本發(fā)明屬于天然產物化學領域，特別涉及一種辣木葉多糖在制備防治酒精性肝損傷藥物和食品中的應用。

背景技術：

酒精性肝病(Alcoholic Liver Disease，ALD)是長期飲酒引起的酒精性肝臟損傷，以肝臟代謝紊亂為基礎的急、慢性肝損傷。臨床上主要表現(xiàn)為三種形式：酒精性脂肪肝，酒精性肝炎和酒精性肝硬化，這三種形式可單獨或混合存在。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計：全世界約有1500～2000萬人酗酒，其中10％～20％有不同程度的酒精性肝病。在歐美國家，酒精性肝病是中青年死亡的主要原因之一；在我國華北地區(qū)流行病學調查顯示從20世紀80年代初到90年代初，嗜酒者在一般人群中的比例從0.21％上升至14.3％；本世紀初，南方及中西部省份流行病學調查顯示飲酒人群增至30.9％～43.4％。酒精性肝病占同期肝病住院患者的比例在不斷上升，從1991年的4.2％增至1996年的21.3％。尤其是近年來，隨著我國經濟增長，人們社會生活方式多元化發(fā)展，我國人均消費酒精的總量以及消費酒精的總人數(shù)都在逐年攀升，酒精濫用和酒精依賴已成為全球乃至中國一個日益突出的公共衛(wèi)生問題，繼發(fā)的酒精性肝損傷在我國也成為了一個不可忽視的疾病。因此，尋找和研發(fā)能有效防治酒精性肝病的藥物和保健食品十分迫切。

目前，酒精性肝損傷暫無特效藥物和治療方法。在防治上，仍采取以減少酒精攝入，及早發(fā)現(xiàn)和及早控制病情等為主的措施；當出現(xiàn)明顯肝損傷時則以保肝與支持治療相結合的療法，藥物治療多從保肝抗纖維化，非特異性抗炎，抗氧化等方面著手。盡管當前有研究報道葛根等中藥材可用于解酒保肝，但大多數(shù)中藥材有毒副作用，僅可用作藥品，不能長期食用，當作食品；而且已報道的絕大多數(shù)植物都是保肝功效成分不明確，以植物粗提物使用，限制了使用的范圍。所以，尋找和利用天然植物資源中具解酒保肝功效的單一一類成分，并將其開發(fā)成藥物和保健食品受到醫(yī)藥和食品行業(yè)的廣泛關注。植物中一類保肝功效成分的發(fā)現(xiàn)對于研制安全有效、質量可控，能有效防治酒精性肝損傷的保健食品、藥品具有重大的意義。

辣木(Moringa oleifera Lam.)，是辣木亞目辣木科(Moringaceae)辣木屬(Moringa)植物，是多年生熱帶亞熱帶落葉喬木，因其根具有辛辣味，故因而得名辣木。辣木的根、葉、嫩果均可食用，含多種礦物質、維生素，營養(yǎng)物質非常多；另外，其根、皮、葉、果實都可以作醫(yī)藥原料，因此辣木有“奇跡之樹”、“植物中的鉆石”等美譽。辣木具有多種藥用價值，可以治療潰瘍、高血壓、高血脂、癌癥、糖尿病、炎癥等疾病，是極具研究開發(fā)潛力的植物。

目前國外已有關于辣木抗氧化以及保肝的研究報道，Sharifudin等學者用對乙酰氨基酚(APAP)誘導小鼠產生肝損傷，然后以N-乙酰半胱氨酸為對照藥物，研究了辣木葉和花提取物對小鼠肝損傷的治療作用，結果表明辣木葉和花提取物對APAP過量造成的小鼠肝損傷有潛在的治療作用(Sharifudin SA，F(xiàn)akurazi S，Hidayat MT，et al.Therapeutic potential of Moringa oleifera extracts against acetaminophen-induced hepatotoxicity in rats[J].Pharmaceutical Biology，2013，51(3)：279-288)。Sharma等研究了辣木對7，12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)誘導的小鼠肝細胞損傷的保護作用，發(fā)現(xiàn)它能降低DMBA誘導的肝損傷模型小鼠的肝天冬氨酸轉氨酶(AST)、丙氨酸轉氨酶(ALT)和堿性磷酸酶(ALP)水平，顯著扭轉DMBA誘導的肝臟組織的病理改變。結果表明辣木對小鼠DMBA誘導的肝細胞損傷具有良好的保肝和抗氧化潛力(Sharma V，Paliwal R，Janmeda P，et al.Chemopreventive efficacy of Moringa oleifera pods against 7，12-dimethylbenz[a]anthracene induced hepatic carcinogenesis in mice[J].Asian Pacific Journal of Cancer Prevention，2012，13(6)：2563-2569)。Sinha等研究了辣木葉提取物對放射線輻射導致的脂質過氧化損傷的保護作用。小鼠給藥15天后暴露于60 Co-γ輻射，觀察輻照模型小鼠的肝脂質過氧化、還原型谷胱甘肽等變化，結果表明辣木的葉子提取物可以預防肝臟脂質過氧化損傷(Sinha M，Das DK，Datta S，et al.Amelioration of ionizing radiation induced lipid peroxidation in mouse liver by Moringa oleifera Lam leaf extract[J].Indian Journal of Experimental Biology，2012，50(3)：209-215)。但在以上研究中，辣木葉或花用于對抗DMBA和APAP化合物，以及60 Co-γ輻射引起的肝損傷均是取用粗提物，沒有關于單一一類化學成分如辣木葉多糖抗酒精性肝損傷的研究和應用。

技術實現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供辣木葉多糖在制備防治酒精性肝損傷藥物和食品中的應用。

本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn)：

辣木葉多糖在制備防治酒精性肝損傷藥物和食品中的應用。

所述的辣木葉多糖由以下方法制備得到：

(1)備料：將辣木葉干燥，粉碎，過80目篩，得辣木葉粉備用；

(2)脫脂：取步驟(1)中所得的辣木葉粉，加入石油醚回流脫脂，然后過濾將所得濾渣干燥，備用；

(3)提取：取步驟(2)中得到的干燥濾渣，以水為溶劑，料液比為1:15～1:25，在60℃～80℃下提取0.5～1.5h，提取次數(shù)為3次，合并水提液，經14000rpm離心，取上清液，得辣木葉粗多糖溶液；

(4)醇沉：將步驟(3)中得到的辣木葉粗多糖溶液濃縮至1/2～1/3，用無水乙醇調含醇量至75％～85％，沉淀12h，過濾，取沉淀，得辣木葉粗多糖；

(5)除蛋白：將步驟(4)中得到的辣木葉粗多糖用去離子水溶解，加入多糖液1/5體積的Sevag試劑(氯仿與正丁醇體積比4∶1)，混合后磁力攪拌30～35min，4500rpm離心20min，反復處理3次；

(6)純化：將步驟(5)中除蛋白后的產物加入吸附樹脂柱中，用蒸餾水進行洗脫，洗脫流速2mL/min，將洗脫液濃縮至原體積的1/5，得濃縮液，將濃縮液置于80℃水浴蒸干至相對密度為0.16～0.25(以水為參考物質)的浸膏，在60℃下真空干燥，得辣木葉多糖粉末。

步驟(2)中所用的石油醚的量為每1g的辣木葉粉對應使用3mL的石油醚；所述的回流脫脂是指回流兩次，每次回流時間為6h；所用的石油醚的沸程為60℃～90℃。

步驟(3)中所述的提取條件優(yōu)選為：料液比為1:20，在80℃提取1h，提取次數(shù)為3次。

步驟(4)中所述的含醇量優(yōu)選為80％。

步驟(5)中所述的Sevag試劑的用量為辣木葉粗多糖用去離子水溶解后得到的多糖液體積的1/5；所述的Sevag試劑為體積比為4:1的氯仿與正丁醇的混合液。

步驟(6)中所述的吸附樹脂柱為AB-8型大孔吸附樹脂柱；所述的相對密度是以水為參考物質，優(yōu)選為0.20。

所述的防治酒精性肝損傷藥物和食品的制劑成分均包括辣木葉多糖和國家許可添加的食用級可接受的粘合劑、潤滑劑、調味劑等輔料。

所述的可接受的輔料優(yōu)選為糖粉、甘露醇、微晶纖維素、可溶性淀粉等中的至少一種。

所述的防治酒精性肝損傷藥物可以是各種劑型，如顆粒劑、片劑、膠囊劑、口服液、散劑等。

本發(fā)明的機理：

辣木葉多糖，其對急性酒精性肝損傷模型小鼠血清中丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)有顯著的降低作用，而對超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px酶)活力有增強作用，有利于酒精性肝損傷的減輕、防御及修復。辣木葉多糖能降低亞急性酒精性肝損傷模型小鼠血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、谷草轉氨酶(GOT)、丙氨酸氨基轉移酶(GPT)、總膽固醇(T-CHO)、總膽紅素(T-BIL)含量，使肝細胞功能損傷減輕和恢復正常。由于丙二醛(MDA)是膜脂質過氧化最重要的產物之一，它的產生會引起蛋白質、核酸等生物大分子的交聯(lián)聚合，使膜的功能損傷或喪失，產生細胞毒性；根據(jù)對酒精性肝損傷發(fā)病機制的研究發(fā)現(xiàn)，酒精性肝損傷會引起肝組織中甘油三酯含量聚積，膽固醇合成加強，并引起相應載脂蛋白含量的改變，從而導致肝細胞的功能損傷，而酒精性肝臟脂肪變性及相關血清指標改變是酒精性肝損傷的早期表現(xiàn)。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)是機體內廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶。它特異的催化還原型谷胱甘肽(GSH)對過氧化氫的還原反應，可以起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。GSH-px的活性中心是硒半胱氨酸，硒是GSH-px的必需部分，每克分子酶含4克原子硒。測定GSH-px的活力可以作為衡量機體硒水平的一項生化指標。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)可以促進過氧化氫(H₂O₂)與還原型谷胱甘肽(GSH)反應生成H₂O及氧化型谷胱甘肽(GSSG)，谷胱甘肽過氧化物酶的活力可用酶促反應的速度來表示，測定此酶促反應中還原型谷胱甘肽的消耗，則可求出酶的活力。血清T-BIL(total bilirubin，T-BIL)是直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL)與間接膽紅素(miL)之和，為血紅素代謝產物。血清膽紅素主要來源于衰老紅細胞裂解而釋放出的血紅蛋白，而肝臟承擔對膽紅素的代謝清除作用。因此，肝細胞受損或肝內外膽管阻塞等原因會造成血清T-BIL升高，是肝功能檢測中的敏感指標。轉氨酶是肝細胞代謝過程中必不可少的重要物質，當肝細胞受到各種影響而引起炎癥、壞死等病理損傷時，轉氨酶可釋放入血，導致血清轉氨酶升高，血清轉氨酶是臨床反映肝細胞損傷的重要指標。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術，具有如下的優(yōu)點及有益效果：

1、本發(fā)明的制備方法能使辣木葉粗多糖得率有所提高，而且經過精制處理后，能得到較純的辣木葉多糖。

2、本發(fā)明制備的辣木葉多糖對急性和亞急性酒精性肝損傷模型實驗小鼠表現(xiàn)出明顯的保護作用。因此，本發(fā)明制備的辣木葉多糖可應用在抗肝損傷領域尤其是酒精性肝損傷。

附圖說明

圖1為實施例6中空白對照組小鼠肝組織切片圖。

圖2為實施例6中模型組小鼠肝組織切片圖。

圖3為實施例6中辣木葉多糖高劑量組小鼠肝組織切片圖。

圖4為實施例6中辣木葉多糖中劑量組小鼠肝組織切片圖。

圖5為實施例6中辣木葉多糖低劑量組小鼠肝組織切片圖。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

本發(fā)明所用試劑如無特殊說明均可從市場常規(guī)購得。

實施例1：辣木葉多糖的制備

(1)備料：將辣木葉干燥，粉碎，過80目篩，得辣木葉粉備用；

(2)脫脂：取步驟(1)中得到的辣木葉粉，加入辣木葉粉質量3倍體積(g∶mL)的石油醚回流脫脂2次，每次6h，過濾，將濾渣干燥，備用；

(3)提?。喝〔襟E(2)中得到的干燥濾渣以水為溶劑，料液比為1:15，在60℃下提取0.5h，提取次數(shù)為3次，合并水提液，經14000rpm離心，取上清液，得辣木葉粗多糖溶液；

(4)醇沉：將步驟(3)中得到的辣木葉粗多糖溶液濃縮至1/2-1/3，用無水乙醇調含醇量至75％，沉淀12h，過濾，取沉淀，得辣木葉粗多糖；

(5)除蛋白：將步驟(4)中得到的辣木葉粗多糖用去離子水溶解，加入多糖液1/5體積的Sevag試劑(氯仿與正丁醇體積比4∶1)，混合后磁力攪拌30～35min，4500rpm離心20min，反復處理3次。

(6)純化：將步驟(5)中得到的辣木葉多糖提取液加入AB-8型大孔吸附樹脂柱中，用蒸餾水進行洗脫，洗脫流速2mL/min，將洗脫液濃縮至原體積的1/5，得濃縮液，將濃縮液置于80℃水浴蒸干至相對密度為0.16(以水為參考物質)的浸膏，在60℃下真空干燥，得辣木葉多糖粉末。

實施例2：辣木葉多糖的制備

(1)備料：將辣木葉干燥，粉碎，過80目篩，得辣木葉粉備用；

(2)脫脂：取步驟(1)中的辣木葉粉，加入辣木葉粉質量3倍體積(g∶mL)的石油醚回流脫脂2次，每次6h，過濾，將濾渣干燥，備用；

(3)提取：取步驟(2)中得到的干燥濾渣以水為溶劑，料液比為1∶20，在80℃下提取1h，提取次數(shù)為3次，合并水提液，經14000rpm離心，取上清液，得辣木葉粗多糖溶液；

(4)醇沉：將步驟(3)中得到的辣木葉粗多糖溶液濃縮至1/2-1/3，用無水乙醇調含醇量至80％，沉淀12h，過濾，取沉淀，得辣木葉粗多糖；

(5)除蛋白：將步驟(4)中得到的辣木葉粗多糖用去離子水溶解，加入多糖液1/5體積的Sevag試劑(氯仿與正丁醇體積比4∶1)，混合后磁力攪拌30-35min，4500rpm離心20min，反復處理3次；

(6)純化：將步驟(5)中得到的辣木葉多糖提取液加入AB-8型大孔吸附樹脂柱中，用蒸餾水進行洗脫，洗脫流速2mL/min，將洗脫液濃縮至原體積的1/5，得濃縮液，將濃縮液置于80℃水浴蒸干至相對密度為0.20(以水為參考物質)的浸膏，在60℃下真空干燥，得辣木葉多糖粉末。

實施例3：辣木葉多糖的制備

(1)備料：將辣木葉干燥，粉碎，過80目篩，得辣木葉粉備用；

(2)脫脂：取步驟(1)中的辣木葉粉，加入辣木葉粉質量3倍體積(g∶mL)的石油醚回流脫脂2次，每次6h，過濾，將濾渣干燥，備用；

(3)提?。喝〔襟E(2)中得到的干燥濾渣以水為溶劑，料液比為1∶25，在70℃下提取1.5h，提取次數(shù)為3次，合并水提液，經14000rpm離心，取上清液，得辣木葉粗多糖溶液；

(4)醇沉：將步驟(3)中得到的辣木葉粗多糖溶液濃縮至1/2-1/3，用無水乙醇調含醇量至85％，沉淀12h，濾過，取沉淀即得辣木葉粗多糖；

(5)除蛋白：將步驟(4)中得到的辣木葉粗多糖用去離子水溶解，加入多糖液1/5體積的Sevag試劑(氯仿與正丁醇體積比4:1)，混合后磁力攪拌30-35min，4500rpm離心20min，反復處理3次；

(6)純化：將步驟(5)中得到的辣木葉多糖提取液加入AB-8型大孔吸附樹脂柱中，用蒸餾水進行洗脫，洗脫流速2mL/min，將洗脫液濃縮至原體積的1/5，得濃縮液，將濃縮液置于80℃水浴蒸干至相對密度為0.25(以水的參考物質)的浸膏，在60℃下真空干燥，得辣木葉多糖粉末。

實施例4：辣木葉多糖含量的測定試驗

1.對照品溶液的制備：精密稱取干燥至恒重的葡萄糖5mg，以蒸餾水定容至50mL的容量瓶中，搖勻，濃度為0.1mg/mL，然后分別精密吸取1，2，3，4，5mL置10mL容量瓶中，以蒸餾水稀釋定容搖勻，得0.01mg/mL，0.02mg/mL，0.03mg/mL，0.04mg/mL，0.05mg/mL的系列對照品溶液。

2.標準曲線的繪制：精密吸取上述系列對照品溶液1mL，置于10mL具塞試管中，冰水浴5min，加入0.2％蒽酮-硫酸試液4mL搖勻，立即置于沸水浴加熱10min，取出用冷水冷卻至室溫，室溫放置10min，于620nm處測定吸收度，另精密吸取蒸餾水1mL，置于10mL具塞試管中，冰水浴5min，加入0.2％硫酸蒽酮試液4mL搖勻，立即置于沸水浴加熱10min，取出用冷水冷卻至室溫，室溫放置10min左右，作為空白對照。以吸光度(A)為縱坐標，葡萄糖對照品濃度(C)為橫坐標，得葡萄糖標準曲線。

3.測定：分別稱取實驗例1、實驗例2、實驗例3制備的辣木葉多糖，用蒸餾水配制1mg/mL樣品溶液，取1mL置于10mL具塞試管中，冰水浴5min，加入0.2％硫酸蒽酮試液4mL搖勻，立即置于沸水浴加熱10min，取出用冷水冷卻至室溫，室溫放置10min，于620nm處測定吸收度，由回歸方程計算供試液中葡萄糖濃度(C)。結果如表1所示。

表1辣木葉多糖含量的測定試驗數(shù)據(jù)

從表1中可以看出，實施例2的方法制備的辣木葉多糖含量最高，與實施例3相比，溶液用量比較少，提取時間也比較短，而且含量更高，更適合應用于生產工藝上。

實施例5：辣木葉多糖對急性酒精性肝損傷模型小鼠的影響試驗

1.材料：

(一)實驗動物：

SPF級昆明(KM)種雄性小鼠77只，體質量18～22克，實驗動物許可證號：SCXK(粵)2013-0034，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。使用許可證號：SYXK(粵)2014-0136。

(二)試劑：

聯(lián)苯雙酯(Biphenyldicarboxylate，BP)滴丸，廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司生產；本發(fā)明實施例2中制備得到的辣木葉多糖。MDA、TG、SOD、GSH-px酶檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

2.實驗動物分組：77只昆明種雄性小鼠隨機分成6組，分別為空白對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯(15mg/mL)組、本發(fā)明辣木葉多糖高、中、低劑量(濃度分別為200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL)組，其中，空白對照組12只，其余各組各13只。

3.試驗方法：

實驗前適應性飼養(yǎng)5天，自由飲食，每日觀察記錄各組小鼠的攝食量和飲水量。實驗前16天，各組小鼠灌胃給予不同劑量的受試物，除空白對照組和模型組小鼠灌胃給予等量生理鹽水外，各劑量辣木葉多糖組小鼠每天給予2次受試物，按體質量0.12mL/10g劑量灌胃，聯(lián)苯雙酯組小鼠按人每日臨床用量折算后的劑量用藥，即體質量0.12mL/10g劑量灌胃，每日1次。每周稱取各組小鼠體重兩次，以調整相應受試物用量。實驗第17天，開始造模，除空白對照組外，其余各組小鼠每天按體質量0.1mL/10g劑量灌服50％食用級酒精1次，連續(xù)給予9天酒精，受試物的給予劑量和方法同前。造模結束后各組小鼠再給予相應受試物3～5天。實驗結束前，最后一次灌胃后禁食16h，稱取體重，然后摘眼球取血，將采集的全血在20℃下放置1h后，經轉速3 000rpm離心10min，吸取血清于滅菌1.5mL離心管中，置于–20℃冰箱保存?zhèn)溆?。頸椎脫臼處死小鼠，稱取小鼠臟器，將肝臟置于冰臺上，用手術刀片快速切取肝臟右葉，注意取肝右葉相同部位肝組織被等分成2～3份分裝入干凈凍存管置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

4.檢測指標和檢測方法

4.1血清中甘油三酯(TG)、丙二醛(MDA)含量的測定。嚴格按照試劑盒說明書操作步驟進行。

4.2肝組織中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽物過氧化酶(GSH-px)活性的測定。取上述保存的一份肝臟組織，用冷生理鹽水配制成10％的肝勻漿，按試劑盒說明書操作步驟操作，檢測肝臟中MDA含量、SOD活性、GSH-px活性。

4.3統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 15.0軟件包進行統(tǒng)計處理，結果以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計學差異。

5.試驗結果：取血，分離血清，測定小鼠血清中丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)含量；取肝臟組織檢測MDA、超氧化物歧化酶(SOD酶)活力和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px酶)活力。結果如表2～3所示。

表2辣木葉多糖對急性酒精性肝損傷小鼠血清TG和MDA含量的影響

注：與模型組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

由表2得出，與空白對照組小鼠比較，模型組小鼠血清中丙二醛(MDA)和甘油三酯(TG)含量明顯升高，具有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.05,P<0.01)，說明酒精誘導急性肝損傷小鼠模型建立成功。與模型組相比，本發(fā)明的辣木葉多糖高、中、低劑量組小鼠血清甘油三酯(TG)明顯下降(P<0.05，P<0.01)，以高劑量組下降最為顯著，陽性對照藥聯(lián)苯雙酯組小鼠血清TG也比模型組小鼠血清TG水平低(P<0.05)；從各組小鼠血清MDA檢測水平看，模型組小鼠血清明顯高于空白對照組(P<0.05)；與模型組相比，辣木葉多糖中劑量組小鼠血清MDA含量(8.139±3.764nmol/ml)低于模型組小鼠MDA(11.511±2.015nmol/ml)含量(P<0.05)，辣木葉多糖高、低劑量組有降低的趨勢。因此，本發(fā)明的辣木葉多糖對急性酒精性肝損傷實驗小鼠模型表現(xiàn)出明顯的保肝作用。

表3辣木葉多糖對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD和GSH-px影響

注：與模型組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

由表3得出，與空白對照組小鼠比較，模型組小鼠肝組織中丙二醛(MDA)含量明顯升高，具有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.01)，而SOD酶和GSH-px酶活性明顯低于空白對照組(P<0.05)。經辣木葉多糖高、中、低劑量處理酒精性肝損傷模型小鼠后，我們發(fā)現(xiàn)，辣木葉多糖各劑量組小鼠肝組織MDA水平均十分顯著下降(P<0.01)，甚至高劑量組低于空白對照組小鼠MDA水平，聯(lián)苯雙酯組的MDA水平也明顯下降(P<0.05)。從肝組織SOD酶和GSH-px酶活性看，辣木葉多糖高、中、低劑量組小鼠肝GSH-px酶活性均明顯上升(P<0.05)，而辣木葉多糖低劑量組小鼠肝SOD酶活性表現(xiàn)顯著增強(P<0.01)。因此，與模型組相比，本發(fā)明的辣木葉多糖對肝MDA有顯著的降低作用(P<0.01)，而對SOD和GSH-px酶活力有增強作用(P<0.05，P<0.01)，有利于改善模型小鼠的肝損傷，辣木葉多糖對急性酒精性肝損傷有保護功能作用。

實施例6：辣木葉多糖對亞急性酒精性肝損傷模型小鼠的影響試驗

1.材料：

(一)實驗動物：

SPF級昆明(KM)種雄性小鼠80只，體質量18～22克，實驗動物許可證號：SCXK(粵)2013-0034，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。使用許可證號：SYXK(粵)2014-0136。

(二)試劑：

本發(fā)明實施例2中制備得到的辣木葉多糖；葵花護肝片，由黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司生產，批號：Z20003336；MDA、GOT、GPT、T-CHO、LDL-C和T-BIL檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

2.實驗動物分組：80只昆明種雄性小鼠隨機分成6組，分別為空白對照組、模型組、葵花護肝片(86mg/mL)組、本發(fā)明辣木葉多糖高、中、低劑量(濃度分別為200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL)組，其中，空白對照組10只，其余各組各14只。

3.試驗方法：

實驗前適應性飼養(yǎng)5天，自由飲食。各組小鼠經口灌胃給予不同的受試物，除空白對照組和模型組小鼠灌胃給予等量生理鹽水外，各辣木葉多糖組小鼠每天給予2次相應濃度的辣木葉多糖，按體質量0.12mL/10g劑量灌胃，葵花護肝片組小鼠按人每日臨床用量折算后的劑量用藥，即體質量0.12mL/10g劑量灌胃，每日1次，連續(xù)給予45天。每周小鼠稱取體重兩次，并按體重調整受試樣品劑量。除空白對照組外，各組于實驗結束前14天，每天按10mL/kg·bw經口灌胃給予30％食用級酒精。受試物和酒精的灌胃時間間隔4h。實驗結束前禁食12h，稱取體重，然后摘眼球采血。將采集的全血在20℃下放置1h后，經轉速3 000rpmin離心10min，吸取血清于滅菌1.5mL離心管中，置于–20℃冰箱保存?zhèn)溆?。小鼠頸椎脫臼處死，稱取小鼠臟器，將肝臟置于冰臺上，用手術刀片快速切取肝臟右葉，注意取肝右葉相同部位肝組織用于病理學檢查，放入10％中性福爾馬林溶液固定，其余肝組織被等分成2～3份分裝入干凈凍存管置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

4.檢測指標和檢測方法

4.1血清中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、谷草轉氨酶(GOT)、丙氨酸氨基轉移酶(GPT)、總膽固醇(T-CHO)、總膽紅素(T-BIL)含量的測定。嚴格按照試劑盒說明書操作步驟進行。

4.2肝組織中丙二醛(MDA)含量的測定。取上述保存的一份肝臟組織，用冷生理鹽水配制成10％的肝勻漿，按試劑盒說明書操作步驟操作，檢測肝臟中MDA含量。

4.3肝組織病理學檢查：采用HE染色，用光學顯微鏡，放大倍數(shù)為400×檢查小鼠肝組織的病理切片，觀察肝細胞變性(脂肪變性、水樣變性、胞漿凝聚、氣球樣變)、肝細胞壞死和炎癥改變等情況，并對各組小鼠肝組織病理檢查結果作出報告。

4.4統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。對小鼠血清生化指標、肝臟指數(shù)多組組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)，方差齊性時用LSDL、S-N-K(S)檢驗，方差不齊性時采用Tamhane’s T2(M)及Dunnett’s T3檢驗，比較各組均值的差異顯著性，P＜0.05表示有統(tǒng)計學差異。

5.試驗結果：

5.1生化檢測結果：取血，分離血清，測定小鼠血清中LDL-C、GOT、GPT、T-CHO、T-BIL含量；取肝臟組織檢測MDA水平。依據(jù)SFDA《保健試驗評價技術規(guī)范》中的“對化學性肝損傷有輔助保護功能評價方法(修訂稿)》”相關判定標準，對實驗結果進行判定。結果如表4～5所示。

表4辣木葉多糖對小鼠血清中各生化指標含量的影響

注：與模型組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

由表4得出，亞急性酒精肝損傷模型組小鼠血清LDL-C、GOT、GPT、T-CHO和T-BIL含量均明顯高于空白對照組，具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.05，P＜0.01)，表明亞急性酒精性肝損傷小鼠模型建立成功。

除血清T-CHO水平外，辣木葉多糖各劑量組小鼠血清LDL-C、GOT、GPT、T-CHO、T-BIL含量與模型組小鼠比較，具有不同程度的降低(P＜0.05)。辣木葉多糖對亞急性酒精性肝損傷有保護功能作用。

表5辣木葉多糖對小鼠肝組織丙二醛(MDA)含量的影響

注：**表示與模型組比較，P＜0.01。

由表5得出，亞急性酒精肝損傷模型組小鼠MDA含量(0.422±0.49μmol/g)顯著高于空白對照組(0.268±0.29μmol/g)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。辣木葉多糖高、中、低劑量組小鼠肝組織MDA水平均顯著低于模型組小鼠(0.422±0.49μmol/g)，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，提示在給予辣木葉多糖干預后，模型小鼠肝功能異常的生化指標得到恢復，肝細胞功能損傷減輕。

5.2辣木葉多糖對亞急性酒精肝損傷模型小鼠肝臟病理變化的影響

對上述空白對照組、模型組、辣木葉多糖高劑量組、辣木葉多糖中劑量組、辣木葉多糖低劑量組的小鼠肝組織進行切片觀察，結果分別如圖1，圖2，圖3，圖4，圖5所示。

其中圖1為空白對照組小鼠肝組織切片圖，從圖1中可以看出，肝臟細胞索排列整齊，細胞呈多邊形，以中央靜脈為中心呈放射狀排列且分界清晰，肝細胞核圓形，可見雙核，肝臟組織結構完整，無水腫和脂肪變性等現(xiàn)象。

圖2為模型組小鼠肝組織切片圖，從圖2中可以看出，肝小葉結構異常，肝細胞排列紊亂，肝細胞普遍腫脹變性及壞死。壞死的肝細胞呈彌散狀分布，小葉中央靜脈區(qū)肝細胞壞死程度最重，肝間質有重度淤血。

圖3為辣木葉多糖高劑量組小鼠肝組織切片圖，從圖3中可以看出，肝組織結構異常程度明顯改變，肝小葉結構逐漸恢復正常，肝細胞排列呈條索狀，變性及壞死的肝細胞數(shù)量減少，肝細胞雙核的增多，說明肝細胞功能增強，肝細胞分裂增多，肝血竇、肝中央靜脈及肝間質淤血程度顯著減輕。

圖4為辣木葉多糖中劑量組小鼠肝組織切片圖，從圖4中可以看出，肝組織結構改變，肝細胞變性及壞死呈灶狀分布，程度較低劑量組輕，肝中央靜脈區(qū)的肝細胞首先恢復正常，次為肝小葉界板區(qū)的肝細胞，肝血竇及肝間質的淤血程度顯著減少，大量炎細胞浸潤。

圖5為辣木葉多糖低劑量組小鼠肝組織切片圖，從圖5中可以看出，肝組織結構有病理性變化，肝細胞壞死呈灶狀，壞死的肝細胞數(shù)量較中劑量組多，病變程度也較中劑量組重，切片可見炎性細胞增生形成的炎性小節(jié)。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。