本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種ZnPc-UCNP-PEG-G納米復(fù)合物的制備方法。

背景技術(shù)：

光動(dòng)力治療又稱(chēng)作光化學(xué)治療 (Photodynamic therapy, PDT) 它是指利用特定波長(zhǎng)的光照射事先局部或全身注入機(jī)體的藥物(光敏劑, PS)，光敏劑隨之活化并與氧分子作用產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的活性氧 (ROS) ，經(jīng)過(guò)直接與間接作用對(duì)腫瘤組織產(chǎn)生不可逆的損傷。光動(dòng)力學(xué)治療不同于傳統(tǒng)的治療腫瘤手段，它對(duì)靶組織及損傷程度都具有可選擇性，可減少對(duì)正常組織的損傷，在人體內(nèi)能較快代謝，避免對(duì)身體其它部位產(chǎn)生毒性，化學(xué)穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。但是傳統(tǒng)的光動(dòng)力療法仍存在一些不足，如光敏劑對(duì)腫瘤組織的靶向性不足，同時(shí)由于光敏劑的吸收波長(zhǎng)較短，其組織穿透能力有限，因此，對(duì)體積較大的腫瘤或深層腫瘤的治療效果不佳?，F(xiàn)如今，納米技術(shù)的快速發(fā)展為解決光動(dòng)力治療中光敏劑的腫瘤靶向性及治療深度等問(wèn)題提供了新途徑。

分子靶向治療是指在細(xì)胞分子水平上通過(guò)已確定的致癌位點(diǎn)(即與腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織相關(guān)的特異性分子靶點(diǎn)，該靶點(diǎn)可能是腫瘤細(xì)胞內(nèi)某一蛋白質(zhì)分子、某一核酸片段或者某一基因產(chǎn)物)，設(shè)計(jì)相應(yīng)配體或抗體與特異性位點(diǎn)相結(jié)合，從而有效的抑制基因癌變或者阻斷細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路以及腫瘤血管形成，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡而不會(huì)傷害正常細(xì)胞的一種全新的治療模式。與傳統(tǒng)的化療和放療治療方式相比，分子靶向治療有很高的選擇性，在對(duì)腫瘤細(xì)胞高效殺傷的同時(shí)還能保證較低損傷正常組織的理想治療結(jié)果。小分子靶向藥物吉非替尼是一種選擇性表皮生長(zhǎng)因子受體 (EGFR) 酪氨酸激酶抑制劑，酪氨酸激酶通常表達(dá)于上皮來(lái)源的實(shí)體腫瘤之中，可通過(guò)對(duì)EGFR酪氨酸激酶活性的抑制來(lái)間接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和血管生成，并加速腫瘤細(xì)胞的凋亡。吉非替尼（Gefitinib）在2003年被美國(guó) FDA 批準(zhǔn)用于治療非小細(xì)胞肺癌，是首個(gè)獲得批準(zhǔn)上市的用于治療非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) 的口服型小分子靶向藥物。臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，吉非替尼對(duì)結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌及頭頸部腫瘤等治療均證實(shí)有效。

稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料 (upconversion luminescence nanoparticles,UCNPs) 是一種能被近紅外光 (NIR) 激發(fā)而發(fā)出可見(jiàn)光的發(fā)光材料，即上轉(zhuǎn)換納米材料可通過(guò)多光子機(jī)制把長(zhǎng)波轉(zhuǎn)換成短波，因此被稱(chēng)之為“上轉(zhuǎn)換”。由于上轉(zhuǎn)換材料的發(fā)光過(guò)程違背了斯托克斯 (Stokes) 定律，因此又被稱(chēng)為反斯托克斯 (anti-Stokes) 定律發(fā)光材料。上轉(zhuǎn)換納米材料具有穩(wěn)定且獨(dú)特的發(fā)光性質(zhì)，對(duì)細(xì)胞的毒性低，其激發(fā)波長(zhǎng)處在近紅外區(qū)(通常為980 nm，位于生物組織的光透過(guò)窗口800-1200 nm范圍內(nèi))，對(duì)生物組織的穿透性能力強(qiáng)，且不會(huì)對(duì)組織、蛋白質(zhì)等造成光傷害，同時(shí)能有效的降低檢測(cè)的背景自熒光，提高熒光信噪比，因此在生物標(biāo)記、多模成像、藥物運(yùn)輸和光動(dòng)力治療等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。

在UCNP /光敏劑納米系統(tǒng)引入分子靶點(diǎn)藥，通過(guò)制備分子靶向抗癌納米平臺(tái)系統(tǒng)，使腫瘤藥物治療的切入點(diǎn)由目前研究的細(xì)胞水平提高至分子水平。合成的UCNP/光敏劑/吉非替尼化合物中，UCNP和光敏劑的FRET作用可解決腫瘤治療深度問(wèn)題，光敏劑和吉非替尼分子靶點(diǎn)藥的協(xié)同作用可解決靶向性不強(qiáng)和藥物在腫瘤細(xì)胞的滯留時(shí)間短的問(wèn)題。這些優(yōu)點(diǎn)為該設(shè)計(jì)體系成為新型分子靶向光動(dòng)力載藥平臺(tái)提供了極大可能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種ZnPc-UCNP-PEG-G納米復(fù)合物的制備及其應(yīng)用，解決了光動(dòng)力治療中藥物靶向性不足及治療深度淺的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種ZnPc-UCNP-PEG-G納米復(fù)合物的制備方法，具體步驟如下：

（1）稱(chēng)取0.4 g NaOH于100 mL 反應(yīng)釜中，再分別加入20 mL去離子水，30 mL乙醇，7.5 mL的油酸和4 mL的正己烷，攪拌混勻?yàn)槿芤孩?；稱(chēng)取0.8 mmol稀土硝酸鹽溶解在5 mL去離子水中，以20滴/min滴入溶液Ⅰ得溶液Ⅱ，再稱(chēng)取3.2 mmol NaF溶解在5 mL去離子水中加入到溶液Ⅱ中，置于180 ℃下反應(yīng)6 h；反應(yīng)結(jié)束后自然冷卻至室溫，用30 mL環(huán)己烷分三次萃取，收集環(huán)己烷層，加入過(guò)量乙醇離心收集；再用去離子水和乙醇交替洗3次，最后分散在10 mL 環(huán)己烷中待用；

（2）量取8 mL 步驟（1）的UCNPs的環(huán)己烷溶液，加入12 mL環(huán)己烷和10 mL二氯甲烷；再加入25 mg間氯過(guò)氧苯甲酸，升溫至54 ℃攪拌回流3 h，冷卻至室溫，加入1.0 g PEG-OH繼續(xù)反應(yīng)8 h；反應(yīng)結(jié)束后，減壓旋干，再用乙醇和去離子水交替洗3次，-60℃凍干得到UCNP-PEG-OH；

（3）稱(chēng)取3 mg β -ZnPc-COOH和8 mg HOOC-PEG-COOH溶于5 mL DMSO中得到混合液Ⅰ，再稱(chēng)取6 mg N,N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）和4 mg 4-二甲氨基吡啶（DMAP）分別溶在200 μL的DMSO中，加入到混合液Ⅰ中攪拌1 h，再加入30 mg 步驟（2）產(chǎn)物，室溫下反應(yīng)48 h；離心收集，用DMSO洗3次，-60℃凍干得到ZnPc-UCNP-PEG-COOH；

（4）將步驟（3）產(chǎn)物溶在12 mL DMSO中，加入7 mg DCC和5 mg DMAP攪拌1h，加入化合物G，室溫下反應(yīng)48 h；離心收集，用DMSO洗3次，得到產(chǎn)物ZnPc-UCNP-PEG-G。

所述的稀土硝酸鹽為Y(NO₃)·6H₂O和Yb(NO₃) ·5H₂O和Er(NO₃) ·5H₂O以質(zhì)量比68:30:2混合。

步驟（4）中化合物G的加入量為反應(yīng)產(chǎn)物總量的5%~20%。

所述化合物G為8-羥基-3,6烷氧雜辛基-吉非替尼。

本發(fā)明的有益效果在于：

1）本發(fā)明將合成ZnPc-UCNP-PEG-G納米復(fù)合物，解決光動(dòng)力治療中藥物靶向性不足，治療深度淺的問(wèn)題。

2）合成的ZnPc-UCNP-PEG-G納米復(fù)合物粒徑均勻，熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率高，在980nm激發(fā)下單線態(tài)氧產(chǎn)率高，解決了治療深度淺的問(wèn)題。

3）合成的ZnPc-UCNP-PEG-G納米復(fù)合物表現(xiàn)出優(yōu)越的光動(dòng)力活性，在體外光動(dòng)力治療過(guò)程對(duì)細(xì)胞的殺傷能力具有一定的劑量依賴(lài)性，隨著濃度的增加，殺傷能力增強(qiáng)，而在無(wú)光照條件下對(duì)細(xì)胞未表現(xiàn)出明顯的殺傷作用。

4) 合成的ZnPc-UCNP-PEG-G納米復(fù)合物對(duì)癌細(xì)胞具有明顯的靶向性，而在正常細(xì)胞中分布較少，降低了癌癥治療過(guò)程中的副作用。

附圖說(shuō)明

圖1是 (a)上轉(zhuǎn)換納米粒子NaYF₄:Yb³⁺,Er³⁺ (UCNPs)的X射線衍射圖；

圖2是 (a)上轉(zhuǎn)換納米粒子NaYF₄:Yb³⁺,Er³⁺ (UCNPs)與 (b) UCNP-PEG-OH的TEM圖；

圖3是UCNPs上轉(zhuǎn)換納米粒子和UCNP-PEG-OH的紅外光譜圖；

圖4是 NaYF₄:Yb³⁺,Er³⁺ (UCNPs)上轉(zhuǎn)換發(fā)光圖；

圖5中Ⅰ和Ⅱ?yàn)閁CNPs對(duì)應(yīng)的熒光發(fā)射光，Ⅲ和Ⅳ為ZnPc-UCNP-PEG對(duì)應(yīng)的熒光發(fā)射光；

圖6a 為DPBF, UCNPs, UCNP-PEG, β-ZnPc-COOH, ZnPc-UCNP-PEG, ZnPc-UCNP- PEG-G的Ф比較圖；圖6b為ZnPc-UCNP-PEG-G不同條件下的Ф比較圖；

圖7是HepG2細(xì)胞 (圓形) 和HELF細(xì)胞 (條形) 對(duì)ZnPc-UCNP-PEG-G競(jìng)爭(zhēng)攝取24 h激光共聚焦成像圖；

圖8是目標(biāo)物ZnPc-UCNP-PEG-G和對(duì)照物ZnPc-UCNP-PEG對(duì)HepG2細(xì)胞孵育24 h后的熒光統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)柱狀圖；

圖9a和圖9b是ZnPc-UCNP-PEG-G在癌細(xì)胞HepG2中的攝取，指示的UCNPs和β -ZnPc-COOH的共同定位在細(xì)胞內(nèi)；

圖10無(wú)光照下不同濃度ZnPc-UCNP-PEG-G和ZnPc-UCNP-PEG孵育下HepG2細(xì)胞存活率圖；

圖11是有光照下不同濃度ZnPc-UCNP-PEG-G和ZnPc-UCNP-PEG孵育下HepG2細(xì)胞存活率圖。

具體實(shí)施方式

下面以具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此:

實(shí)施例1

一種ZnPc-UCNP-PEG-G納米復(fù)合物的制備方法，具體步驟為：

1) 稱(chēng)取0.4 g NaOH于100 mL 反應(yīng)釜中，再分別量取20 mL去離子水，30 mL乙醇，7.5 mL的油酸和4 mL的正己烷，攪拌讓其形成均勻的溶液。稱(chēng)取0.8 mmol稀土硝酸鹽 （0.2390 g Y(NO₃)·6H₂O，0.1065 g Yb(NO₃) ·5H₂O，0.0069 g Er(NO₃) ·5H₂O）溶解在5 mL去離子水中以20滴/min滴入到上述反應(yīng)液中，再稱(chēng)取0.1314 g (3.2 mmol) NaF溶解在5 mL 去離子水中加入到反應(yīng)液中，取出攪拌磁子封裝置于烘箱中180 ℃下反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后自然冷卻至室溫，用30 mL 環(huán)己烷分三次萃取，收集環(huán)己烷層，加入過(guò)量乙醇離心收集。再用去離子水和乙醇交替洗3次，最后分散在10 mL 環(huán)己烷中待用。

2) 量取8 mL UCNPs的環(huán)己烷溶液，加入12 mL環(huán)己烷和10 mL二氯甲烷，再稱(chēng)取25 mg 間氯過(guò)氧苯甲酸，升溫至54 ℃攪拌回流3 h后，冷卻至室溫，加入1.0 g PEG-OH繼續(xù)反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后，減壓旋干，再用乙醇和去離子水交替洗3次，-60℃凍干得到UCNP-PEG-OH。

3) 稱(chēng)取3 mg β-ZnPc-COOH和8 mg HOOC-PEG-COOH溶于5 mL DMSO中，再稱(chēng)取6 mg N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) 和4 mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)分別溶在200 μL的DMSO中加入到上述反應(yīng)液中攪拌1 h，活化羧基，加入30 mg UCNP-PEG- OH室溫下反應(yīng)48 h。離心收集，用DMSO洗3次，-60℃凍干得到β -ZnPc-COOH和HOOC-PEG-COOH加載的上轉(zhuǎn)換納米粒子產(chǎn)物簡(jiǎn)寫(xiě)為ZnPc-UCNP-PEG-COOH。

4) 將上一步的產(chǎn)物ZnPc-UCNP-PEG-COOH溶在12 mL DMSO中加入7 mg DCC和5 mg DMAP攪拌一小時(shí)，活化羧基，加入8 mg化合物G，室溫下反應(yīng)48 h。離心收集，用DMSO洗3次，凍干得到的產(chǎn)物簡(jiǎn)寫(xiě)為ZnPc-UCNP-PEG-G。

所述化合物G為8-羥基-3,6烷氧雜辛基-吉非替尼。

應(yīng)用實(shí)施例1

通過(guò)ZnPc-UCNP -PEG-G納米復(fù)合物單線態(tài)氧產(chǎn)率的研究，研究其光的組織穿透能力，為研究治療深度提供參考，具有較重要的意義。

采用化學(xué)探針1,3 二苯基異苯并呋喃(DPBF) 對(duì)ZnPc-UCNP -PEG-G納米體系在980 nm激光照射下單線態(tài)氧的產(chǎn)生能力進(jìn)行檢測(cè)。具體實(shí)驗(yàn)操作方法為：稱(chēng)取少量的DPBF用DMSO充分溶解，然后調(diào)節(jié)使其在420 nm處的吸光度值為1，同時(shí)調(diào)整ZnPc-UCNP-PEG-G的DMSO溶液在670 nm處的吸光度值也為1。取1 mL的DMSO溶劑和1 mL的ZnPc-UCNP- PEG-G溶液于比色皿中充分混合，作為參比消除系統(tǒng)誤差，再取DPBF和ZnPc-UCNP-PEG-G的DMSO溶液各1 mL混合均勻，測(cè)定其在420 nm處的吸光度值，此時(shí)為0 s時(shí)DPBF的吸光度值，然后用功率密度為1 W/cm²的980 nm的激光器照射比色皿中的混合溶液，每照射30 s測(cè)一下吸光度，測(cè)10個(gè)時(shí)間點(diǎn)。分別對(duì)DPBF，UCNPs，UCNP-PEG，β -ZnPc-COOH，ZnPc-UCNP-PEG，ZnPc-UCNP-PEG-G溶液的¹O₂進(jìn)行測(cè)量。測(cè)試結(jié)果如圖6a和圖6b所示。在比色皿口加一層1 cm厚的組織，用670 nm和980 nm波長(zhǎng)的激光分別來(lái)測(cè)定ZnPc-UCNP-PEG-G的Ф 單線態(tài)氧產(chǎn)率，并與未加組織的做比較。

由圖6a和圖6b實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，加了1 cm的組織覆蓋后，用980 nm光照射的單線態(tài)氧產(chǎn)率僅下降了40.68 %，而用670 nm光照射的單線態(tài)氧產(chǎn)率下降了88.9 %。因此，與用670 nm的光直接激發(fā)β -ZnPc-COOH相比，用980 nm的光間接激發(fā)β -ZnPc-COOH具有穿透厚組織的優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)一步凸顯了ZnPc-UCNP-PEG-G在實(shí)體或深層腫瘤治療的適用性。

應(yīng)用實(shí)施例2

藥物能否有效的殺死腫瘤細(xì)胞或者對(duì)腫瘤細(xì)胞造成一定的損傷跟腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的攝取量有很大的關(guān)系，因此，研究細(xì)胞對(duì)藥物的攝取量很有必要

選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，經(jīng)過(guò)PBS洗滌后加胰酶消化處理，再加入培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打均勻，離心后加入新的培養(yǎng)基將細(xì)胞再次吹打均勻，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至30萬(wàn)cell/mL，在96孔板中每孔加入以100 μL，每個(gè)藥物設(shè)6個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜生長(zhǎng)。貼壁后棄去舊的培養(yǎng)基，每孔加入100 μL藥物-培養(yǎng)基溶液(藥物母液為64 mg/ mL，溶劑是DMSO；為了保證培養(yǎng)基中DMSO量≤ 1%故最終加藥濃度為640 μg/ mL)，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去上層培養(yǎng)基，用PBS洗滌三遍，以徹底除去未攝取的藥物，然后向每孔中加入120 μL濃度為1%的SDS裂解液，將其置于37 ^oC搖床搖晃裂解30 min，以相應(yīng)藥物的激發(fā)波長(zhǎng)的光激發(fā)，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)其在最大發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度。

同時(shí)，做相應(yīng)藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(8個(gè)濃度，2個(gè)復(fù)孔)：將藥物均用SDS為溶劑從325 μg/ mL依次兩倍稀釋得到八個(gè)不同濃度，以相同條件測(cè)定各自的熒光強(qiáng)度，用Origin 8.5軟件處理，做熒光強(qiáng)度-濃度直線圖，即得各自藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由實(shí)驗(yàn)組各孔的熒光強(qiáng)度經(jīng)藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到各孔細(xì)胞攝取藥物濃度。

利用BCA蛋白定量檢測(cè)法，計(jì)算出各孔的蛋白含量(直接計(jì)算結(jié)果需擴(kuò)大6倍，即為各實(shí)驗(yàn)組的值)。再以各孔的藥物濃度值除以各孔蛋白總量，其比值則為單位蛋白中所含的光敏劑的量。用Graph Pad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)個(gè)比值做柱狀圖(圖8)，結(jié)果以Mean±SEM表示，相同條件下重復(fù)三次平行實(shí)驗(yàn)。

連接了聚乙二醇修飾后的靶向分子吉非替尼 (G) 得到的ZnPc-UCNP-PEG-G在HepG2細(xì)胞中的攝取量遠(yuǎn)高于沒(méi)有連接吉非替尼的ZnPc-UCNP-PEG，說(shuō)明ZnPc-UCNP-PEG-G對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2具有很好的靶向性。

應(yīng)用實(shí)施例3

細(xì)胞毒性測(cè)試主要是研究光動(dòng)力治療中光的安全性，以及藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用。

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的處在對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞，經(jīng)過(guò)洗滌、消化處理后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，將計(jì)數(shù)好的細(xì)胞稀釋至濃度為10萬(wàn)cell/mL，然后于96孔板中每孔接種100 μL，將細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。將ZnPc-UCNP-PEG-G和ZnPc-UCNP -PEG用DMSO溶液配制7個(gè)濃度梯度的母液，再用培養(yǎng)基將各個(gè)濃度稀釋100倍。經(jīng)PBS洗滌3遍后，取100 μL稀釋后的藥物溶液加入至96孔板中的每個(gè)孔中，實(shí)驗(yàn)組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。設(shè)置空白對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，加藥完畢后置于放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。

暗毒實(shí)驗(yàn)：將之前加藥處理過(guò)的細(xì)胞孵育24 h后，棄去之前舊的培養(yǎng)基，用PBS洗3遍，再向每孔中加入100 μL培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。

光毒實(shí)驗(yàn)：孵育24 h后，棄去之前舊的培養(yǎng)基，用PBS洗3遍，再向每孔中加入100 μL新培養(yǎng)基，用980 nm LED燈照射20 min (功率密度為1.0 W/cm²)后，再將96孔板置于37 °C 恒溫以及 5% CO₂培養(yǎng)基中繼續(xù)孵育24 h。

OD值檢測(cè)：將上述孵育完的細(xì)胞每孔加入10 μL已配好的MTT溶液(5 mg/mL)，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去孔板中原來(lái)的液體，再在每孔加入100 μL DMSO，置于搖床中震蕩半小時(shí)左右，待甲瓚完全溶解后，測(cè)定96孔板中每孔在570 nm處的OD值。將所得結(jié)果用 Graph Pad Prism 5.0 處理，結(jié)果以 Mean±SEM 表示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ZnPc-UCNP-PEG-G納米復(fù)合物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2具有明顯的殺傷作用，并且殺傷能力具有一定的劑量依賴(lài)性，隨著濃度的增加，殺傷能力增強(qiáng)，圖10在無(wú)光照條件下ZnPc-UCNP-PEG對(duì)HepG2細(xì)胞無(wú)明顯殺傷作用，而ZnPc-UCNP-PEG-G在一定的濃度范圍內(nèi)對(duì)HepG2細(xì)胞仍具有一定的殺傷作用，這說(shuō)明吉非替尼的引入在提高了藥物靶向性的同時(shí)還實(shí)現(xiàn)了吉非替尼的化療作用，實(shí)現(xiàn)了靶向PDT和化療的雙重療效。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。