(zhì)量百分比的納米金抗菌溶液相比，抗菌效果更優(yōu)。

附圖說明

以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中：

圖1示出了實施例1納米金與商購納米銀透射電鏡(TEM)圖；

圖2示出了實施例1納米金、商購納米銀、商購硝酸銀的細胞毒性比較。

具體實施方式

下面通過具體的實施例進一步說明本發(fā)明，但是，應當理解為，這些實施例僅僅是用于更詳細具體地說明之用，而不應理解為用于以任何形式限制本發(fā)明。

本部分對本發(fā)明試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性的描述。雖然為實現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，在上下文中，如果未特別說明，本發(fā)明所用材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的。

以下實施例中使用的試劑和儀器如下：

試劑：

儀器：

電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP-OES)；型號iCAP 6300；購自：美國Thermo Scientific公司

透射電子顯微鏡(TEM)；型號Tecnai G2 20S-TWIN；購自：美國FEI公司

實施例1

本實施例用于說明本發(fā)明的含納米金的抗菌殼聚糖敷料及其制備方法。

(1)將50g殼聚糖溶解在1000mL的0.90mol/L乙酸溶液中，得到殼聚糖乙酸溶液；

(2)將含有1.5g的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金顆粒的納米金溶液與步驟(1)得到的殼聚糖乙酸溶液混合均勻，靜置消泡，然后用乙酸調(diào)節(jié)溶液pH值為5，得到納米金殼聚糖紡絲液；

(3)將步驟(2)得到的納米金殼聚糖紡絲液通過噴絲帽擠出，進入1.2mol/L的氫氧化鈉溶液中進行凝固，得到含納米金的抗菌殼聚糖纖維；

(4)將步驟(3)得到的含納米金的抗菌殼聚糖纖維進行拉伸(60℃下的2倍拉伸)、干燥(60℃下干燥5h)，得到含納米金的抗菌殼聚糖長纖維，然后對該抗菌殼聚糖長纖維進行開松、成網(wǎng)、針刺，制成含納米金的殼聚糖無紡織物，可作為含納米金的抗菌殼聚糖敷料；

(5)還可以把無紡織物分切為敷料片，隨后進行包裝、滅菌，成為含納米金的抗菌殼聚糖敷料成品。

上述納米金溶液的制備方法為：

(a)將3g的四水合氯金酸溶于0.75L的去離子水中，得到氯金酸溶液。將一定量的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶和二甲雙胍溶于0.75L的去離子水中，還加入一定量的吐溫80和乙酸，以有助于促進氨基嘧啶類小分子與氨基類小分子充分溶解于水中，得到含氨基嘧啶類小分子和/或氨基類小分子的溶液。將兩溶液混合，得到混合溶液。

(b)將一定量的抗壞血酸鈉溶于0.325L的去離子水中，在攪拌下將上述抗壞血酸鈉溶液快速加入(用時30s)到上述混合溶液中，在室溫以下攪拌1小時至充分反應，不需采用透析等純化工藝，即得到約1.875L的濃度約為800ppm的(按照投料比算出的)含有上述4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金顆粒的納米金溶液。

根據(jù)投料比，4,6-2氨基-2-巰基嘧啶與金元素的摩爾含量比為2:1，二甲雙胍與金元素的摩爾含量比為0.5:1，還原劑抗壞血酸鈉與氯金酸的摩爾含量比為0.5:1，乙酸占納米金溶液的質(zhì)量百分比為0.01％，表面活性劑吐溫80占納米金溶液的質(zhì)量百分比為0.005％。

在該含納米金的抗菌殼聚糖敷料中，經(jīng)ICP-OES測定，每片殼聚糖敷料的含金量為3質(zhì)量％。經(jīng)200KV六硼化鑭透射電子顯微鏡測定，該敷料中的納米金顆粒的平均粒徑為5nm。

對比例1

按照與實施例1相同的制備方法制得對比例1的納米金抗菌溶液，再通過常溫溶劑水的蒸發(fā)，配制成不同濃度的納米金抗菌溶液，其中，包括與實施例1中的納米金殼聚糖敷料有相同的納米金質(zhì)量百分含量的納米金溶液。

對比例1.1

按照與對比例1相似的制備方法制得對比例1.1的納米金抗菌溶液。對比例1.1中還原劑溶液滴加的方式加入到反應溶液中，并且采用透析處理24小時的方式得到納米金抗菌溶液，加入純化水，使其與對比例1中的納米金抗菌溶液有相同的納米金質(zhì)量百分含量。

試驗例1

通過試驗例1中的抗菌實驗，證明對比例1的納米金抗菌溶液要優(yōu)于對比例1.1的納米金抗菌溶液?？咕Ч姳?。

比較方法如下：采用最小抑菌濃度MIC(mg/L)來衡量，采用微孔稀釋方法(National Committee for Clinical Laboratory Standards.，Methodsfor determining bactericidal activity of antimicrobial agents,M26-A,1999.)，將100μL不同濃度的對比例1和對比例1.1的納米金溶液分別加入到96微孔板中，10μL相同濃度(10⁴CFU/mL)的細菌培養(yǎng)液加入每個微孔中，37℃培養(yǎng)24小時后觀察，沒有可看見的細菌生長的微孔中最少的濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。

測試結(jié)果見表1。從測試結(jié)果可見，對比例1的納米金抗菌溶液的抗菌效果遠優(yōu)于對比例1.1的納米金抗菌溶液的抗菌效果。說明采用與對比例1制備方法相同的納米金溶液制備的含納米金的抗菌殼聚糖敷料，其抗菌效果也應遠優(yōu)于采用與對比例1.1制備方法相同的納米金溶液制備的含納米金的抗菌殼聚糖敷料。

表1對比例1和對比例1.1的納米金抗菌溶液的抗菌性能比較

實施例2

本實施例用于說明本發(fā)明的含納米金的抗菌殼聚糖敷料及其制備方法。

(1)將30g殼聚糖溶解在1000mL的0.30mol/L乙酸溶液中，得到殼聚糖乙酸溶液；

(2)將含有0.003g的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/1-(3-氯酚)雙胍作為雙組份小分子修飾的納米金顆粒的納米金溶液與步驟(1)得到的殼聚糖乙酸溶液混合均勻，靜置消泡，然后用乙酸調(diào)節(jié)溶液pH值為4.5，得到納米金殼聚糖紡絲液；

(3)將步驟(2)得到的納米金殼聚糖紡絲液通過噴絲帽擠出，進入0.5mol/L的氫氧化鈉溶液中進行凝固，得到含納米金的抗菌殼聚糖纖維；

(4)將步驟(3)得到的含納米金的抗菌殼聚糖纖維進行拉伸(90℃下的5倍拉伸)、干燥(90℃下干燥1h)，得到含納米金的抗菌殼聚糖長纖維，然后對該抗菌殼聚糖長纖維進行開松、成網(wǎng)、針刺，制成含納米金的殼聚糖無紡織物，可作為含納米金的抗菌殼聚糖敷料；

(5)還可以把無紡織物分切為敷料片，隨后進行包裝、滅菌，成為含納米金的抗菌殼聚糖敷料成品。

上述納米金溶液的制備方法為：

(a)將0.27g的四水合氯金酸溶于0.067L的去離子水中，得到氯金酸溶液。將一定量的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶和1-(3-氯酚)雙胍溶于0.067L的去離子水中，還加入一定量的吐溫80和乙酸，以有助于促進氨基嘧啶類小分子與氨基類小分子充分溶解于水中，得到含氨基嘧啶類小分子和/或氨基類小分子的溶液。將兩溶液混合，得到混合溶液。

(b)將一定量的抗壞血酸鈉溶于0.033L的去離子水中，在攪拌下將上述抗壞血酸鈉溶液快速加入(用時5s)到上述混合溶液中，在室溫以下攪拌1小時至充分反應，不需采用透析等純化工藝，即得到約0.167L的濃度約為800ppm的(按照投料比算出的)含有上述4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/1-(3-氯酚)雙胍作為雙組份修飾的納米金顆粒的納米金溶液。

根據(jù)投料比，4,6-2氨基-2-巰基嘧啶與金元素的摩爾含量比為0.5:1，1-(3-氯酚)雙胍與金元素的摩爾含量比為2:1，還原劑抗壞血酸鈉與氯金酸的摩爾含量比為3:1，乙酸占納米金溶液的質(zhì)量百分比為0.01％，表面活性劑吐溫80占納米金溶液的質(zhì)量百分比為0.01％。

在該含納米金的抗菌殼聚糖敷料中，經(jīng)ICP-OES測定，每片殼聚糖敷料的含金量為0.01質(zhì)量％。經(jīng)200KV六硼化鑭透射電子顯微鏡測定，該敷料中的納米金顆粒的平均粒徑為6nm。

對比例2

按照與實施例2相同的制備方法制得對比例2的納米金抗菌溶液，再通過常溫溶劑水的蒸發(fā)，制成納米金抗菌溶液，使其與實施例2中的納米金殼聚糖敷料有相同的納米金質(zhì)量百分含量。

實施例3

本實施例用于說明本發(fā)明的含納米金的抗菌殼聚糖敷料及其制備方法。

(1)將50g殼聚糖溶解在1000mL的0.50mol/L乙酸溶液中，得到殼聚糖乙酸溶液；

(2)將含有0.5g的金-鉑雙組分Au₈₀Pt₂₀納米顆粒的納米金溶液與步驟(1)得到的殼聚糖乙酸溶液混合均勻，靜置消泡，然后用乙酸調(diào)節(jié)溶液pH值為5.5，得到納米金殼聚糖紡絲液；

(3)將步驟(2)得到的納米金殼聚糖紡絲液通過噴絲帽擠出，進入0.8mol/L的氫氧化鈉溶液中進行凝固，得到含納米金的抗菌殼聚糖纖維；

(4)將步驟(3)得到的含納米金的抗菌殼聚糖纖維進行拉伸(70℃下的3倍拉伸)、干燥(70℃下干燥3h)，得到含納米金的抗菌殼聚糖長纖維，然后對該抗菌殼聚糖長纖維進行開松、成網(wǎng)、針刺，制成含納米金的殼聚糖無紡織物，可作為含納米金的抗菌殼聚糖敷料；

(5)還可以把無紡織物分切為敷料片，隨后進行包裝、滅菌，成為含納米金的抗菌殼聚糖敷料成品。

上述含納米金-鉑雙金屬納米顆粒的納米金溶液的制備方法為：

(a)將0.825g的四水合氯金酸(HAuCl₄·4H₂O)和0.175g氯鉑酸鉀(K₂PtCl₆)溶于0.2L的去離子水中，得到混合溶液。

(b)將一定量的硼氫化鈉溶于0.05L的去離子水中，在攪拌下將上述硼氫化鈉溶液快速加入(用時25s)到上述混合溶液中，在室溫以下攪拌1小時至充分反應，不需采用透析等純化工藝，即得到約0.25L的濃度約為800ppm含有納米金-鉑雙金屬納米顆粒的納米金溶液。

根據(jù)投料比，還原劑硼氫化鈉與氯金酸和氯鉑酸鉀的摩爾含量比為3:1，鉑的原子百分比為20％，因此該金-鉑納米顆粒可表示為Au₈₀Pt₂₀納米顆粒。

在該含納米金的抗菌殼聚糖敷料中，經(jīng)ICP-OES測定，每片殼聚糖敷料的含金量為1質(zhì)量％。經(jīng)200KV六硼化鑭透射電子顯微鏡測定，該敷料中的納米金顆粒的平均粒徑為4nm。

對比例3

按照與實施例3相同的制備方法制得對比例3的納米金抗菌溶液，再通過常溫溶劑水的蒸發(fā)，使其與實施例3中的納米金殼聚糖敷料有相同的納米金質(zhì)量百分含量。

試驗例2

將實施例1采用的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金抗菌溶液與市售含納米銀的抗菌溶液(購自張家港耐爾納米科技公司)的抗菌性能相比較，說明本發(fā)明的含納米金的抗菌殼聚糖敷料也應具有良好的抗菌性能。

比較方法如下：采用最小抑菌濃度MIC(mg/L)來衡量，采用微孔稀釋方法(National Committee for Clinical Laboratory Standards.，Methodsfor determining bactericidal activity of antimicrobial agents,M26-A,1999.)，將100μL不同濃度的納米金或納米銀加入到96微孔板中，10μL相同濃度(10⁴CFU/mL)的細菌培養(yǎng)液加入每個微孔中，37℃培養(yǎng)24小時后觀察，沒有可看見的細菌生長的微孔中最小的納米金或納米銀的濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。測試結(jié)果見表2。

從測試結(jié)果可見，實施例1采用的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金抗菌溶液的大腸桿菌和綠膿桿菌的MIC都小于市售含納米銀抗菌溶液的MIC，由此說明，實施例1對大腸桿菌和綠膿桿菌的抗菌性能優(yōu)于市售含納米銀的抗菌溶液。

表2實施例1的納米金溶液與市售含納米銀的抗菌溶液的抗菌性能比較結(jié)果

試驗例3

通過不同納米金含量的敷料抑菌圈實驗，來說明含該納米金的抗菌殼聚糖敷料的抑菌活性。

按照《藥品微生物檢驗手冊》第18章第1節(jié)管碟法進行試驗，對實施例1-3和對比例1-3進行抑菌圈試驗。試驗結(jié)果見表3?？瞻讱ぞ厶堑囊志?0mm，抑菌圈大小為殼聚糖樣品的原始大小，沒有抑菌效果。

測試結(jié)果可見，盡管各實施例的納米金質(zhì)量百分比和類型不同，但均可觀察到明顯的抑菌圈，說明含納米金的殼聚糖敷料對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌均有良好的抑菌效果。且同一濃度同一類型的含納米金的殼聚糖敷料的抑菌圈均大于納米金抗菌溶液，說明含納米金的殼聚糖敷料的抑菌效果要優(yōu)于有相同納米金含量相同納米金類型的納米金抗菌溶液。

試驗例4細胞毒性實驗

細胞毒性試驗操作過程：人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)在含有10％牛胎血清的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。在96微孔板的每個孔中加入10⁴個HUVEC細胞，每個孔中分別加入含不同濃度的納米顆粒(2-巰基-4,6-二氨基嘧啶/二甲雙胍雙組分修飾的納米金顆粒)的納米金溶液(可得自對比例1)、商購納米銀、商購硝酸銀溶液200微升。微孔介質(zhì)中在37℃下培養(yǎng)48小時，沒有加入抗菌劑的HUVEC細胞作為對照。培養(yǎng)完后，微孔中的溶液用磷酸緩沖溶液(PBS，0.01mol/L，pH 7.4)洗一次，加入10％(v/v)的CCK-8溶液在微孔介質(zhì)中，在37℃下培養(yǎng)2小時。在酶聯(lián)免疫檢測儀450nm處測量各樣品孔以及對照孔的吸光值。計算各個樣品孔細胞相對活力。各樣品孔細胞相對活力定義為：各個孔吸光值/對照孔的吸光值×100％。試驗結(jié)果見圖2。

從圖2所示的試驗結(jié)果可知，本發(fā)明采用的含金納米顆粒在不同濃度下的細胞毒性均明顯低于商購納米銀和商購硝酸銀溶液。

盡管本發(fā)明已進行了一定程度的描述，明顯地，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可進行各個條件的適當變化?？梢岳斫猓景l(fā)明不限于所述實施方案，而歸于權(quán)利要求的范圍，其包括所述每個因素的等同替換。