本發(fā)明涉及靈芝和桑黃在制藥及功能性食品和保健食品領(lǐng)域中的應(yīng)用，尤其涉及一種高含量桑黃靈芝膠囊及其制備方法。
背景技術(shù)：
由于工作壓力、家庭負(fù)擔(dān)以及人體器官的自然衰老，常常使人感覺身體狀況大不如前，容易疲勞。目前臨床上抗疲勞的常用中藥有刺五加、西洋參、人參、紅景天、三七等。
靈芝，又稱“靈芝草”、“仙草”、“瑞草”，為非褶菌目靈芝菌科靈芝屬真菌靈芝。著名藥用真菌，分布于北半球溫帶地區(qū)。始載于“神農(nóng)本草經(jīng)”，具有補中益氣、滋陰強壯、扶正固本、延年益壽等功效。靈芝主要化學(xué)成分為多糖類和三萜類，三萜類成分復(fù)雜，曾祥麗等報道靈芝含有122種三萜類成分，其中最主要是靈芝酸37種。現(xiàn)已證明靈芝多糖類具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂、抗氧化和抗衰老等藥理作用，靈芝三萜具有抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性、保肝、抗腫瘤和抗艾滋病毒等藥理活性。有關(guān)靈芝有效成分提取工藝等研究方興未艾，迄今為止仍是國內(nèi)外矚目的重要課題。為能得到高純度的靈芝有效成分，近年來國內(nèi)外學(xué)者對靈芝有效成分的提取純化技術(shù)進行大量研究?，F(xiàn)將其主要研究進展作一綜述，以期為進一步研究開發(fā)靈芝提供參考依據(jù)。
桑黃，是一種真菌，因寄生于桑樹而得名。子實體無柄，菌蓋扁半球形或馬蹄形，木質(zhì)，淺肝褐色至暗灰色或黑色。在楊、柳、樺、櫟等樹干上也有生長。據(jù)分析，桑黃的成分極其復(fù)雜，除含大量多糖類物質(zhì)外，還含β葡聚糖、幾丁質(zhì)（殼聚糖）、雜多糖（果膠、半纖維素、多糖醛酸等膳食纖維）等成分，在腸道中有促進有害物質(zhì)及膽固醇排泄的作用。此外，桑黃還具有抗衰老、降低膽固醇、護肝和抗肝硬化等藥理作用，而這些藥理作用恰恰是備受制藥界青睞的。
現(xiàn)有的桑黃靈芝類膠囊，內(nèi)容物多為將桑黃和/或靈芝直接粉碎后的桑黃靈芝細(xì)粉，又或民間常規(guī)煮食，由于其有效成分難以完全溶解被機體吸收利用，生物利用度低、效果不好，故成人單次劑量需達10-20克方可產(chǎn)生特定功效，造成資源極大浪費。另一方面，作為粉狀的靈芝提取物和桑黃提取物二者混合后不易分散均勻，放置一段時間后極易結(jié)成塊狀。同樣，未見靈芝提取物和桑黃提取物聯(lián)用于抗疲勞保健品或藥物的報道。將幾味天然藥物配伍使用，能否發(fā)揮原有藥效或藥效發(fā)生怎樣的改變， 對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，均是難以預(yù)料的。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
鑒于上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種桑黃和靈芝有效成分含量高，口服后易于吸收利用，桑黃靈芝提取物分散均勻且具有抗疲勞功效的桑黃靈芝膠囊及其制備方法。
為了達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案，本發(fā)明各組分的用量也是經(jīng)過發(fā)明人進行大量摸索總結(jié)得出的，各組分用量在下述重量范圍內(nèi)制備出的軟膠囊都具有較好成型性和療效：
一種桑黃靈芝膠囊，該膠囊的內(nèi)容物按重量份配比計，由以下組分組成：
桑黃提取物 5-10份
靈芝提取物 5-10份
靈芝孢子油 15-20份
蜂蠟 5-10份。
進一步的，桑黃靈芝膠囊內(nèi)容物各組分的用量為：
桑黃提取物 8份
靈芝提取物 8份
靈芝孢子油 16份
蜂蠟 8份。
所述桑黃提取物是由以下制備方法制得：
取桑黃，將其粉碎后加入1:1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流40min，提取3次，濾液合并得提取液I；藥渣加入70%乙醇，加熱回流40min，提取2次，濾液合并得提取液II，將提取液II濃縮成浸膏，用50%甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用8%甲醇作為流動相，得洗脫液I，然后改換60%甲醇作為流動相，得洗脫液II，濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品：制備色譜的分離條件：色譜柱為半制備柱Lichrospher-C18；10.0mmX250mm，5μm，流動相為A為水和B為乙腈，梯度洗脫程序如下：
0min時，流動相A為85%，流動相B為15%；
10min時，流動相A為79%，流動相B為21%；
15min時，流動相A為69%，流動相B為31%；
30min時，流動相A為63%，流動相B為37%；
35min時，流動相A為15%，流動相B為85%；
45min時，流動相A為15%，流動相B為85%；
流動相A是在100ml水中加入醋酸0.1ml；流動相B是乙腈溶液，流速為2ml/min，柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段13.5～32.5min收集溶液，溶液經(jīng)濃縮冷凍真空干燥后得到有效組分。
所述靈芝提取物是由以下制備方法制得：
取靈芝，將其粉碎后加入體積比1:2的乙酸乙酯和60%乙醇，加熱回流提取3次，第一次1～3小時，第二次和第三次分別1～2小時，濾液合并得提取液I，藥渣加入65%乙醇，加熱回流提取3次，第一次1～1.5小時，第二次和第三次分別0.5～1小時，濾液合并得提取液II，合并提取液I和II，濃縮成浸膏，用65%乙醇溶解浸膏，采用非極性或弱極性大孔樹脂對其進行分離，首先以水洗脫，得洗脫液I；然后以60%～70%乙醇洗脫，再以90%～95%乙醇洗脫，得洗脫液II，回收，減壓濃縮，冷凍真空干燥，即得靈芝提取物。
所述靈芝孢子油由以下制備方法制得：
采用超臨界CO2萃取法制備，具體為：30-40MPa先靜態(tài)萃取10min，然后動態(tài)萃取，入口壓力為30-40MPa，出口壓力比進液口壓力低5-10kPa；溫度20-40℃，CO2體積20-40kg/h；在萃取的過程中單獨或者聯(lián)合采用下述方法：周期性壓力波動、周期性流量波動；其中周期性壓力波動的壓力波動差為5-10Mpa，周期性流量波動的流速波動差為1.0-2.0米/秒，得靈芝孢子油。
一種桑黃靈芝膠囊的制備方法包括以下步驟：
取上述配方量的桑黃提取物和靈芝提取物混合均勻，得混合提取物，用0.5倍混合提取物量的靈芝孢子油濕潤，另將剩余配方量的靈芝孢子油與蜂蠟共熱，使蜂蠟溶解，待該靈芝孢子油和蜂蠟混合液冷卻至55℃-60℃，在不斷攪拌下，將靈芝孢子油和蜂蠟混合液緩緩加入到經(jīng)靈芝孢子油濕潤的桑黃和靈芝提取物中，不停攪拌，并以循環(huán)水冷卻，待溫度降至45℃-50℃，上膠體磨進行均質(zhì)處理兩次，得流動性均質(zhì)性好的膏狀體膠囊內(nèi)容物，然后按常規(guī)工藝方法壓制膠囊即得。
而本發(fā)明通過獨特的提取工藝最大限度的提取出桑黃靈芝中的有效活性成分，如多糖、萜類等活性成分，最大限度地發(fā)揮桑黃和靈芝的藥效或保健功效，提高了生物利用度，相應(yīng)降低了桑黃和靈芝原生藥材的用量。
本發(fā)明的另一重要意義在于，對于某些異常珍貴的中藥，將藥材通過獨特的提取工藝，制成提取物用于制備高含量的膠囊劑，可以使現(xiàn)代膠囊劑型有效地模擬中醫(yī)傳統(tǒng)湯藥，有利于推動中藥現(xiàn)代化發(fā)展。
本發(fā)明的有益效果在于：
（1）綜合利用獨特的提取工藝最大限度的提取出桑黃靈芝中的有效活性成分，提高功效，提高生物利用度，相應(yīng)降低原生藥材用量。
（2）將中藥材通過獨特的提取工藝，制成提取物用于制備高含量的膠囊劑，可以使現(xiàn)代膠囊劑型有效地模擬中醫(yī)傳統(tǒng)湯藥，有利于推動中藥現(xiàn)代化發(fā)展。
（3）本發(fā)明配方中，無需添加其他人工合成食品添加劑或藥用輔料，確保產(chǎn)品的天然屬性，對人體無毒無害，安全有效。
（4）本發(fā)明有效解決了桑黃提取物和靈芝提取物的分散問題：
a、桑黃提取物和靈芝提取物經(jīng)適量靈芝孢子油濕潤后與蜂蠟油混合，可形成高濃度，但粘滯度較低的流體，主要是利用蜂蠟隨溫度降低而固化的特點，使桑黃提取物和靈芝提取物、蜂蠟、靈芝孢子油三者形成均質(zhì)性較好的流體。
b、將桑黃提取物和靈芝提取物、蜂蠟、靈芝孢子油混合，在不停冷卻攪拌下，緩緩增加物料稠度，是利用桑黃提取物和靈芝提取物、蜂蠟、靈芝孢子油混合物隨溫度下降而固化的原理，在攪拌下使物料均勻分散，有效解決液固相穩(wěn)定性問題。在攪拌下，隨著混合液溫度的不斷下降，析出的桑黃提取物和靈芝提取物以極細(xì)的微粒被蜂蠟不斷包埋，形成均質(zhì)性和流動性均較好的膏體，極易壓制軟膠囊。
（5）本發(fā)明具有優(yōu)異的抗疲勞功效。
具體實施方式
實施例1
桑黃提取物的制備：
取桑黃，將其粉碎后加入1:1的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流40min，提取3次，濾液合并得提取液I；藥渣加入70%乙醇，加熱回流40min，提取2次，濾液合并得提取液II，將提取液II濃縮成浸膏，用50%甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用8%甲醇作為流動相，得洗脫液I，然后改換60%甲醇作為流動相，得洗脫液II，濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品：制備色譜的分離條件：色譜柱為半制備柱Lichrospher-C18；10.0mmX250mm，5μm，流動相為A為水和B為乙腈，梯度洗脫程序如下：
0min時，流動相A為85%，流動相B為15%；
10min時，流動相A為79%，流動相B為21%；
15min時，流動相A為69%，流動相B為31%；
30min時，流動相A為63%，流動相B為37%；
35min時，流動相A為15%，流動相B為85%；
45min時，流動相A為15%，流動相B為85%；
流動相A是在100ml水中加入醋酸0.1ml；流動相B是乙腈溶液，流速為2ml/min，柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段13.5～32.5min收集溶液，溶液經(jīng)濃縮冷凍真空干燥后得到有效組分。
靈芝提取物的制備：
取靈芝，將其粉碎后加入體積比1:2的乙酸乙酯和60%乙醇，加熱回流提取3次，第一次1～3小時，第二次和第三次分別1～2小時，濾液合并得提取液I，藥渣加入65%乙醇，加熱回流提取3次，第一次1～1.5小時，第二次和第三次分別0.5～1小時，濾液合并得提取液II，合并提取液I和II，濃縮成浸膏，用65%乙醇溶解浸膏，采用非極性或弱極性大孔樹脂對其進行分離，首先以水洗脫，得洗脫液I；然后以60%～70%乙醇洗脫，再以90%～95%乙醇洗脫，得洗脫液II，回收，減壓濃縮，冷凍真空干燥，即得靈芝提取物。
靈芝孢子油的制備：
采用超臨界CO2萃取法制備，具體為：30-40MPa先靜態(tài)萃取10min，然后動態(tài)萃取，入口壓力為30-40MPa，出口壓力比進液口壓力低5-10kPa；溫度20-40℃，CO2體積20-40kg/h；在萃取的過程中單獨或者聯(lián)合采用下述方法：周期性壓力波動、周期性流量波動；其中周期性壓力波動的壓力波動差為5-10Mpa，周期性流量波動的流速波動差為1.0-2.0米/秒，得靈芝孢子油。
桑黃靈芝膠囊的制備：
取桑黃提取物500g和靈芝提取物500g混合均勻，得混合提取物，用500g靈芝孢子油濕潤，另將剩1000g靈芝孢子油與500g蜂蠟共熱，使蜂蠟溶解，待該靈芝孢子油和蜂蠟混合液冷卻至55℃-60℃，在不斷攪拌下，將靈芝孢子油和蜂蠟混合液緩緩加入到經(jīng)靈芝孢子油濕潤的桑黃和靈芝提取物中，不停攪拌，并以循環(huán)水冷卻，待溫度降至45℃-50℃，上膠體磨進行均質(zhì)處理兩次，得流動性均質(zhì)性好的膏狀體膠囊內(nèi)容物，然后按常規(guī)工藝方法壓制膠囊即得桑黃靈芝軟膠囊（內(nèi)容物300mg/粒），服用劑量：每日一次1粒。
實施例2
制備方法同實施例1
只是桑黃提取物、靈芝提取物、靈芝孢子油以及蜂蠟的用量比為1:1:2:1。
實施例3
制備方法同實施例1
只是桑黃提取物、靈芝提取物、靈芝孢子油以及蜂蠟的用量比為2：1:3:1。
實施例4
制備方法同實施例1
只是桑黃提取物、靈芝提取物、靈芝孢子油以及蜂蠟的用量比為1：2:3:1。
實施例5
制備方法同實施例1
只是桑黃提取物、靈芝提取物、靈芝孢子油以及蜂蠟的用量比為1:1:4:1。
實施例6
制備方法同實施例1
只是桑黃提取物、靈芝提取物、靈芝孢子油以及蜂蠟的用量比為2：2:3:2。
以下通過具體藥效學(xué)試驗證明本發(fā)明具有抗疲勞功效的有益效果。
試驗例：本發(fā)明桑黃靈芝膠囊對小鼠體重、負(fù)重游泳時間、血清尿素氮、肝糖原血乳酸的影響。
發(fā)明人通過對桑黃提取物、靈芝提取物、靈芝孢子油單方以及實施例1桑黃靈芝膠囊（復(fù)方）的小鼠抗疲勞功效藥理試驗對比研究證實，該實施例1桑黃靈芝膠囊（復(fù)方）用于抗疲勞具有更加顯著的藥理活性。
1.試驗材料：
藥品：
實施例1所制備的桑黃靈芝膠囊（內(nèi)容物300mg/粒），每粒膠囊相當(dāng)于含桑黃提取物50mg、靈芝提取物50mg、靈芝孢子油150mg、蜂蠟50mg。
單味桑黃提取物膠囊：參照實施例1制備方法，每粒膠囊相當(dāng)于含桑黃提取物250mg、蜂蠟50mg。
單味靈芝提取物膠囊：參照實施例1制備方法，每粒膠囊相當(dāng)于含靈芝提取物250mg、蜂蠟50mg。
單味靈芝孢子油膠囊：參照實施例1制備方法，每粒膠囊相當(dāng)于含靈芝孢子油250mg、蜂蠟50mg。
2.試驗方法：
取小鼠100只，分成五組：試驗組（給藥：實施例1所制得的桑黃靈芝膠囊）、桑黃組（給藥：單味桑黃提取物膠囊）、靈芝組（給藥：單味靈芝提取物膠囊）、靈芝孢子油組（給藥：單味靈芝孢子油膠囊）；給藥劑量5mg/kgBW，用0.5％CMC-Na配成混懸液，每日灌胃一次，空白組僅用0.5％CMC-Na 灌胃，30天后，對小鼠體重、負(fù)重游泳時間、血清尿素氮、肝糖原血乳酸的影響進行測試。
1.1對小鼠體重的影響：
表1對小鼠體重的影響（X±SD）
由表1可見，經(jīng)口給予小鼠試驗組、桑黃組、靈芝組、單味靈芝孢子油組膠囊30天后，各組小鼠的體重相比較，差異均無顯著性（P>0.05）。因此各組膠囊對小鼠的體重?zé)o不良影響。
1.2對小鼠負(fù)重游泳時間的影響。
表2本飲料對小鼠負(fù)重游泳時間的影響（X±SD）
由表2可見，經(jīng)口給予小鼠試驗組、桑黃組、靈芝組、單味靈芝孢子油組膠囊30天后，試驗組、桑黃組、靈芝組、單味靈芝孢子油組與空白組比較，負(fù)重游泳時間均有顯著性（P<0.05）。試驗組桑黃靈芝膠囊（復(fù)方）相比于桑黃組、靈芝組、單味靈芝孢子油組能顯著延長對小鼠的負(fù)重游泳時間。
1.3對小鼠游泳后血清尿素氮水平的影響。
表3對小鼠游泳后血清尿素氮水平的影響（X±SD）
由表3可見，經(jīng)口給予小鼠試驗組、桑黃組、靈芝組、單味靈芝孢子油組膠囊30天后，試驗組、桑黃組、靈芝組、單味靈芝孢子油組與空白組比較，血清尿素氮含量有顯著性（P<0.05）。試驗組桑黃靈芝膠囊（復(fù)方）相比于桑黃組、靈芝組、單味靈芝孢子油組能明顯減少疲勞小鼠血清尿素氮產(chǎn)生。
1.4對小鼠肝糖原含量的影響
表4對小鼠肝糖原含量的影響（X±SD）
由表4可見，經(jīng)口給予小鼠試驗組、桑黃組、靈芝組、單味靈芝孢子油組膠囊30天后，試驗組桑黃靈芝膠囊（復(fù)方）相比于桑黃組、靈芝組、單味靈芝孢子油組能明顯減少疲勞小鼠血清尿素氮產(chǎn)生能明顯提高小鼠肝糖原的含量。
1.5對小鼠游泳后血乳酸值的影響。
表5對小鼠游泳后血乳酸值的影響（X±SD）
由表5可見，經(jīng)口給予小鼠試驗組、桑黃組、靈芝組、單味靈芝孢子油組膠囊30天后，試驗組桑黃靈芝膠囊（復(fù)方）相比于桑黃組、靈芝組、單味靈芝孢子油組可明顯減少小鼠游泳后血乳酸曲線下面積。
由此可見，實施例1制得的桑黃靈芝膠囊具緩解體力疲勞之功效。
結(jié)論：經(jīng)口給予小鼠試驗組、桑黃組、靈芝組、單味靈芝孢子油組膠囊30天后，試驗組桑黃靈芝膠囊（復(fù)方）相比于桑黃組、靈芝組、單味靈芝孢子油組相比較，能延長小鼠的負(fù)重游泳時間（P＜0.05）、減少疲勞小鼠血清尿素氮產(chǎn)生（P＜0.01）、提高小鼠肝糖原的含量（P＜0.05）、減少游泳后血乳酸曲線下面積（P＜0.01) ；受試桑黃靈芝膠囊對小鼠體重增長無不良影響。故在相同給藥劑量下，本發(fā)明桑黃靈芝膠囊（復(fù)方）抗疲勞功效明顯優(yōu)于單味藥物，說明本發(fā)明藥物組合物，通過三味不同中藥的相互配伍，符合中醫(yī)藥理論，發(fā)揮了協(xié)同增效作用，獲得了更為理想的緩解體力疲勞的功效。
我們對實施例2-6的產(chǎn)品也做了同實施例1一樣的抗疲勞功效評價試驗，其實驗結(jié)果與實施例2的試驗結(jié)果并無明顯區(qū)別，故在此不做敷述。