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      一種提高記憶的從血漿分離的混合物及其制備方法和應(yīng)用與流程

      文檔序號:12046097閱讀:來源:國知局

      技術(shù)特征:

      1.一種提高記憶的從血漿分離的混合物,其特征在于:所述混合物的SDS-PAGE變性膠電泳至少包括11條肉眼清晰可見的條帶,分子量大小分別為:25kD、37kD、41kD、51kD、66kD、69kD、88kD、105kD、145kD、170kD、200kD。

      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述混合物,其特征在于:通過蛋白質(zhì)譜分析,所述混合物中至少含有106種蛋白;優(yōu)選地,所述混合物還包括與所述106種蛋白中任何一種蛋白結(jié)合的小分子;更優(yōu)選地,所述106種蛋白包括:

      14-3-3蛋白ζ/δ、14-3-3蛋白質(zhì)ε、40S核糖體蛋白S15、AP-4復(fù)合物亞基β-1、BPI折疊的家族B成員1、BPI折疊家族B成員2、DNA修復(fù)支架蛋白、Hemicentin-1的同種型2、HORMA結(jié)構(gòu)域蛋白2、Igλ鏈、LVV-血管肽-7、L-乳酸脫氫酶B鏈、MOB激酶活化劑1B、NAD(P)轉(zhuǎn)氫酶、Rho GDP-解離抑制劑2、SLIT-NTRK樣蛋白4、S-腺苷甲硫氨酸合酶、TNFSF4蛋白、α-2-HS-糖蛋白、β-2-糖蛋白1、γ-烯醇化酶、δLf乳轉(zhuǎn)鐵蛋白、玻連蛋白、博來霉素水解酶、補(bǔ)體C1q亞組分亞基C、補(bǔ)體C3、翅芽啟動因子同源物、觸珠蛋白、催乳素誘導(dǎo)蛋白、蛋白argonaute-3的同種型2、蛋白S100-A9、二甲基苯胺單加氧酶2、泛素-60S核糖體蛋白L40、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白、富酪蛋白、富唾液酸性脯氨酸磷蛋白1/2、肝細(xì)胞生長因子樣蛋白、谷氨酰胺γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶E、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P、谷胱甘肽過氧化物酶3、光蛋白聚糖、果糖二磷酸醛縮酶A、過位點(diǎn)蛋白2、過氧化物酶體膜蛋白PMP34、過氧物毒素2、核受體共活化劑1、琥珀酰-CoA連接酶亞基α、肌動蛋白-1、基本唾液富含脯氨酸蛋白2、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、鉀電壓門控離子通道、堿性肽IB-6、結(jié)合高鐵血紅蛋白、精氨基琥珀酸合酶、聚合免疫球蛋白受體、賴氨酸-tRNA連接酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸核糖甲?;拾彪攮h(huán)連接酶、磷酸性簇排序蛋白2、氯離子陰離子交換劑、酶原顆粒蛋白16同源物B、霉素、膜聯(lián)蛋白、腦酸可溶性蛋白1、凝血酶2、凝血因子XIII B鏈、蘋果酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶、前纖維蛋白同種型CRA_b、橋粒斑蛋白、橋粒芯糖蛋白-1、人源性激肽釋放酶結(jié)合蛋白、溶菌酶C、乳過氧化物酶、乳腺珠蛋白-B、色素上皮衍生因子、上池蛋白、腎囊素-3、視黃醇結(jié)合蛋白4、雙功能3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸合酶1、絲氨酸蛋白酶抑制劑B12、絲聚蛋白、髓過氧化物酶的同工型H14、胎球蛋白B、微管蛋白α-1A鏈、維生素D結(jié)合蛋白、烯醇化酶-磷酸酶E1的同種型2、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1、纖溶酶原、鋅-α-2-糖蛋白、鋅指蛋白DZIP1L的同種型2、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體、性激素結(jié)合球蛋白、血紅蛋白、血漿激肽釋放酶、血漿銅藍(lán)蛋白、血清鐵蛋白、血小板親和蛋白、血小板親和蛋白2的同種型1、原蛋白脂肪3、載脂蛋白A、粘蛋白-5B、脂籠蛋白1樣蛋白1、中性粒細(xì)胞防御素1、轉(zhuǎn)化生長因子β受體相關(guān)蛋白1、組織蛋白酶D。

      3.根據(jù)權(quán)利要求1所述混合物,其特征在于:所述血漿來源于哺乳動物;優(yōu)選地,所述血漿來源于人類。

      4.一種權(quán)利要求1-3任一所述混合物的制備方法,其特征在于:該制備方法依次包括以下步驟:血漿收集、低溫過濾、低溫超濾、冷乙醇沉淀、SD滅活、離心、陰離子交換、第一次濃縮、分子篩、透析、第二次濃縮步驟;優(yōu)選地,所述血漿收集和冷乙醇沉淀步驟之間還包括:低溫過濾和低溫超濾步驟。

      5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法,其特征在于:在所述血漿收集步驟中,利用抗凝管收集血液,再通過離心收集上清液,得到血漿;

      優(yōu)選地,所述離心中,離心力為500-1000g,時間為10-30分鐘,離心溫度為0-10℃。

      6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法,其特征在于:在所述低溫過濾步驟中,在壓力條件下將所述血漿進(jìn)行過濾,得到濾液;

      優(yōu)選地,濾膜的孔徑為不小于0.22微米,更優(yōu)選所述濾膜的孔徑為0.22微米和0.45微米;

      優(yōu)選地,所述過濾的溫度為0-5℃,壓力為1-20MPa。

      7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一所述的制備方法,其特征在于:在所述低溫超濾步驟中,將所述濾液通過施加壓力進(jìn)行膜包超濾,得到低溫超濾產(chǎn)物;

      優(yōu)選地,所述膜包截留分子量為3kD-10kD;

      優(yōu)選地,所述超濾的溫度為0-5℃,壓力為1-20MPa;

      優(yōu)選地,所述超濾使用的緩沖液為磷酸鹽緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液、HBS緩沖液中的一種;更優(yōu)選地,所述Tris-鹽酸緩沖液的濃度為0.2-250mM、pH值為7.0-9.2,所述磷酸緩沖液的濃度為1.0-450mM、pH值為6.0-9.2,所述HBS緩沖液的濃度為0.5-600mM、pH值為6.4-8.4;進(jìn)一步優(yōu)選地,所述緩沖液為濃度180mM、pH值為8.0的Tris-鹽酸緩沖液。

      8.根據(jù)權(quán)利要求4-7任一所述的制備方法,其特征在于:在所述冷乙醇沉淀步驟中,將所述低溫超濾產(chǎn)物或血漿與冷乙醇混合后靜置,取上清液,作為冷乙醇沉淀產(chǎn)物;

      優(yōu)選地,所述冷乙醇的溫度為0-10℃;

      優(yōu)選地,所述冷乙醇和所述低溫超濾產(chǎn)物或血漿的體積比為1:(4-8);

      優(yōu)選地,所述靜置溫度為0-6℃。

      9.根據(jù)權(quán)利要求4-8任一所述的制備方法,其特征在于:

      在所述SD滅活步驟中,將所述冷乙醇沉淀產(chǎn)物用濃SD滅活劑重新懸浮后靜置,得到滅活產(chǎn)物;優(yōu)選地,所述靜置溫度為4~37℃,時間為6~18小時;更優(yōu)選為所述靜置溫度為20℃,時間為12小時;優(yōu)選地,所述濃SD滅活劑含有0.6-4%的N-丁基三磷酸鹽、1-4%的吐溫。

      在所述離心分離步驟中,將所述滅活產(chǎn)物離心后保留上清液,得到離心分離產(chǎn)物;優(yōu)選地,所述離心中,離心力為2000-10000g,時間為10-20分鐘,溫度為0-8℃。

      10.根據(jù)權(quán)利要求4-9任一所述的制備方法,其特征在于:在所述陰離子交換步驟中,將所述離心分離產(chǎn)物加入陰離子交換柱中進(jìn)行步級洗脫,收集每次得到的洗脫液,混合后得到陰離子交換產(chǎn)物;

      優(yōu)選地,所述步級洗脫中,先用第一次洗脫緩沖液洗脫,得到第一次洗脫液;再用第二次洗脫液洗脫,得到廢液;再用第三次洗脫液洗脫,得到第三次洗脫液;合并所述第一次洗脫液和第三次洗脫液,得到陰離子交換產(chǎn)物;

      更優(yōu)選地,所述第一次洗脫液緩沖液中含有50-100mM的氯化鈉,所述第二次洗脫液緩沖液含有250-300mM的氯化鈉,所述第三次洗脫液緩沖液含有450-500mM的氯化鈉;更優(yōu)選地,所述第一次洗脫緩沖液、第二次洗脫緩沖液、第三次洗脫緩沖液均為濃度0.2-200mM、pH值7.0-9.2的Tris-鹽酸緩沖液。

      11.根據(jù)權(quán)利要求4-10任一所述的制備方法,其特征在于:所述第一次濃縮步驟中,將所述陰離子交換產(chǎn)物進(jìn)行濃縮,得到第一次濃縮產(chǎn)物;

      優(yōu)選地,所述陰離子交換產(chǎn)物的體積是所述濃縮產(chǎn)物的大于等于5倍,更優(yōu)選為5-500倍;更優(yōu)選地,所述第一次濃縮產(chǎn)物的體積為500微升-10毫升;

      優(yōu)選地,所述濃縮是采用濃縮管離心,所述濃縮管允許1.0-2.5KD的物質(zhì)通過,所述離心中,離心力為1000-3000g,溫度為2-8℃;

      優(yōu)選地,所述濃縮是采用濃縮杯加壓,所述濃縮杯允許1.0-2.5KD的物質(zhì)通過,所述加壓的壓力為1-15MPa。

      12.根據(jù)權(quán)利要求4-11任一所述的制備方法,其特征在于:所述分子篩步驟中,將所述第一次濃縮產(chǎn)物在分子篩中洗脫,得到分子篩產(chǎn)物;

      優(yōu)選地,所述洗脫的洗脫緩沖液中含有20-500mM的氯化鈉;

      優(yōu)選地,所述洗脫緩沖液為Tris-鹽酸緩沖液,其濃度為0.2-200mM,其pH值為7.0-9.2;更優(yōu)選地,所述洗脫緩沖液為Tris-鹽酸緩沖液,其濃度為20mM,其pH值為8;

      優(yōu)選地,開始收集洗脫液時的洗脫體積為15-35ml,停止收集洗脫液時的洗脫體積為40-85ml。

      13.根據(jù)權(quán)利要求4-12任一所述的制備方法,其特征在于:在所述透析步驟中,將所述分子篩產(chǎn)物進(jìn)行透析,收集透析容器中的產(chǎn)物得到透析產(chǎn)物;

      優(yōu)選地,所述透析使用的透析緩沖液為Tris-鹽酸緩沖液、磷酸緩沖液、HBS緩沖液中的一種;更優(yōu)選地,所述Tris-鹽酸緩沖液的濃度為0.2-250mM、pH值為7.0-9.2,所述磷酸緩沖液的濃度為1.0-450mM、pH值為6.0-9.2,所述HBS緩沖液的濃度為0.5-600mM、pH值為6.4-8.4;進(jìn)一步優(yōu)選地,所述透析緩沖液為1mM、pH值為8的Tris鹽酸緩沖液;

      優(yōu)選地,所述透析的時間為20-72h;

      優(yōu)選地,所述透析的體積比是1:(100-10000)。

      14.根據(jù)權(quán)利要求4-13任一所述的制備方法,其特征在于:在所述濃縮步驟中,將所述透析產(chǎn)物進(jìn)行第二次濃縮,得到第二次濃縮產(chǎn)物,即為所述混合物;

      優(yōu)選地,所述透析產(chǎn)物的體積是所述濃縮產(chǎn)物的大于等于20倍,更優(yōu)選為20-100倍;

      優(yōu)選地,所述濃縮是采用濃縮管離心,所述濃縮管允許1.0-2.5KD的物質(zhì)通過,所述離心中,離心力為1000-3000g;

      優(yōu)選地,所述濃縮是采用濃縮杯加壓,所述濃縮杯允許1.0-2.5KD的物質(zhì)通過,所述加壓的壓力為1-20MPa。

      15.一種藥物組合物,包含權(quán)利要求1-3任一所述的混合物和藥學(xué)上可接受的載體。

      16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的藥物組合物,其特征在于,所述藥學(xué)上可接受的載體為:藥學(xué)上可接受的緩沖液、蛋白質(zhì)、明膠、單糖、多糖、氨基酸、螯合劑、糖醇、聚乙二醇、以及表面活性劑中的一種或多種。

      17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的藥物組合物,其特征在于,所述藥物組合物包括如下組分:1倍體積的權(quán)利要求1-3任一所述的混合物,9倍體積的8.5wt%NaCl或1.5M、pH7.0的PBS;

      優(yōu)選地,所述藥物組合物中還包括白蛋白、葡萄糖以及谷氨酰胺;更優(yōu)選地,所述白蛋白在所述藥物組合物中的質(zhì)量體積百分比為2%,所述葡萄糖在所述藥物組合物中的質(zhì)量體積百分比為1%,所述谷氨酰胺在所述藥物組合物中的質(zhì)量體積百分比為3%。

      18.一種緩釋制劑,包含權(quán)利要求1-3任一所述的混合物或者權(quán)利要求15-17任一所述的藥物組合物、以及藥學(xué)上可接受的生物相容物質(zhì);優(yōu)選地,所述緩釋制劑的劑型為脂質(zhì)體、微球、水凝膠、微型滲透泵或微膠囊。

      19.一種試劑盒,包含權(quán)利要求1-3任一所述的混合物、權(quán)利要求15-17任一所述的藥物組合物,或權(quán)利要求18所述緩釋制劑。

      20.權(quán)利要求1-3任一所述的混合物、權(quán)利要求15-17任一所述的藥物組合物、權(quán)利要求18所述緩釋制劑、權(quán)利要求19所述試劑盒,在預(yù)防、改善或/和治療老年癡呆癥藥物中或在增強(qiáng)記憶力藥物中的應(yīng)用。

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