本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種血漿分離物，具體地，涉及一種從血漿中分離的、用于增強(qiáng)記憶力的混合物及其制備方法，該混合物可用于預(yù)防、改善和治療老年癡呆癥，并具有增強(qiáng)記憶力的作用。

背景技術(shù)：

老年癡呆癥又稱為阿爾茨海默綜合癥，是一種漸進(jìn)性大腦功能衰退的致死疾病。臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化，日常生活能力減退，并有各神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。老年癡呆癥致死危險(xiǎn)性與腫瘤、心腦血管疾病等相當(dāng)，嚴(yán)重威脅老年人的健康并對(duì)整個(gè)社會(huì)發(fā)展帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。此病病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，特征性病理改變?yōu)棣碌矸蹣拥鞍壮练e形成的細(xì)胞外老年斑和tau蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)，以及神經(jīng)元丟失伴隨膠質(zhì)細(xì)胞增生。

目前老年癡呆癥的藥物治療分為癥狀性治療和疾病調(diào)節(jié)治療兩大類。其中僅四種藥物(多奈哌齊、卡巴拉汀、加蘭他敏、和美金剛)的臨床療效較為肯定，已獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床治療。然而，這些藥物均屬于癥狀性治療藥物，僅能改善臨床癥狀，并不能改變疾病進(jìn)程，而且這些藥物主要屬于化學(xué)合成藥物，有不同程度的毒副作用。因

此，研發(fā)能夠調(diào)節(jié)老年癡呆癥進(jìn)程的新型藥物目前尤為重要。

近年的研究結(jié)果證明：給老年鼠持續(xù)注射年輕鼠的血漿能提升老年鼠的認(rèn)知水平、空間記憶力、適應(yīng)新環(huán)境能力(Villeda S.A.Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice.Nature Medicine 2014；20:659-663)。其可能的作用機(jī)制為血漿中含有成千上萬(wàn)種蛋白和多種細(xì)胞因子，年輕血漿包含可以使組織恢復(fù)活力的某些成分，隨著年齡增長(zhǎng)，這些物質(zhì)會(huì)消失或被破壞。運(yùn)用現(xiàn)代分離技術(shù)，分離濃縮對(duì)老年癡呆患者有療效的血漿成分，用于老年癡呆病的預(yù)防和治療，是一種新型調(diào)節(jié)老年癡呆癥進(jìn)程藥物的發(fā)展方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的之一在于提供一種提高記憶的從血漿分離的混合物。

本發(fā)明的目的之二在于提供上述混合物的制備方法。

本發(fā)明的目的之三在于提供上述混合物的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種提高記憶的從血漿分離的混合物，所述混合物的SDS-PAGE變性膠電泳至少包括11條肉眼清晰可見(jiàn)的條帶，分子量大小分別為：25kD、37kD、41kD、51kD、66kD、69kD、88kD、105kD、145kD、170kD、200kD。

在本發(fā)明的第一方面，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，通過(guò)蛋白質(zhì)譜分析，所述混合物中至少含有如下表1所示的106種蛋白；優(yōu)選地，所述混合物還包括與下文中的表1所示的蛋白中任何一種結(jié)合的小分子。

在本發(fā)明的第一方面，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述血漿來(lái)源于哺乳動(dòng)物；優(yōu)選地，所述血漿來(lái)源于人類。

第二方面，本發(fā)明提供上述混合物制備方法，依次包括以下步驟：血漿收集、低溫過(guò)濾、低溫超濾、冷乙醇沉淀、SD滅活、離心、陰離子交換、第一次濃縮、分子篩、透析、第二次濃縮步驟；優(yōu)選地，所述血漿收集和冷乙醇沉淀步驟之間還包括：低溫過(guò)濾和低溫超濾步驟。

在本發(fā)明的第二方面，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述血漿收集步驟中，利用抗凝管收集血液，再通過(guò)離心收集上清液，得到血漿；優(yōu)選地，所述離心中，離心力為500-1000g，時(shí)間為10-30分鐘，離心溫度為0-10℃。

在本發(fā)明的第二方面，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述低溫過(guò)濾步驟中，在壓力條件下將所述血漿進(jìn)行過(guò)濾，得到濾液；優(yōu)選地，濾膜的孔徑為不小于0.22微米，更優(yōu)選所述濾膜的孔徑為0.22微米和0.45微米；優(yōu)選地，所述過(guò)濾的溫度為0-5℃，壓力為1-20MPa。

在本發(fā)明的第二方面，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述低溫超濾步驟中，將所述濾液通過(guò)施加壓力進(jìn)行膜包超濾，得到低溫超濾產(chǎn)物；優(yōu)選地，所述膜包截留分子量為3kD-10kD；優(yōu)選地，所述超濾的溫度為0-5℃，壓力為1-20MPa；優(yōu)選地，所述超濾使用的緩沖液為磷酸鹽緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液、HBS緩沖液中的一種；更優(yōu)選地，所述Tris-鹽酸緩沖液的濃度為0.2-250mM、pH值為7.0-9.2，所述磷酸緩沖液的濃度為1.0-450mM、pH值為6.0-9.2，所述HBS緩沖液的濃度為0.5-600mM、pH值為6.4-8.4；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述緩沖液為濃度180mM、pH值為8.0的Tris-鹽酸緩沖液。

在本發(fā)明的第二方面，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述冷乙醇沉淀步驟中，將所述低溫超濾產(chǎn)物或血漿與冷乙醇混合后靜置，取上清液，作為冷乙醇沉淀產(chǎn)物；優(yōu)選地，所述冷乙醇的溫度為0-10℃；優(yōu)選地，所述冷乙醇和所述低溫超濾產(chǎn)物或血漿的體積比為1：(4-8)；優(yōu)選地，所述靜置溫度為0-6℃。

在本發(fā)明的第二方面，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述SD滅活步驟中，將所述冷乙醇沉淀產(chǎn)物用濃SD滅活劑重新懸浮后靜置，得到滅活產(chǎn)物；優(yōu)選地，所述靜置溫度為4～37℃，時(shí)間為6～18小時(shí)；更優(yōu)選為所述靜置溫度為20℃，時(shí)間為12小時(shí)；優(yōu)選地，所述濃SD滅活劑含有0.6-4％的N-丁基三磷酸鹽、1-4％的吐溫。

在本發(fā)明的第二方面，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述離心分離步驟中，將所述滅活產(chǎn)物離心后保留上清液，得到離心分離產(chǎn)物；優(yōu)選地，所述離心中，離心力為2000-10000g，時(shí)間為10-20分鐘，溫度為0-8℃。

在本發(fā)明的第二方面，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述陰離子交換步驟中，將所述離心分離產(chǎn)物加入陰離子交換柱中進(jìn)行步級(jí)洗脫，收集每次得到的洗脫液，混合后得到陰離子交換產(chǎn)物；優(yōu)選地，所述步級(jí)洗脫中，先用第一次洗脫緩沖液洗脫，得到第一次洗脫液；再用第二次洗脫液洗脫，得到廢液；再用第三次洗脫液洗脫，得到第三次洗脫液；合并所述第一次洗脫液和第三次洗脫液，得到陰離子交換產(chǎn)物；更優(yōu)選地，所述第一次洗脫液緩沖液中含有50-100mM的氯化鈉，所述第二次洗脫液緩沖液含有250-300mM的氯化鈉，所述第三次洗脫液緩沖液含有450-500mM的氯化鈉；更優(yōu)選地，所述第一次洗脫緩沖液、第二次洗脫緩沖液、第三次洗脫緩沖液均為濃度0.2-200mM、pH值7.0-9.2的Tris-鹽酸緩沖液。

在本發(fā)明的第二方面，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述第一次濃縮步驟中，將所述陰離子交換產(chǎn)物進(jìn)行濃縮，得到第一次濃縮產(chǎn)物；優(yōu)選地，所述透析產(chǎn)物的體積是所述濃縮產(chǎn)物的大于等于5倍，更優(yōu)選為5-500倍；更優(yōu)選地，所述第一次濃縮產(chǎn)物的體積為500微升-10毫升；優(yōu)選地，所述濃縮是采用濃縮管離心，所述濃縮管允許1.0-2.5KD的物質(zhì)通過(guò)，所述離心中，離心力為1000-3000g，溫度為2-8℃；優(yōu)選地，所述濃縮是采用濃縮杯加壓，所述濃縮杯允許1.0-2.5KD的物質(zhì)通過(guò)，所述加壓的壓力為1-15MPa。

在本發(fā)明的第二方面，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述分子篩步驟中，將所述第一次濃縮產(chǎn)物在分子篩中洗脫，得到分子篩產(chǎn)物；優(yōu)選地，所述洗脫的洗脫緩沖液中含有20-500mM的氯化鈉；優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液為Tris-鹽酸緩沖液，其濃度為0.2-200mM，其pH值為7.0-9.2；更優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液為Tris-鹽酸緩沖液，其濃度為20mM，其pH值為8；優(yōu)選地，開(kāi)始收集洗脫液時(shí)的洗脫體積為15-35ml，停止收集洗脫液時(shí)的洗脫體積為40-85ml。

在本發(fā)明的第二方面，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述透析步驟中，將所述分子篩產(chǎn)物進(jìn)行透析，收集透析容器中的產(chǎn)物得到透析產(chǎn)物；優(yōu)選地，所述透析使用的透析緩沖液為Tris-鹽酸緩沖液、磷酸緩沖液、HBS緩沖液中的一種；更優(yōu)選地，所述Tris-鹽酸緩沖液的濃度為0.2-250mM、pH值為7.0-9.2，所述磷酸緩沖液的濃度為1.0-450mM、pH值為6.0-9.2，所述HBS緩沖液的濃度為0.5-600mM、pH值為6.4-8.4；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述透析緩沖液為1mM、pH值為8的Tris鹽酸緩沖液；優(yōu)選地，所述透析的時(shí)間為20-72h；優(yōu)選地，所述透析的體積比是1:(100-10000)。

在本發(fā)明的第二方面，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述濃縮步驟中，將所述透析產(chǎn)物進(jìn)行第二次濃縮，得到第二次濃縮產(chǎn)物，即為所述混合物；優(yōu)選地，所述透析產(chǎn)物的體積是所述濃縮產(chǎn)物的大于等于20倍，更優(yōu)選為20-100倍；優(yōu)選地，所述濃縮是采用濃縮管離心，所述濃縮管允許1.0-2.5KD的物質(zhì)通過(guò)，所述離心中，離心力為1000-3000g；優(yōu)選地，所述濃縮是采用濃縮杯加壓，所述濃縮杯允許1.0-2.5KD的物質(zhì)通過(guò)，所述加壓的壓力為1-20MPa。

第三方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，包含上述的混合物和藥學(xué)上可接受的載體。

在本發(fā)明的第三方面，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述藥學(xué)上可接受的載體為：藥學(xué)上可接受的緩沖液、蛋白質(zhì)、明膠、單糖、多糖、氨基酸、螯合劑、糖醇、聚乙二醇、以及表面活性劑中的一種或多種。

在本發(fā)明的第三方面，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述藥物組合物包括如下組分：1倍體積的上述混合物，9倍體積的8.5wt％NaCl或1.5M、pH7.0的PBS；優(yōu)選地，所述藥物組合物中還包括白蛋白、葡萄糖以及谷氨酰胺；更優(yōu)選地，所述白蛋白在所述藥物組合物中的質(zhì)量體積百分比為2％，所述葡萄糖在所述藥物組合物中的質(zhì)量體積百分比為1％，所述谷氨酰胺在所述藥物組合物中的質(zhì)量體積百分比為3％。

第四方面，本發(fā)明提供一種緩釋制劑，包含上述混合物或上述藥物組合物、以及藥學(xué)上可接受的生物相容物質(zhì)；優(yōu)選地，所述緩釋制劑的劑型為脂質(zhì)體、微球、水凝膠、微型滲透泵或微膠囊。

第五方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，包含上述混合物、上述藥物組合物，上述緩釋制劑。

第六方面，本發(fā)明提供上述混合物、上述藥物組合物、上述緩釋制劑、上述試劑盒，在預(yù)防、改善或/和治療老年癡呆癥藥物中的應(yīng)用。

第七方面，本發(fā)明提供上述混合物、上述藥物組合物、上述緩釋制劑、上述試劑盒，在增強(qiáng)記憶力藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的混合物可以比血漿和目前藥物更有效地提升老年癡呆癥患者的認(rèn)知水平。與此同時(shí)，長(zhǎng)期服用這種混合物可以大大降低長(zhǎng)期服用西藥帶來(lái)的副作用和藥物依賴。本發(fā)明的制備方法可以直接應(yīng)用于放大化生產(chǎn)，可以直接工廠化制備大量的混合物。本發(fā)明的制備方法的各個(gè)步驟、參數(shù)設(shè)置合理，之間協(xié)同作用，共同提高了最終產(chǎn)品的品質(zhì)。本發(fā)明制備的混合物可以用于預(yù)防、改善和治療老年癡呆癥，此外其還可以起到增強(qiáng)記憶力的作用。

附圖說(shuō)明

圖1：測(cè)試?yán)校瑢?shí)施例1的HC4201615混合物SDS-變性膠電泳鑒定結(jié)果電泳圖。泳道M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1-4：HC4201615混合物。

圖2：測(cè)試?yán)?，不同處理后的原代海馬細(xì)胞的顯微照片。往不同的培養(yǎng)有原代海馬細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)基里分別加入HC4201615混合物，和未處理的人血漿，作為實(shí)驗(yàn)組；對(duì)照組海馬細(xì)胞中加入了生理鹽水。一天后在顯微鏡下對(duì)海馬細(xì)胞進(jìn)行成像；圖中(a)、(b)、(c)分別是HC4201615混合物、未處理的人血漿、生理鹽水(即對(duì)照組)處理后的原代海馬細(xì)胞。

圖3：測(cè)試?yán)?，?shí)施例1的HC4201615混合物抑制原代海馬細(xì)胞凋亡的活性的柱狀圖。往不同的培養(yǎng)有原代海馬細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)基里分別加入HC4201615混合物，和未處理的人血漿，作為實(shí)驗(yàn)組；對(duì)照組海馬細(xì)胞中只加生理鹽水；一天后在顯微鏡下對(duì)海馬細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)目和對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目。

圖4：測(cè)試?yán)校瑢?shí)施例1的HC4201615混合物促進(jìn)原代海馬細(xì)胞之間突觸形成的活性的柱狀圖；往不同的培養(yǎng)有原代海馬細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)基里分別加入HC4201615混合物，和未處理的人血漿，作為實(shí)驗(yàn)組；對(duì)照組海馬細(xì)胞中只加生理鹽水；一天后在顯微鏡下對(duì)突觸數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組突觸數(shù)目和對(duì)照組突觸數(shù)目。

圖5：測(cè)試?yán)?，?shí)施例1的HC4201615混合物提升阿爾茲海默癥(老年癡呆癥)小鼠的記憶力動(dòng)物模型數(shù)據(jù)的散點(diǎn)圖。將HC4201615混合物系統(tǒng)地注射到阿爾茲海默癥小鼠模型中；通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)給藥對(duì)阿爾茲海默癥小鼠記憶力的提升作用。

具體實(shí)施方式

為了更好地對(duì)本發(fā)明的技術(shù)特征和效果進(jìn)行說(shuō)明，下面采用具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于此。

本發(fā)明提供一種用于增強(qiáng)記憶力的混合物，其來(lái)源于血漿，即從血漿中分離出的混合物HC4201615，所述混合物包括多種蛋白質(zhì)和多種小分子，所述混合物的SDS-PAGE變性膠電泳具有11條肉眼清晰可見(jiàn)的條帶，所述條帶的分子量為：25kD、37kD、41kD、51kD、66kD、69kD、88kD、105kD、145kD、170kD、200kD。

優(yōu)選地，所述混合物至少含有106種蛋白，還含有與上述160種蛋白結(jié)合的小分子。通過(guò)蛋白質(zhì)譜(比如MS/MS)分析鑒定，所述混合物所含蛋白如下表1。

表1

優(yōu)選地，所述血漿來(lái)源于哺乳動(dòng)物，比如人類、鼠類等，優(yōu)選來(lái)源于人類。

本發(fā)明還提供上述混合物HC4201615的制備方法，所述混合物從血漿提取制備而成，所述制備方法依次包括以下步驟：血漿收集、冷乙醇沉淀、SD滅活、離心分離、陰離子交換、第一次濃縮、分子篩、透析、第二次濃縮步驟；作為優(yōu)選的實(shí)施方式，在血漿收集步驟之后，冷乙醇沉淀步驟之前，該制備方法還包括低溫過(guò)濾步驟和低溫超濾步驟。具體如下：

S1血漿收集：

利用抗凝管收集血液，再通過(guò)離心收集上清液，得到血漿；優(yōu)選地，所述離心力為500-1000g(可以為500g、750g、800g、1000g等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍)，離心時(shí)間為10-30min(可以為10min、15min、20min、25min、30min等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍)，離心溫度為0-10℃(可以為0℃、2.5℃、5℃、7℃、10℃等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍)。

為進(jìn)一步控制最終制備得到的混合物的質(zhì)量，優(yōu)選地，所述血漿收集步驟之后還需要進(jìn)行低溫過(guò)濾步驟和低溫超濾步驟，之后再進(jìn)行冷乙醇沉淀等步驟。

S2低溫過(guò)濾，該步驟主要是去除血漿中可能殘留的血細(xì)胞：

將所述血漿收集步驟得到的血漿加入濾器中，使用蠕動(dòng)泵施加壓力進(jìn)行過(guò)濾(壓力范圍為1-20MPa)，得到濾液；所述濾器的濾膜孔徑不小于0.22微米，優(yōu)選為0.22或0.45微米，整個(gè)過(guò)濾裝置的溫度控制在0-10℃，優(yōu)選為0-5℃。示例性地，上述壓力可以為1MPa、5MPa、10MPa、15MPa、20MPa等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，上述溫度可以為0℃、2℃、4.5℃、5℃等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍。

上述濾膜孔徑不能小于0.22微米，否則血細(xì)胞不能通過(guò)過(guò)濾除去；同時(shí)過(guò)濾的溫度不能高于5℃，最好是0-4℃，不然最終產(chǎn)物里面的蛋白可能變性從而失去活性。

S3低溫超濾(用于將血漿里面的物質(zhì)置換到在pH確定的緩沖液中，從而方便控制溶液體系的pH)：

將所述低溫過(guò)濾得到的濾液進(jìn)行膜包超濾，使用蠕動(dòng)泵施加壓力(范圍為1～20MPa)，得到低溫超濾產(chǎn)物；在膜包超濾過(guò)程中，有效成分會(huì)進(jìn)入緩沖液中；所述膜包截留的分子量為3kD-10kD，超濾使用的緩沖液為磷酸鹽緩沖液，Tris-鹽酸緩沖液和HBS緩沖液等常用緩沖液，整個(gè)超濾裝置的溫度控制在0-5℃，優(yōu)選地，所述Tris-鹽酸緩沖液的濃度為0.2-250mM、pH值為7.0-9.2，所述磷酸緩沖液的濃度為1-450mM、pH值為6.0-9.2，所述HBS緩沖液的濃度為0.5-600mM、pH值為6.4-8.4；更優(yōu)選地，所述緩沖液為180mM、pH值為8.0的Tris-鹽酸緩沖液。

下面通過(guò)例子對(duì)該步驟中參數(shù)的數(shù)據(jù)范圍進(jìn)行說(shuō)明，上述壓力可以為1MPa、5MPa、10MPa、15MPa、20MPa等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍；上述膜包截留分子量可以為3kD、5kD、7kD、10kD等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍；上述Tris-鹽酸緩沖液的濃度可以為0.2mM、1mM、5mM、10mM、50mM、100、125mM、150mM、200mM、250mM等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，pH值可以為7.0、8.0、8.5、8.8、9.0等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍；上述磷酸緩沖液的濃度可以為1mM、10mM、50mM、100mM、200mM、350mM、400mM、430mM等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，pH值可以為6.0、7.0、8.0、8.5、8.8、9.0、9.2等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍；上述HBS緩沖液的濃度可以為0.5mM、1mM、10mM、50mM、100mM、200mM、300mM、350mM、400mM、500mM、600mM等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，pH值可以為6.4、7.0、7.5、8.0、8.4等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍。

上述膜包孔徑不能大于10kD，不然在超濾過(guò)程中一些有效果的蛋白就會(huì)流失；上述超濾的溫度應(yīng)該控制在0-5℃，不然最終產(chǎn)物里面的蛋白可能變性從而失去活性。

S4冷乙醇沉淀(本步驟通過(guò)冷乙醇沉淀的方法去除沒(méi)有效果、甚至是有毒性的蛋白組分以及這些蛋白結(jié)合的小分子)：

將所述低溫超濾產(chǎn)物(如果省略步驟二、三，則將步驟一所述血漿)進(jìn)行冷乙醇沉淀，得到冷乙醇沉淀產(chǎn)物；其中，乙醇在0-10℃預(yù)冷后，和低溫超濾產(chǎn)物(或血漿)以1：(4-8)體積比進(jìn)行混合，混合后于0-6℃放置，直至沉淀自動(dòng)沉降至變實(shí)，取沉淀后得到的上清液，作為冷乙醇沉淀產(chǎn)物；優(yōu)選所述放置時(shí)間為8-16小時(shí)，更優(yōu)選為12小時(shí)。所述變實(shí)是指上清和沉淀有明顯的分界線，上清變得透亮，沉淀數(shù)量不再增多。

下面通過(guò)例子對(duì)該步驟中參數(shù)的數(shù)據(jù)范圍進(jìn)行說(shuō)明，上述預(yù)冷的溫度可以為0℃、2℃、5℃、8℃、10℃等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，上述混合后放置的溫度可以為0℃、1℃、4℃、5℃、6℃等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，上述乙醇和低溫超濾產(chǎn)物的體積比為1：4、1：5、1：6、1:7、1:8等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍。

上述乙醇和低溫超濾產(chǎn)物采用不同體積比，沉淀出來(lái)的蛋白是不同的；同時(shí)溫度必須保持在0-6℃范圍內(nèi)，不然沉淀出的蛋白可能會(huì)變性。

S5SD滅活和離心(本步驟是使得初始原料人血中的潛在病毒失去活性并通過(guò)離心將變性聚集沉淀的雜蛋白去除，從而提高最終產(chǎn)品的安全性)：

將所述冷乙醇沉淀產(chǎn)物和濃SD滅活劑等體積混合，放于4～37℃靜置6～18h，優(yōu)選20℃靜置12h，然后進(jìn)行離心分離，保留上清液，作為離心分離產(chǎn)物；上述靜置的溫度不能低于4℃，時(shí)間不能短于6小時(shí)，不然病毒滅活的效果會(huì)比較一般，不同病毒的滅活時(shí)間也不同。優(yōu)選地，所述離心力為2000-10000g，離心時(shí)間為10-20min，離心溫度為0-8℃，上述離心力不能小于2000g，離心時(shí)間不能小于10min，不然變性聚集沉淀的雜蛋白會(huì)出現(xiàn)沉降不實(shí)的情況。

SD滅活劑含有體積百分比為0.6～4％的TnBP(N-丁基三磷酸鹽)和1.0～4％的Tween80，優(yōu)選為含有2％TnBP和2％Tween80。SD滅活劑的配制如下：以配制100mL的弄SD滅活劑為例，將0.6-4ml TnBP溶于適量水中，然后加入1.0～4mLTween80，混合均勻后用水補(bǔ)至100mL。

下面通過(guò)例子對(duì)該步驟中參數(shù)的數(shù)據(jù)范圍進(jìn)行說(shuō)明，上述靜置的時(shí)間可以為6h、8h、10h、12h、15h、18h等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，溫度可以為4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，上述TnBP的百分比濃度可以為0.3％、0.5％、1％、1.5％、2％等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，上述Tween80的百分比濃度可以為0.5％、1％、1.5％、2％等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍。上述離心力可以為2000g、2500g、5000g、7500g、8000g、10000g等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，時(shí)間可以為10min、12min、15min、20min等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，溫度可以為0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、6℃、7℃等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍。

S7陰離子交換(該步驟制備含有有效成分的蛋白和與這些蛋白結(jié)合的小分子，在很大程度上提高最終產(chǎn)物HC4201615的療效)：

將所述離心分離產(chǎn)物加入陰離子交換柱(比如SourceQ)中，進(jìn)行步級(jí)洗脫，收集每次得到的洗脫液，混合后得到陰離子交換產(chǎn)物；

其中，所述步級(jí)洗脫中，先用第一次洗脫緩沖液洗脫，得到第一次洗脫液；再用第二次洗脫緩沖液洗脫，得到廢液；再用第三次洗脫緩沖液洗脫，得到第三次洗脫液；合并所述第一次洗脫液和第三次洗脫液，得到陰離子交換產(chǎn)物；所述第一次洗脫緩沖液中含有50-100mM的氯化鈉，所述第二次洗脫緩沖液含有250-300mM的氯化鈉，所述第三次洗脫緩沖液含有450-500mM的氯化鈉；三次洗脫的洗脫緩沖液均為濃度是0.2-200mM、pH值是7.0-9.2的Tris-鹽酸緩沖液；每次的洗脫速度控制在儀器允許的范圍內(nèi)，如2-5ml/min。

下面通過(guò)例子對(duì)該步驟中參數(shù)的數(shù)據(jù)范圍進(jìn)行說(shuō)明，上述第一次洗脫緩沖液中氯化鈉的濃度可以為50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，上述第二次洗脫緩沖液中氯化鈉的濃度可以為250mM、260mM、270mM、280mM、290mM、300mM等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，上述第三次洗脫緩沖液中氯化鈉的濃度可以為450mM、460mM、470mM、480mM、490mM、500mM等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，上述Tris-鹽酸緩沖液的濃度可以為0.2mM、0.5mM、1mM、10mM、50mM、100mM、150mM、200mM等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，pH值可以為7.0、8.0、8.5、9.2等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍。

S8第一次濃縮(本步驟的目的是縮小樣品的體積，方便后續(xù)的分子篩上樣操作)：

將所述陰離子交換產(chǎn)物進(jìn)行第一次濃縮，得到第一次濃縮產(chǎn)物；其中，所述陰離子交換產(chǎn)物的體積是所述濃縮產(chǎn)物的大于等于5倍，優(yōu)選為5-500倍，更優(yōu)選為50-500倍；優(yōu)選地，濃縮后的體積為500μL-10mL；優(yōu)選地，所述濃縮是采用濃縮管離心的方式進(jìn)行的，所述濃縮管允許1.0-2.5KD的物質(zhì)通過(guò)，所述離心力為1000-3000g，溫度為2-8℃，濃縮倍數(shù)達(dá)到要求后停止?jié)饪s即可；優(yōu)選地，所述濃縮是采用濃縮杯加壓的方式進(jìn)行的，所述濃縮杯允許1.0-2.5KD的物質(zhì)通過(guò)，所述加壓的壓力范圍為1～15MPa。

所用的濃縮管或濃縮杯大小大于2.5kD時(shí)，最終制備的混合物里面的一些有效成分會(huì)流失，但當(dāng)濃縮管或濃縮杯大小小于1.0kD時(shí)，濃縮速度也會(huì)非常慢，耗時(shí)比較長(zhǎng)；濃縮使用的壓力小于1MPa或者離心力小于1000g時(shí)，濃縮速度會(huì)非常慢，耗時(shí)比較長(zhǎng)；濃縮溫度高于8℃時(shí)，濃縮過(guò)程中一些有效成分可能會(huì)因?yàn)闇囟绕叨冃詮亩セ钚?，濃縮溫度低于2℃時(shí)，溫度控制系統(tǒng)的價(jià)錢又會(huì)相對(duì)較高，同時(shí)存在濃縮產(chǎn)物因?yàn)闇囟忍桶l(fā)生聚集沉淀的風(fēng)險(xiǎn)。

下面通過(guò)例子對(duì)該步驟中參數(shù)的數(shù)據(jù)范圍進(jìn)行說(shuō)明，上述倍數(shù)可以為5、10、50、100、200、250、300、400、500等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，所述濃縮管、濃縮杯允許通過(guò)的物質(zhì)的大小均為1.0KD、1.25KD、1.5KD、1.75KD、2KD、2.25KD、2.5KD等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，所述離心力為1000g、1500g、2000g、2500g、3000g等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，所述溫度可以為2℃、4℃、5℃、8℃等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，所述壓力為1MPa、5MPa、7.5MPa、10MPa、15MPa等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍。

S9分子篩(進(jìn)一步篩分有效蛋白和小分子)：

將所述第一次濃縮產(chǎn)物加入分子篩中，經(jīng)洗脫后收集洗脫液得到分子篩產(chǎn)物；其中，洗脫所用緩沖液中含有20-500mM氯化鈉，僅洗脫一次即可；優(yōu)選地，當(dāng)洗脫體積為15-35ml時(shí)開(kāi)始收集洗脫液，當(dāng)洗脫體積為40-85ml時(shí)停止收集洗脫液，收集得到的洗脫液為HC4201615原液，即為分子篩產(chǎn)物；優(yōu)選地，所述的緩沖液為Tris-鹽酸緩沖液，濃度為0.2-200mM、pH值為7.0-9.2；更優(yōu)選地，所述的緩沖液為Tris-鹽酸緩沖液，濃度為20mM、pH值為8。

下面通過(guò)例子對(duì)該步驟中參數(shù)的數(shù)據(jù)范圍進(jìn)行說(shuō)明，上述洗脫緩沖液中氯化鈉的濃度可以為20mM、50mM、100mM、200mM、250mM、300mM、400mM、500mM等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，上述開(kāi)始收集洗脫液時(shí)的洗脫體積可以為15ml、16ml、17ml、18ml、20ml等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，上述停止收集洗脫液時(shí)的洗脫體積可以為60ml、65ml、70ml、75ml、80ml、85ml等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，上述Tris-鹽酸緩沖液的濃度可以為0.2mM、0.5mM、1mM、10mM、50mM、100mM、150mM、200mM等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，pH值可以為7.0、8.0、8.5、9.2等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍。

本步驟限定了洗脫緩沖液里氯化鈉的濃度，以及開(kāi)始收集和停止收集洗脫液的時(shí)間點(diǎn)；當(dāng)洗脫緩沖液里氯化鈉濃度低于20mM時(shí)，部分蛋白會(huì)因?yàn)槿芙舛鹊投l(fā)生聚集沉淀，導(dǎo)致柱子堵塞和有效成分的流失；當(dāng)洗脫緩沖液里面的氯化鈉濃度高于500mM時(shí)，本步驟的產(chǎn)物會(huì)因?yàn)槁然c濃度過(guò)高而產(chǎn)生很大的滲透壓，從而使得下面的透析步驟需要的更長(zhǎng)的時(shí)間和耗費(fèi)更多的透析液；在上述開(kāi)始收集和停止收集洗脫液的時(shí)間段內(nèi)，收集到的洗脫液才是有效成分，不然收集到的成分要么含有很多無(wú)效甚至有毒的成分，要么就是一些有效成分發(fā)生流失從而導(dǎo)致療效降低。

S10透析：

將所述分子篩產(chǎn)物(HC4201615原液)放入透析袋或管中進(jìn)行透析，透析后收集透析袋或管中的產(chǎn)物，作為透析產(chǎn)物；其中，所述透析時(shí)使用的透析緩沖液為Tris-鹽酸緩沖液，磷酸緩沖液或HBS緩沖液；優(yōu)選地，所述Tris-鹽酸緩沖液的濃度為0.2-250mM、pH值為7.0-9.2，所述磷酸緩沖液的濃度為1.0-450mM、pH值為6.0-9.2，所述HBS緩沖液的濃度為0.5-600mM、pH值為6.4-8.4；更優(yōu)選地，所述透析緩沖液為20mM、pH值為8的Tris鹽酸緩沖液；透析時(shí)間為20-72h，透析體積比(即透析產(chǎn)物和透析液的體積比)是1:(100-10000)。本步驟中的透析操作，可以去除之前步驟中的雜質(zhì)，如滅活劑，以防止該介質(zhì)對(duì)下游產(chǎn)品制備產(chǎn)生不良影響。

本步驟中限定了透析時(shí)間；當(dāng)透析時(shí)間小于20小時(shí)，會(huì)發(fā)生雜志去除不完全的情況；當(dāng)透析時(shí)間超過(guò)72小時(shí)，生產(chǎn)的時(shí)間成本又會(huì)顯著增加。

下面通過(guò)例子對(duì)該步驟中參數(shù)的數(shù)據(jù)范圍進(jìn)行說(shuō)明，上述Tris-鹽酸緩沖液的濃度可以為0.2mM、1mM、5mM、10mM、50mM、100mM、125mM、150mM、200mM、230mM等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，pH值可以為7.0、7.5、8.0、8.5、8.8、9.0等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍；上述磷酸緩沖液的濃度可以為1mM、10mM、50mM、100mM、200mM、350mM、400mM、450mM等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，pH值可以為6.4、7.0、7.5、8.0、8.5、9、9.2等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍；上述HBS緩沖液的濃度可以為0.5mM、1mM、10mM、50mM、100mM、200mM、300mM、350mM、400mM、500mM、600mM等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，pH值可以為6.4、7.0、8.0、8.4等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍；上述透析時(shí)間可以為20h、25h、50h、60h、72h等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍；上述透析體積比可以為1:100、1:500、1:1000、1:2500、1:5000、1:10000等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍。

S11第二次濃縮：

將所述透析產(chǎn)物進(jìn)行第二次濃縮，得到第二次濃縮產(chǎn)物，即為混合物HC4201615；其中，濃縮前體積是濃縮后體積的大于等于20倍，優(yōu)選為20-100倍；優(yōu)選地，所述濃縮是采用濃縮管離心的方式進(jìn)行的，所述濃縮管允許1.0-2.5KD的物質(zhì)通過(guò)，所述離心力為1000-3000g，溫度為2-8℃，濃縮倍數(shù)達(dá)到要求后停止?jié)饪s即可；優(yōu)選地，所述濃縮是采用濃縮杯加壓的方式進(jìn)行的，所述濃縮杯允許1.0-2.5KD的物質(zhì)通過(guò)，所述加壓的壓力范圍為1～20MPa。本步驟的目的之一是提高所述混合物HC4201615中有效組分的濃度，從而提高單位成分的療效；目的之二是通過(guò)濃縮，調(diào)節(jié)溶液的滲透壓。本發(fā)明的制備方法需要兩次濃縮是因?yàn)椋旱谝淮螡饪s是為了縮小體積，方便下面的分子篩步驟的實(shí)施；第二次濃縮是為了有效地控制最終產(chǎn)物HC4201615的滲透壓符合臨床用生理注射劑的要求。

本步驟中限定了濃縮管或濃縮杯允許通過(guò)的物質(zhì)的分子量的大小范圍、使用濃縮管時(shí)的離心力范圍、使用濃縮杯時(shí)的壓力范圍、濃縮時(shí)的溫度范圍；所用的濃縮管或濃縮杯大小大于2.5kD時(shí)，最終制備的混合物里面的一些有效成分會(huì)流失，但當(dāng)濃縮管或濃縮杯大小小于1.0kD時(shí)，濃縮速度也會(huì)非常慢，耗時(shí)比較長(zhǎng)；濃縮使用的壓力小于1MPa或者離心力小于1000g時(shí)，濃縮速度會(huì)非常慢，耗時(shí)比較長(zhǎng)；濃縮溫度高于8℃時(shí)，濃縮過(guò)程中一些有效成分可能會(huì)因?yàn)闇囟绕叨冃詮亩セ钚?，濃縮溫度低于2℃時(shí)，溫度控制系統(tǒng)的價(jià)錢又會(huì)相對(duì)較高，同時(shí)存在濃縮產(chǎn)物因?yàn)闇囟忍桶l(fā)生聚集沉淀的風(fēng)險(xiǎn)。

下面通過(guò)例子對(duì)該步驟中參數(shù)的數(shù)據(jù)范圍進(jìn)行說(shuō)明，上述倍數(shù)可以為20倍、25倍、30倍、50倍、80倍、100倍等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，所述濃縮管、濃縮杯允許通過(guò)的物質(zhì)的大小均為1.0KD、1.25KD、1.5KD、1.75KD、2KD、2.25KD、2.5KD等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，所述離心力為1000g、1500g、2000g、2500g、3000g等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，所述溫度可以為2℃、4℃、5℃、8℃等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍，所述壓力為1MPa、5MPa、7.5MPa、10MPa、15MPa等中任意值或任意兩者之間的數(shù)值范圍。

上述制備方法中使用的各種常用試劑均采用常規(guī)方法配制。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種藥物組合物，包含所述混合物HC4201615和藥學(xué)上可接受的載體。所述藥學(xué)上可接受的載體包括：藥學(xué)上可接受的緩沖液、蛋白質(zhì)、明膠、單糖、多糖、氨基酸、螯合劑、糖醇、聚乙二醇、以及表面活性劑中的一種或多種。

作為優(yōu)選的實(shí)施方式，所述藥物組合物包括如下組分：1倍體積的所述混合物HC4201615，9倍體積的8.5wt％NaCl或1.5M、pH7.0的PBS；優(yōu)選地，所述藥物組合物中還包括白蛋白、葡萄糖以及谷氨酰胺，其中，所述白蛋白在所述藥物組合物中的質(zhì)量體積百分比為2％，所述葡萄糖在所述藥物組合物中的質(zhì)量體積百分比為1％，所述谷氨酰胺在所述藥物組合物中的質(zhì)量體積百分比為3％。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種緩釋制劑，包含所述混合物HC4201615以及藥學(xué)上可接受的生物相容物質(zhì)(也稱為：藥學(xué)上可接受的載體)；優(yōu)選地，所述緩釋制劑的劑型為脂質(zhì)體、微球、水凝膠、微型滲透泵或微膠囊；優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的生物相容物質(zhì)為含水的pH緩沖液，包括磷酸鹽、檸檬酸鹽、或其他有機(jī)酸的緩沖液、抗壞血酸或其他抗氧化劑，低分子量(不超過(guò)10個(gè)殘基)多肽、血清白蛋白、明膠、免疫球蛋白或其他蛋白質(zhì)、聚乙烯吡咯烷酮或其他親水性多聚體、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、賴氨酸或其他氨基酸、單糖、二糖、葡萄糖、甘露糖、糊精或其他糖類、EDTA或其他螯合劑、甘露醇、山梨醇或其他糖醇、鈉離子或其他成鹽反離子、聚乙二醇(PEG)、或其他非離子表面活性劑。)

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種試劑盒，包含有：所述混合物HC4201615、或/和包含所述混合物HC4201615的上述藥物組合物、或/和包含所述混合物HC4201615的上述緩釋劑。

本發(fā)明進(jìn)一步提供所述混合物HC4201615、或/和包含所述混合物HC4201615的上述藥物組合物、或/和包含所述混合物HC4201615的上述緩釋劑、或/和包含所述混合物HC4201615的上述試劑盒，在預(yù)防、改善或/和治療老年癡呆癥的藥物中或在增強(qiáng)記憶力的藥物中的應(yīng)用。

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明混合物的制備、鑒定和應(yīng)用進(jìn)行說(shuō)明。以下實(shí)施例中涉及的分子生物學(xué)操作如未注明具體試驗(yàn)條件和方法，請(qǐng)參照SambrookJ等主編，科學(xué)出版社，2002，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)或相應(yīng)產(chǎn)品的說(shuō)明書。

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明混合物的制備、鑒定和應(yīng)用進(jìn)行說(shuō)明。以下實(shí)施例中使用的原代海馬細(xì)胞是按照如下參考文獻(xiàn)培養(yǎng)的：Guo,W.,Y.Ji,et al.(2014)."Neuronal activity alters BDNF-TrkB signaling kinetics and downstream functions."J Cell Sci 127(Pt 10):2249-2260。)

實(shí)施例1

本實(shí)施例是混合物HC4201615的制備方法，包括以下步驟：

S1：收集血漿

健康人的血液由醫(yī)院獻(xiàn)血所得，采血管為抗凝管，采血過(guò)程中邊放血邊搖晃采血管，防止血液凝固；將含有血液的采血管放入離心機(jī)，設(shè)定離心力為800g，離心15分鐘，離心溫度為4度；然后用移液器小心吸取上清，即為收集到的人血漿。

S2：低溫過(guò)濾

將收集到的血漿加入濾膜孔徑為0.22微米的濾器中，使用蠕動(dòng)泵施加壓力10MPa進(jìn)行過(guò)濾，其過(guò)程中整個(gè)過(guò)濾裝置的溫度控制在0-4℃，得到濾液。

S3：低溫超濾

將該濾液用截留的分子量為8kD的膜包超濾，使用蠕動(dòng)泵施加壓力10MPa，其過(guò)程中使用的緩沖液為濃度180mM、pH8.0的Tris鹽酸緩沖液，整個(gè)超濾裝置的溫度控制在0-4℃，收集超濾后的緩沖液得到低溫超濾產(chǎn)物。

S4：冷乙醇沉淀

將0-4℃預(yù)冷的乙醇與該低溫超濾產(chǎn)物按照體積比1:6混合，再于0℃放置8h，至沉淀自動(dòng)沉降變實(shí)，得到冷乙醇沉淀后的上清液，作為冷乙醇沉淀產(chǎn)物。

S5：SD滅活離心

將該冷乙醇沉淀產(chǎn)物液和濃SD滅活劑(含有2％TnBP，2％Tween80)等體積混合，放于20℃靜置12小時(shí)，然后于5000g、0-4℃離心15分鐘，保留上清液，作為離心分離產(chǎn)物。

S6：陰離子交換

將該離心分離產(chǎn)物加入陰離子交換柱(比如SourceQ，購(gòu)自GE Healthcare，平均粒度為30微米，陰離子交換柱體積為25毫升)中，先用含有75mM氯化鈉的Tris-鹽酸緩沖液(100mM、pH8.0)進(jìn)行第一次洗脫，保留洗脫液；接著用含有275mM氯化鈉的Tris-鹽酸緩沖液(100mM、pH8.0)進(jìn)行第二次洗脫，廢棄洗脫液；最后用含有475mM氯化鈉的Tris-鹽酸緩沖液(100mM、pH8.0)進(jìn)行第三次洗脫，保留洗脫液；合并上述第一次和第三次洗脫得到洗脫液，作為陰離子交換產(chǎn)物；其中，每次洗脫速度為4ml/min，上樣速度為3ml/ml。

上述每次洗脫中，等紫外檢測(cè)器顯示出現(xiàn)蛋白時(shí)開(kāi)始收集即可，蛋白出完了，停止收集，即得到每一次洗脫的洗脫液。

S7：第一次濃縮

取少量該陰離子分離產(chǎn)物加入到體積為2mL的濃縮管中，濃縮管允許大小為2.5kD的物質(zhì)通過(guò)；再將濃縮管放入離心機(jī)中，設(shè)定離心力為1500g，設(shè)定溫度為4℃，啟動(dòng)離心機(jī)，開(kāi)始濃縮，直到最終體積為500微升；之后，將剩余的該透析產(chǎn)物的再次加入該離心管中，以使體積達(dá)到2mL，以相同的參數(shù)進(jìn)行離心，再次濃縮至最終體積為500微升；如此循環(huán)濃縮，直到將透析后的血漿組分最終濃縮到體積為500微升，作為第一次濃縮產(chǎn)物。

S8：分子篩

將第一次濃縮產(chǎn)物加入分子篩中，用含有100mM氯化鈉的Tris-鹽酸緩沖液(濃度為1mM、pH值為8)洗脫，當(dāng)洗脫體積為20ml時(shí)開(kāi)始收集洗脫液，當(dāng)洗脫體積為85ml時(shí)停止收集洗脫液，收集得到的洗脫液為HC4201615原液，即為分子篩產(chǎn)物。

S9：透析

將該分子篩產(chǎn)物加入到孔徑約為0.25納米透析袋中，然后將該透析袋放入1L的燒杯中，再向該燒杯中透析袋外加入1L的20mM Tris鹽酸緩沖液(pH8.0)，邊攪拌邊透析，透析體積比為1:5000；透析溫度為4℃，透析時(shí)間為24小時(shí)，收集透析袋中的產(chǎn)物作為透析產(chǎn)物。

S10：第二次濃縮

取少量該透析產(chǎn)物加入到體積為2mL的濃縮管中，濃縮管允許大小為2.5kD的物質(zhì)通過(guò)；再將濃縮管放入離心機(jī)中，設(shè)定離心力為1500g，設(shè)定溫度為4℃，啟動(dòng)離心機(jī)，開(kāi)始濃縮，直到最終體積為500微升；之后，將剩余的該透析產(chǎn)物的再次加入該離心管中，以使體積達(dá)到2mL，以相同的參數(shù)進(jìn)行離心，再次濃縮至最終體積為500微升；如此循環(huán)濃縮，直到將透析后的血漿組分最終濃縮到體積為500微升，作為濃縮產(chǎn)物，即為上述混合物HC4201615。

實(shí)施例2

本實(shí)施例中，除S7不同于實(shí)施例1以外，其他制備步驟均與實(shí)施例1相同，在本實(shí)施例中，步驟S7具體如下：

將實(shí)施例1中S7制備的陰離子交換產(chǎn)物加入允許2.5kD物質(zhì)通過(guò)的濃縮杯中，蓋上濃縮杯蓋，將濃縮杯放入的層析柜，然后將濃縮杯接上液氮瓶，打開(kāi)液氮瓶氣閥門，設(shè)定壓力為10MPa；在此氣壓下，濃縮杯開(kāi)始濃縮透析后產(chǎn)物，觀測(cè)到濃縮后產(chǎn)物的體積是濃縮前的1/50時(shí)，停止?jié)饪s，得到第一次濃縮產(chǎn)物。

實(shí)施例3

本實(shí)施例中，除S10不同于實(shí)施例1以外，其他制備步驟均與實(shí)施例1相同，在本實(shí)施例中，S10具體如下：

將實(shí)施例1中S10制備的透析產(chǎn)物加入允許2.5kD物質(zhì)通過(guò)的濃縮杯中，蓋上濃縮杯蓋，將濃縮杯放入的層析柜，然后將濃縮杯接上液氮瓶，打開(kāi)液氮瓶氣閥門，設(shè)定壓力為10MPa；在此氣壓下，濃縮杯開(kāi)始濃縮透析后產(chǎn)物，觀測(cè)到濃縮后產(chǎn)物的體積是濃縮前的1/50時(shí)，停止?jié)饪s，得到第二次濃縮產(chǎn)物，即為混合物HC4201615。

實(shí)施例4

本實(shí)施例是混合物HC4201615的制備方法，該方法包括以下步驟：

S1：收集血漿，與實(shí)施例1的S1操作方法相同。

S2：低溫過(guò)濾，將收集到的血漿加入濾膜孔徑為0.45微米的濾器中，使用蠕動(dòng)泵施加壓力15MPa進(jìn)行過(guò)濾，其過(guò)程中整個(gè)過(guò)濾裝置的溫度控制在0-4℃，得到濾液。

S3：低溫超濾

將該濾液用截留的分子量為3kD的膜包超濾，使用蠕動(dòng)泵施加壓力20MPa，其過(guò)程中使用的緩沖液為濃度180mM、pH8.0的Tris鹽酸緩沖液，整個(gè)超濾裝置的溫度控制在0-4℃，收集超濾后的緩沖液得到低溫超濾產(chǎn)物。

S4：冷乙醇沉淀

將0-4℃預(yù)冷的乙醇與該低溫超濾產(chǎn)物按照體積比1:4混合，再于0℃放置16h，至沉淀自動(dòng)沉降變實(shí)，得到上清液，作為冷乙醇沉淀產(chǎn)物。

S5：SD滅活離心

將該冷乙醇沉淀產(chǎn)物和濃SD滅活劑(含有2％TnBP，2％Tween80)等體積混合，放于4℃靜置18小時(shí)后，于2000g、0℃離心20分鐘，保留上清液，作為離心分離產(chǎn)物。

S6：陰離子交換

將該離心分離產(chǎn)物加入陰離子交換柱(比如SourceQ，購(gòu)自GE Healthcare，平均粒度為30微米，陰離子交換柱體積為25毫升)中，先用含有80mM氯化鈉的Tris-鹽酸緩沖液(100mM、pH8.0)進(jìn)行第一次洗脫，保留洗脫液；接著用含有275mM氯化鈉的Tris-鹽酸緩沖液(100mM、pH8.0)進(jìn)行第二次洗脫，廢棄洗脫液；最后用含有475mM氯化鈉的Tris-鹽酸緩沖液(100mM、pH8.0)進(jìn)行第三次洗脫，保留洗脫液；合并上述第一次和第三次洗脫得到洗脫液，作為陰離子交換產(chǎn)物；其中，每次洗脫速度為4ml/min，上樣速度為3ml/ml。

上述每次洗脫中，等紫外檢測(cè)器顯示出現(xiàn)蛋白時(shí)開(kāi)始收集即可，蛋白出完了，停止收集，即得到每一次洗脫的洗脫液。

S7：第一次濃縮

取少量該陰離子分離產(chǎn)物加入到體積為2mL的濃縮管中，濃縮管允許大小為1kD的物質(zhì)通過(guò)；再將濃縮管放入離心機(jī)中，設(shè)定離心力為1000g，設(shè)定溫度為4℃，啟動(dòng)離心機(jī)，開(kāi)始濃縮，直到最終體積為500微升；之后，將剩余的該透析產(chǎn)物的再次加入該離心管中，以使體積達(dá)到2mL，以相同的參數(shù)進(jìn)行離心，再次濃縮至最終體積為500微升；如此循環(huán)濃縮，直到將透析后的血漿組分最終濃縮到體積為500微升，作為第一次濃縮產(chǎn)物。

S8：分子篩

將第一次濃縮產(chǎn)物加入分子篩中，用含有20mM氯化鈉的Tris-鹽酸緩沖液(濃度為1mM、pH值為8)洗脫，當(dāng)洗脫體積為20ml時(shí)開(kāi)始收集洗脫液，當(dāng)洗脫體積為85ml時(shí)停止收集洗脫液，收集得到的洗脫液為HC4201615原液，即為分子篩產(chǎn)物。

S9：透析

將該分子篩產(chǎn)物加入到孔徑約為0.25納米透析袋中，然后將該透析袋放入1L的燒杯中，再向該燒杯中透析袋外加入1L的20mM Tris鹽酸緩沖液(pH8.0)，邊攪拌邊透析，透析體積比為1:100；透析溫度為4℃，透析時(shí)間為40小時(shí)，得到透析產(chǎn)物。

S10：第二次濃縮

取少量該透析產(chǎn)物加入到體積為2mL的濃縮管中，濃縮管允許大小為1.5kD的物質(zhì)通過(guò)；再將濃縮管放入離心機(jī)中，設(shè)定離心力為1000g，設(shè)定溫度為4℃，啟動(dòng)離心機(jī)，開(kāi)始濃縮，直到最終體積為500微升；之后，將剩余的該透析產(chǎn)物的再次加入該離心管中，以使體積達(dá)到2mL，以相同的參數(shù)進(jìn)行離心，再次濃縮至最終體積為500微升；如此循環(huán)濃縮，直到將透析后的血漿組分最終濃縮到體積為500微升，作為濃縮產(chǎn)物，即為上述混合物HC4201615。

實(shí)施例5

本實(shí)施例是混合物HC4201615的制備方法，該方法包括以下步驟：

S1：收集血漿，與實(shí)施例1的S1操作方法相同。

S2：低溫過(guò)濾

將收集到的血漿加入濾膜孔徑為0.45微米的濾器中，使用蠕動(dòng)泵施加壓力20MPa進(jìn)行過(guò)濾，其過(guò)程中整個(gè)過(guò)濾裝置的溫度控制在0-4℃，得到濾液。

S3：低溫超濾

將該濾液用截留的分子量為10kD的膜包超濾，使用蠕動(dòng)泵施加壓力1MPa，其過(guò)程中使用的緩沖液為濃度180mM、pH8.0的Tris鹽酸緩沖液，整個(gè)超濾裝置的溫度控制在0-4℃，收集超濾后的緩沖液得到低溫超濾產(chǎn)物。

S4：冷乙醇沉淀

將0-4℃預(yù)冷的乙醇與該低溫超濾產(chǎn)物按照體積比1:8混合，再于0℃放置10h，至沉淀自動(dòng)沉降變實(shí)，取上清液，作為冷乙醇沉淀產(chǎn)物。

S5：SD滅活

將該冷乙醇沉淀產(chǎn)物用SD滅活劑(含有1％TnBP，1％Tween80)重新懸浮，放于37℃靜置6小時(shí)，靜置后的產(chǎn)物即為滅活產(chǎn)物。

S6：離心分離

將該滅活產(chǎn)物于10000g、4℃離心10分鐘，保留上清液，作為離心分離產(chǎn)物。

S7：陰離子交換

將該離心分離產(chǎn)物加入陰離子交換柱(比如SourceQ，購(gòu)自GE Healthcare，平均粒度為30微米，陰離子交換柱體積為25毫升)中，先用含有50mM氯化鈉的Tris-鹽酸緩沖液(100mM、pH8.0)進(jìn)行第一次洗脫，保留洗脫液；接著用含有250mM氯化鈉的Tris-鹽酸緩沖液(100mM、pH8.0)進(jìn)行第二次洗脫，廢棄洗脫液；最后用含有450mM氯化鈉的Tris-鹽酸緩沖液(100mM、pH8.0)進(jìn)行第三次洗脫，保留洗脫液；合并上述第一次和第三次洗脫得到洗脫液，作為陰離子交換產(chǎn)物；其中，每次洗脫速度為4ml/min，上樣速度為3ml/ml。

上述每次洗脫中，等紫外檢測(cè)器顯示出現(xiàn)蛋白時(shí)開(kāi)始收集即可，蛋白出完了，停止收集，即得到每一次洗脫的洗脫液。

S8：第一次濃縮

取少量該陰離子分離產(chǎn)物加入到體積為2mL的濃縮管中，濃縮管允許大小為2.5kD的物質(zhì)通過(guò)；再將濃縮管放入離心機(jī)中，設(shè)定離心力為3000g，設(shè)定溫度為4℃，啟動(dòng)離心機(jī)，開(kāi)始濃縮，直到最終體積為500微升；之后，將剩余的該透析產(chǎn)物的再次加入該離心管中，以使體積達(dá)到2mL，以相同的參數(shù)進(jìn)行離心，再次濃縮至最終體積為500微升；如此循環(huán)濃縮，直到將透析后的血漿組分最終濃縮到體積為500微升，作為第一次濃縮產(chǎn)物。

S9：分子篩

將第一次濃縮產(chǎn)物加入分子篩中，用含有500mM氯化鈉的Tris-鹽酸緩沖液(濃度為1mM、pH值為8)洗脫，當(dāng)洗脫體積為20ml時(shí)開(kāi)始收集洗脫液，當(dāng)洗脫體積為85ml時(shí)停止收集洗脫液，收集得到的洗脫液為HC4201615原液，即為分子篩產(chǎn)物。

S10：透析

將該分子篩產(chǎn)物加入到孔徑約為0.25納米透析袋中，然后將該透析袋放入1L的燒杯中，再向該燒杯中透析袋外加入1L的1mM Tris鹽酸緩沖液(pH8.0)，邊攪拌邊透析，透析體積比為1:10000；透析溫度為4℃，透析時(shí)間為20小時(shí)，得到透析產(chǎn)物。

S11：第二次濃縮

取少量該透析產(chǎn)物加入到體積為2mL的濃縮管中，濃縮管允許大小為2kD的物質(zhì)通過(guò)；再將濃縮管放入離心機(jī)中，設(shè)定離心力為3000g，設(shè)定溫度為4℃，啟動(dòng)離心機(jī)，開(kāi)始濃縮，直到最終體積為500微升；之后，將剩余的該透析產(chǎn)物的再次加入該離心管中，以使體積達(dá)到2mL，以相同的參數(shù)進(jìn)行離心，再次濃縮至最終體積為500微升；如此循環(huán)濃縮，直到將透析后的血漿組分最終濃縮到體積為500微升，作為濃縮產(chǎn)物，即為上述混合物HC4201615。

實(shí)施例6

本實(shí)施例是混合物HC4201615的制備方法，該方法包括以下步驟：

S1：收集血漿，與實(shí)施例1的S1操作方法相同。

S2：低溫過(guò)濾

將收集到的血漿加入濾膜孔徑為0.22微米的濾器中，使用蠕動(dòng)泵施加壓力1MPa進(jìn)行過(guò)濾，其過(guò)程中整個(gè)過(guò)濾裝置的溫度控制在0-4℃，得到濾液。

S3：低溫超濾

將該濾液用截留的分子量為5kD的膜包超濾，使用蠕動(dòng)泵施加壓力15MPa，其過(guò)程中使用的緩沖液為濃度1mM、pH8.0的Tris鹽酸緩沖液，整個(gè)超濾裝置的溫度控制在0-4℃，收集超濾后的緩沖液得到低溫超濾產(chǎn)物。

S4：冷乙醇沉淀

將0-4℃預(yù)冷的乙醇與該低溫超濾產(chǎn)物按照體積比1:5混合，再于0℃放置12h，至沉淀自動(dòng)沉降變實(shí)，取上清液，作為冷乙醇沉淀產(chǎn)物。

S5：SD滅活離心

將該冷乙醇沉淀產(chǎn)物用SD滅活劑(含有1％TnBP，1％Tween80)重新懸浮，放于20℃靜置15小時(shí)后，于6000g、6℃離心15分鐘，保留上清液，作為離心分離產(chǎn)物。

S6：陰離子交換

將該離心分離產(chǎn)物加入陰離子交換柱(比如SourceQ，購(gòu)自GE Healthcare，平均粒度為3微米，陰離子交換柱體積為25毫升)中，先用含有100mM氯化鈉的Tris-鹽酸緩沖液(100mM、pH8.0)進(jìn)行第一次洗脫，保留洗脫液；接著用含有300mM氯化鈉的Tris-鹽酸緩沖液(100mM、pH8.0)進(jìn)行第二次洗脫，廢棄洗脫液；最后用含有500mM氯化鈉的Tris-鹽酸緩沖液(100mM、pH8.0)進(jìn)行第三次洗脫，保留洗脫液；合并上述第一次和第三次洗脫得到洗脫液，作為陰離子交換產(chǎn)物；其中，每次洗脫速度為4ml/min，上樣速度為3ml/ml。

上述每次洗脫中，等紫外檢測(cè)器顯示出現(xiàn)蛋白時(shí)開(kāi)始收集即可，蛋白出完了，停止收集，即得到每一次洗脫的洗脫液。。

S7：一次濃縮

取少量該陰離子分離產(chǎn)物加入到體積為2mL的濃縮管中，濃縮管允許大小為2kD的物質(zhì)通過(guò)；再將濃縮管放入離心機(jī)中，設(shè)定離心力為2000g，設(shè)定溫度為4℃，啟動(dòng)離心機(jī)，開(kāi)始濃縮，直到最終體積為500微升；之后，將剩余的該透析產(chǎn)物的再次加入該離心管中，以使體積達(dá)到2mL，以相同的參數(shù)進(jìn)行離心，再次濃縮至最終體積為500微升；如此循環(huán)濃縮，直到將透析后的血漿組分最終濃縮到體積為500微升，作為第一次濃縮產(chǎn)物。

S8：分子篩

將第一次濃縮產(chǎn)物加入分子篩中，用含有300mM氯化鈉的Tris-鹽酸緩沖液(濃度為1mM、pH值為8)洗脫，當(dāng)洗脫體積為20ml時(shí)開(kāi)始收集洗脫液，當(dāng)洗脫體積為85ml時(shí)停止收集洗脫液，收集得到的洗脫液為HC4201615原液，即為分子篩產(chǎn)物。

S9：透析

將該分子篩產(chǎn)物加入到孔徑約為0.25納米透析袋中，然后將該透析袋放入1L的燒杯中，再向該燒杯中透析袋外加入1L的1mM Tris鹽酸緩沖液(pH8.0)，邊攪拌邊透析，透析體積比為1:2500；透析溫度為4℃，透析時(shí)間為72小時(shí)，得到透析產(chǎn)物。

S10：第二次濃縮

取少量該透析產(chǎn)物加入到體積為2mL的濃縮管中，濃縮管允許大小為1kD的物質(zhì)通過(guò)；再將濃縮管放入離心機(jī)中，設(shè)定離心力為2000g，設(shè)定溫度為4℃，啟動(dòng)離心機(jī)，開(kāi)始濃縮，直到最終體積為500微升；之后，將剩余的該透析產(chǎn)物的再次加入該離心管中，以使體積達(dá)到2mL，以相同的參數(shù)進(jìn)行離心，再次濃縮至最終體積為500微升；如此循環(huán)濃縮，直到將透析后的血漿組分最終濃縮到體積為500微升，作為濃縮產(chǎn)物，即為上述混合物HC4201615。

測(cè)試?yán)?/p>

本測(cè)試?yán)菍?shí)施例1-6制備的混合物HC4201615分別進(jìn)行檢測(cè)。

一、SDS-PAGE變性膠電泳鑒定，該鑒定方法包括以下步驟：

(1)從最終制備得到的混合物HC4201615里取出2微升，在紫外280nm下測(cè)定其吸光度，從而計(jì)算混合物HC4201615的蛋白濃度。

(2)取一定體積的混合物HC4201615，與1微升5×蛋白上樣緩沖液(購(gòu)自北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)D621)混合，即為需要進(jìn)行電泳的樣品，該樣品里面有10微克的蛋白質(zhì)。

(3)將電泳樣品升溫至100℃，加熱20分鐘使蛋白質(zhì)變性，然后立即將樣品放到冰上，等待5分鐘后開(kāi)始跑SDS-PAGE變性還原膠(所述SDS變性還原膠的配制方法如下：30(w/v)％的丙烯酰胺Acr-Bis(購(gòu)自GE Healthcare)取1.3ml、1.5M Tris-鹽酸緩沖液(pH8.8，購(gòu)自GE Healthcare)取1.3ml、10(w/v)％的SDS取0.05ml、10％(w/v)過(guò)硫酸銨(購(gòu)自GE Healthcare)取0.05ml、TEMED(購(gòu)自GE Healthcare)取0.003ml、以及水取2.3ml，共計(jì)5ml，混合后在室溫即可凝固成膠)。跑膠時(shí)，每個(gè)泳道的蛋白上樣量為10微克，設(shè)定跑膠電壓為100V，開(kāi)始跑膠，跑膠時(shí)間為1小時(shí)。

(4)跑完膠后，用考馬斯亮藍(lán)染色液(該染色液的制備方法為：將2.5g考馬斯亮藍(lán)R-250溶于500ml 95％乙醇溶液，加入100ml 85％的乙酸溶液，然后，用蒸餾水補(bǔ)充至1000ml，此染液放4℃至少6個(gè)月保持穩(wěn)定)對(duì)膠進(jìn)行染色。

實(shí)施例1制備的混合物HC4201615的檢測(cè)結(jié)果參見(jiàn)圖1：其中：泳道M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1-4：HC4201615混合物；該混合物HC4201615里至少含有11條肉眼可見(jiàn)多肽，其分子量分別為從小到大依次是25kD、37kD、41kD、51kD、66kD、69kD、88kD、105kD、145kD、170kD、200kD。實(shí)施例2-6的檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例1相同。

二、蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定，該鑒定方法包括如下步驟：

(1)將最終制備得到的混合物HC4201615轉(zhuǎn)移到FALCON管中，加入兩倍體積的樣品緩沖液(緩沖液的配方為：7.5M尿素UREA，1.5M硫脲THIOUREA，4(w/v)％3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽CHAPS，0.05(w/v)％十二烷基硫酸鈉SDS，100mM二硫蘇糖醇DDT，各組分前的所示濃度是其相應(yīng)組分在緩沖液中的濃度)，并通過(guò)3kDa molecular weight cut-off spin columns(Pall GmbH,Austria)離心管離心濃縮，得到濃縮液。

(2)濃縮液用二硫蘇糖醇進(jìn)行還原反應(yīng)，得到還原產(chǎn)物；其中，濃縮液與二硫蘇糖醇的體積比為1：3，反應(yīng)時(shí)間為15分鐘，溫度為室溫。

(3)再將該還原產(chǎn)物與碘乙酰胺進(jìn)行反應(yīng)，得到烷基化產(chǎn)物；其中，該還原產(chǎn)物與碘乙酰胺的體積比1：1，反應(yīng)時(shí)間為15分鐘，溫度為室溫；

(4)隨后用胰蛋白酶在37℃進(jìn)行消化反應(yīng)過(guò)夜，其中烷基化產(chǎn)物與胰蛋白酶的體積比1:1，得到消化后的肽段。

(5)胰蛋白酶消化所得肽段通過(guò)C18色譜柱純化，得到樣品。

(6)所得樣品真空離心干燥并隨后保存在-20℃冰箱中用于MS/MS分析。MS/MS分析具體如下：HPLC用的是Ultimate 3000系統(tǒng)，其中配備了PepMap100C-18trap column(300μm×5mm)和PepMap100C-18analytical column(75μm×250mm)兩根柱子。質(zhì)譜儀采用Amazon speed ETD,MS數(shù)據(jù)采集范圍為400-1400m/z,MS/MS的肽段處理范圍為100-2800m/z。隨后，每個(gè)MS數(shù)據(jù)會(huì)自動(dòng)搜索與其匹配的三個(gè)質(zhì)量最好的CID MS/MS峰譜。噴嘴口電壓設(shè)置為1400伏特。氮?dú)獗Ｗo(hù)的溫度為150℃，流速為3升/分鐘。MS的蛋白質(zhì)識(shí)別和無(wú)標(biāo)記定量(LFQ)數(shù)據(jù)分析采用開(kāi)放源代碼軟件MaxQuant 1.3.0.5。通過(guò)搜索SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)(版本10/2003 20354項(xiàng))對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，實(shí)施例1制備的混合物HC4201615的鑒定結(jié)果參見(jiàn)表1。實(shí)施例2-6的檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例1相同。

三、檢測(cè)實(shí)施例1-6制備的混合物HC4201615具有體外抑制原代海馬細(xì)胞凋亡的活性、促進(jìn)海馬細(xì)胞之間突觸形成的活性。該檢測(cè)方法包括以下步驟：

(1)從最終制備得到的混合物HC4201615里取出2微升，在紫外280nm下測(cè)定其吸光度，從而計(jì)算上述混合物HC4201615的蛋白濃度。

(2)用24孔板培養(yǎng)原代海馬細(xì)胞，培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為DMEM，培養(yǎng)條件為37℃，5vol％二氧化碳。

(3)等到細(xì)胞密度達(dá)到每孔4×10⁵個(gè)細(xì)胞時(shí)，往培養(yǎng)基里加入混合物HC4201615，每個(gè)孔中加入的混合物HC4201615含蛋白1000微克，作為實(shí)驗(yàn)組1-混合物HC4201615。同時(shí)實(shí)驗(yàn)組中還包括：即往不同孔的培養(yǎng)基里分別加入蛋白含量為1000微克的人血漿(實(shí)施例1制備方法的步驟(1)制備得到)，命名為實(shí)驗(yàn)組2-人血漿。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，在對(duì)照組中，等到細(xì)胞密度達(dá)到每孔4×10⁵個(gè)細(xì)胞時(shí)，往孔的培養(yǎng)基中添加100微升的生理鹽水。

(4)在原先的條件下繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，然后在光學(xué)顯微鏡下對(duì)各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量和突觸數(shù)量的計(jì)數(shù)。

實(shí)施例1制備的混合物HC4201615的結(jié)果，如圖2-4所示，其中圖2(a),(b),(c)分別是按照實(shí)驗(yàn)組1-HC4201614、實(shí)驗(yàn)組2-人血漿、對(duì)照組處理后得到的原代海馬細(xì)胞?？捎^測(cè)到無(wú)論是海馬細(xì)胞數(shù)量還是形成的突觸數(shù)量，實(shí)驗(yàn)組1-HC4201615混合物均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組，大于實(shí)驗(yàn)組2-人血漿；圖3中，實(shí)驗(yàn)組1的原代海馬細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到約1500-1800個(gè)/平方厘米，遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)組2的約650-900個(gè)/平方厘米，和對(duì)照組的約200-600個(gè)/平方厘米，證明混合物HC4201615具有抑制原代海馬細(xì)胞凋亡的活性。圖4中，實(shí)驗(yàn)組1的突觸形成數(shù)量達(dá)到約165個(gè)/平方厘米，遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)組2的約75個(gè)/平方厘米，和對(duì)照組的約60個(gè)/平方厘米，證明分離物HC4201615具有促進(jìn)海馬細(xì)胞之間突觸形成的活性。

實(shí)施例2制備的混合物HC4201615的結(jié)果如下：實(shí)驗(yàn)組1的原代海馬細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到約1350-1800個(gè)/平方厘米，遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)組2的約650-900個(gè)/平方厘米，和對(duì)照組的約200-600個(gè)/平方厘米，證明混合物HC4201615具有抑制原代海馬細(xì)胞凋亡的活性。實(shí)驗(yàn)組1的突觸形成數(shù)量達(dá)到約150個(gè)/平方厘米，遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)組2的約70個(gè)/平方厘米，和對(duì)照組的約60個(gè)/平方厘米，證明分離物HC4201615具有促進(jìn)海馬細(xì)胞之間突觸形成的活性。證明實(shí)施例2制備的HC4201615混合物具有促進(jìn)海馬細(xì)胞之間突觸形成的活性。

實(shí)施例3制備的混合物HC4201615的結(jié)果如下：實(shí)驗(yàn)組1的原代海馬細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到約1000-1600個(gè)/平方厘米，遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)組2的約500-750個(gè)/平方厘米，和對(duì)照組的約400-700個(gè)/平方厘米，證明混合物HC4201615具有抑制原代海馬細(xì)胞凋亡的活性。實(shí)驗(yàn)組1的突觸形成數(shù)量達(dá)到約150個(gè)/平方厘米，遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)組2的約70個(gè)/平方厘米，和對(duì)照組的約50個(gè)/平方厘米，證明分離物HC4201615具有促進(jìn)海馬細(xì)胞之間突觸形成的活性。證明實(shí)施例3制備的HC4201615混合物具有促進(jìn)海馬細(xì)胞之間突觸形成的活性。

實(shí)施例4制備的混合物HC4201615的結(jié)果如下：實(shí)驗(yàn)組1的原代海馬細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到約1200-1800個(gè)/平方厘米，遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)組2的約650-900個(gè)/平方厘米，和對(duì)照組的約200-600個(gè)/平方厘米，證明混合物HC4201615具有抑制原代海馬細(xì)胞凋亡的活性。實(shí)驗(yàn)組1的突觸形成數(shù)量達(dá)到約120個(gè)/平方厘米，遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)組2的約70個(gè)/平方厘米，和對(duì)照組的約60個(gè)/平方厘米，證明分離物HC4201615具有促進(jìn)海馬細(xì)胞之間突觸形成的活性。證明實(shí)施例4制備的HC4201615混合物具有促進(jìn)海馬細(xì)胞之間突觸形成的活性。

實(shí)施例5制備的混合物HC4201615的結(jié)果如下：實(shí)驗(yàn)組1的原代海馬細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到約1200-1900個(gè)/平方厘米，遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)組2的約650-900個(gè)/平方厘米，和對(duì)照組的約200-600個(gè)/平方厘米，證明混合物HC4201615具有抑制原代海馬細(xì)胞凋亡的活性。實(shí)驗(yàn)組1的突觸形成數(shù)量達(dá)到約100個(gè)/平方厘米，遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)組2的約70個(gè)/平方厘米，和對(duì)照組的約60個(gè)/平方厘米，證明分離物HC4201615具有促進(jìn)海馬細(xì)胞之間突觸形成的活性。證明實(shí)施例5制備的HC4201615混合物具有促進(jìn)海馬細(xì)胞之間突觸形成的活性。

實(shí)施例6制備的混合物HC4201615的結(jié)果如下：實(shí)驗(yàn)組1的原代海馬細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到約1200-1900個(gè)/平方厘米，遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)組2的約650-900個(gè)/平方厘米，和對(duì)照組的約200-600個(gè)/平方厘米，證明混合物HC4201615具有抑制原代海馬細(xì)胞凋亡的活性。實(shí)驗(yàn)組1的突觸形成數(shù)量達(dá)到約100個(gè)/平方厘米，遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)組2的約70個(gè)/平方厘米，和對(duì)照組的約60個(gè)/平方厘米，證明分離物HC4201615具有促進(jìn)海馬細(xì)胞之間突觸形成的活性。證明實(shí)施例6制備的HC4201615混合物具有促進(jìn)海馬細(xì)胞之間突觸形成的活性。

四、檢測(cè)實(shí)施例1-6制備的混合物HC4201615能夠有效提升阿爾茲海默癥(老年癡呆癥)小鼠的記憶力，該檢測(cè)方法包括以下步驟：

(1)本實(shí)施例采用5XFAD老年癡呆小鼠模型，訂購(gòu)于美國(guó)jackson laboratory,并按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行繁殖和飼養(yǎng)；其中每一只實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈蠖纪ㄟ^(guò)鼠尾進(jìn)行基因鑒定，確保APP基因和PS1基因的穩(wěn)定突變。

小鼠的分組為：實(shí)驗(yàn)組1-混合物HC4201615：采用20只14周齡5XFAD雄性小鼠，注射實(shí)施例1制備的混合物HC4201615；實(shí)驗(yàn)組2-人血漿：采用20只14周齡5XFAD雄性小鼠，注射實(shí)施例1制備方法的步驟(1)制備得到的血漿；對(duì)照組：采用20只14周齡5XFAD雄性小鼠，注射生理鹽水。

各種給藥通過(guò)鼠尾靜脈注射進(jìn)小鼠體內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組保證30微克蛋白/次的給藥劑量，在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)(具體為水迷宮實(shí)驗(yàn)，用于檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶力)前24天內(nèi)每三天給藥1次，共給藥8次。

(2)水迷宮實(shí)驗(yàn)：在每天上午8點(diǎn)到下午1點(diǎn)間進(jìn)行。水迷宮空間記憶訓(xùn)練期為4天，每天4次，每次訓(xùn)練間隔時(shí)間為10分鐘；在實(shí)驗(yàn)中，每四個(gè)小鼠被隨機(jī)分為一個(gè)訓(xùn)練組。對(duì)于每個(gè)訓(xùn)練組，水迷宮的平臺(tái)位置被隨機(jī)分配，且在整個(gè)訓(xùn)練中保持不變。訓(xùn)練中，小鼠從任意位置釋放入水迷宮中，并允許它在120秒中搜索隱藏的平臺(tái)。如果小鼠沒(méi)有在120秒內(nèi)找到平臺(tái)，它將被引導(dǎo)到平臺(tái)。每次訓(xùn)練中找到平臺(tái)所用的時(shí)間和所經(jīng)過(guò)的距離被智能攝像頭自動(dòng)記錄下來(lái)。

水迷宮測(cè)試在最后一次訓(xùn)練48小時(shí)后進(jìn)行。每次測(cè)試中，每只小鼠被釋放入沒(méi)有放置平臺(tái)的水迷宮中，并允許其自由活動(dòng)60秒。其游動(dòng)路線被智能攝像頭自動(dòng)記錄下來(lái)。測(cè)試期比訓(xùn)練期時(shí)間短一倍，以避免小鼠產(chǎn)生抑郁行為。小鼠在目標(biāo)象限所花費(fèi)的時(shí)間與其他三個(gè)象限所花費(fèi)的時(shí)間被記錄下來(lái)，用于對(duì)小鼠記憶力的評(píng)估。

實(shí)施例1制備的混合物HC4201615的結(jié)果如圖5所示，實(shí)驗(yàn)組1的目標(biāo)象限停留記憶時(shí)間約為100秒，遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于實(shí)驗(yàn)組2的約25秒和對(duì)照組的約10秒。

實(shí)施例2制備的混合物HC4201615的結(jié)果如下：實(shí)驗(yàn)組1的目標(biāo)象限停留記憶時(shí)間約為100秒，遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于實(shí)驗(yàn)組2的約25秒和對(duì)照組的約10秒。

實(shí)施例3制備的混合物HC4201615的結(jié)果如下：實(shí)驗(yàn)組1的目標(biāo)象限停留記憶時(shí)間約為90秒，遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于實(shí)驗(yàn)組2的約10秒和對(duì)照組的約5秒。

實(shí)施例4制備的混合物HC4201615的結(jié)果如下：實(shí)驗(yàn)組1的目標(biāo)象限停留記憶時(shí)間約為90秒，遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于實(shí)驗(yàn)組2的約25秒和對(duì)照組的約10秒。

實(shí)施例5制備的混合物HC4201615的結(jié)果如下：實(shí)驗(yàn)組1的目標(biāo)象限停留記憶時(shí)間約為95秒，遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于實(shí)驗(yàn)組2的約25秒和對(duì)照組的約10秒。

實(shí)施例6制備的混合物HC4201615的結(jié)果如下：實(shí)驗(yàn)組1的目標(biāo)象限停留記憶時(shí)間約為100秒，遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于實(shí)驗(yàn)組2的約25秒和對(duì)照組的約10秒。

對(duì)比例1

除步驟(3)低溫超濾步驟中使用的膜包截留的分子量為13kD以外，其他操作步驟與實(shí)施例1相同。

該對(duì)比例得到的最終產(chǎn)物命名為C1，C1電泳結(jié)果如下：25kD、37kD、41kD、51kD、66kD、69kD、88kD、105kD、145kD、170kD、200kD；采用與測(cè)試?yán)嗤姆椒y(cè)試該產(chǎn)物C1抑制原代海馬細(xì)胞凋亡的活性、促進(jìn)海馬細(xì)胞之間突觸形成的活性，其結(jié)果如下：

實(shí)驗(yàn)組1的原代海馬細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到約850-980個(gè)/平方厘米，實(shí)驗(yàn)組2的約640-850個(gè)/平方厘米，和對(duì)照組的約350-550個(gè)/平方厘米。實(shí)驗(yàn)組1的突觸形成數(shù)量達(dá)到約75個(gè)/平方厘米，實(shí)驗(yàn)組2的約65個(gè)/平方厘米，對(duì)照組的約55個(gè)/平方厘米。

對(duì)比例2

除省略了步驟(4)冷乙醇沉淀步驟外，其他操作步驟與實(shí)施例1相同。

該對(duì)比例得到的最終產(chǎn)物命名為C2，C2電泳結(jié)果如下：12kD、25kD、37kD、41kD、51kD、66kD、69kD、88kD、105kD、145kD、170kD、200kD；采用與測(cè)試?yán)嗤姆椒y(cè)試該產(chǎn)物C2抑制原代海馬細(xì)胞凋亡的活性、促進(jìn)海馬細(xì)胞之間突觸形成的活性，其結(jié)果如下：

實(shí)驗(yàn)組1的原代海馬細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到約個(gè)/平方厘米，實(shí)驗(yàn)組2的約630-840個(gè)/平方厘米，和對(duì)照組的約650-840個(gè)/平方厘米。實(shí)驗(yàn)組1的突觸形成數(shù)量達(dá)到約79個(gè)/平方厘米，實(shí)驗(yàn)組2的約70個(gè)/平方厘米，對(duì)照組的約58個(gè)/平方厘米。

對(duì)比例3

除省略了步驟(5)和(6)以外，其他操作步驟與實(shí)施例1相同。

該對(duì)比例得到的最終產(chǎn)物命名為C3，C3電泳結(jié)果如下：25kD、37kD、41kD、51kD、66kD、69kD、88kD、105kD、145kD、170kD、200kD；采用與測(cè)試?yán)嗤姆椒y(cè)試該產(chǎn)物C3抑制原代海馬細(xì)胞凋亡的活性、促進(jìn)海馬細(xì)胞之間突觸形成的活性，其結(jié)果如下：

實(shí)驗(yàn)組1的原代海馬細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到約840-970個(gè)/平方厘米，實(shí)驗(yàn)組2的約650-840個(gè)/平方厘米，和對(duì)照組的約360-540個(gè)/平方厘米。實(shí)驗(yàn)組1的突觸形成數(shù)量達(dá)到約78個(gè)/平方厘米，實(shí)驗(yàn)組2的約66個(gè)/平方厘米，對(duì)照組的約58個(gè)/平方厘米。

對(duì)比例4

除省略了步驟(8)和(9)以外，其他操作步驟與實(shí)施例1相同。

該對(duì)比例得到的最終產(chǎn)物命名為C4，C4電泳結(jié)果如下：15kD、20kD、25kD、37kD、41kD、51kD、66kD、69kD、88kD、105kD、145kD、170kD、200kD；采用與測(cè)試?yán)嗤姆椒y(cè)試該產(chǎn)物C4抑制原代海馬細(xì)胞凋亡的活性、促進(jìn)海馬細(xì)胞之間突觸形成的活性，其結(jié)果如下：

實(shí)驗(yàn)組1的原代海馬細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到約830-950個(gè)/平方厘米，實(shí)驗(yàn)組2的約650-840個(gè)/平方厘米，和對(duì)照組的約380-600個(gè)/平方厘米。實(shí)驗(yàn)組1的突觸形成數(shù)量達(dá)到約78個(gè)/平方厘米，實(shí)驗(yàn)組2的約66個(gè)/平方厘米，對(duì)照組的約58個(gè)/平方厘米。

對(duì)比例5

除步驟(7)的陰離子交換步驟與實(shí)施例1不同以外，其他操作步驟與實(shí)施例1相同。步驟(7)的洗脫方式是梯度洗脫而不是步級(jí)洗脫，僅收集了一次洗脫液而沒(méi)有進(jìn)行多次分階段收集洗脫液。在本對(duì)比例中陰離子交換步驟如下：將離心分離產(chǎn)物200微升加到陰離子交換柱Source Q中，用含有500mM氯化鈉的Tris鹽酸緩沖液(200mM,pH8.0)進(jìn)行梯度洗脫，其中陰離子交換柱的填料為Q Sepharose(購(gòu)自GE Healthcare)，平均粒度為3微米，陰離子交換柱體積為25毫升，洗脫速度為4ml/min，上樣速度為3ml/ml；當(dāng)洗脫體積為35毫升時(shí)開(kāi)始收集洗脫液，當(dāng)洗脫體積為45毫升時(shí)停止收集洗脫液；收集到的該部分洗脫液，作為陰離子交換產(chǎn)物。

該對(duì)比例得到的最終產(chǎn)物命名為C5，C5電泳結(jié)果如下：41kD、51kD、66kD、69kD、88kD、105kD、145kD、170kD；采用與測(cè)試?yán)嗤姆椒y(cè)試該產(chǎn)物C5抑制原代海馬細(xì)胞凋亡的活性、促進(jìn)海馬細(xì)胞之間突觸形成的活性，其結(jié)果如下：

實(shí)驗(yàn)組1的原代海馬細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到約840-940個(gè)/平方厘米，實(shí)驗(yàn)組2的約650-840個(gè)/平方厘米，和對(duì)照組的約360-580個(gè)/平方厘米。實(shí)驗(yàn)組1的突觸形成數(shù)量達(dá)到約78個(gè)/平方厘米，實(shí)驗(yàn)組2的約66個(gè)/平方厘米，對(duì)照組的約56個(gè)/平方厘米。