本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種復(fù)合疫苗佐劑，特別是能特異性增強(qiáng)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）滅活疫苗免疫刺激能力的復(fù)合疫苗佐劑。
背景技術(shù)：
：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)引起的以母豬流產(chǎn)和仔豬呼吸障礙為主要特征的病毒性傳染病,并可引起嚴(yán)重的免疫抑制。自從20世紀(jì)90年代以來，該病毒在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，成為全球規(guī)?；i場的主要疫病之一,也是全球豬病控制上的一大難題。PRRSV是單股正鏈有囊膜的RNA病毒，屬動脈炎病毒屬。病毒基因組大約有15Kb，編碼9個開放閱讀框，命名為ORF1a、1b、2a、2b和3-7。目前，PRRS在我國廣泛流行,由于缺乏有效的防治手段,該病在國內(nèi)愈演愈烈。2006年夏季,我國十多個省市的一些豬場暴發(fā)一種以高熱、高發(fā)病率和高死亡率為特征的傳染病,已經(jīng)證實(shí)其主要病原為在Nsp2上存在30個氨基酸不連續(xù)缺失的PRRSV變異株。經(jīng)典的病毒疫苗是分離病毒并通過致弱研制弱毒疫苗，或者通過病毒滅活并加入適當(dāng)佐劑研制滅活疫苗。但對PRRS來說，傳統(tǒng)的弱毒疫苗和滅活疫苗均不能產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)。為了研制更安全、高效的疫苗，中外學(xué)者開展了DNA、重組多肽和合成肽疫苗等一系列研究。DNA疫苗免疫后能夠產(chǎn)生抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，在減輕病毒血癥和呼吸道癥狀方面有一定作用，而重組多肽和合成肽疫苗效果較差。佐劑是疫苗的一種添加劑，當(dāng)它先于抗原或與抗原混合注入機(jī)體后，能夠增強(qiáng)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答或者改變免疫反應(yīng)的類型，屬于非特異性的免疫增強(qiáng)劑，而其本身無抗原性。理想的佐劑不僅能夠增強(qiáng)免疫反應(yīng)，而且能使機(jī)體獲得最佳的保護(hù)性，免疫。經(jīng)研究認(rèn)為，佐劑主要包括免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)、抗原遞呈、抗原靶向和儲存等幾種作用方式。通過以上幾種方式，達(dá)到的使用目的有:（1）增強(qiáng)抗原的呈遞，誘導(dǎo)細(xì)胞因子的釋放；（2）通過抗原遞送體系促進(jìn)胃腸黏膜對疫苗的吸收，使疫苗能夠黏膜接種；（3）陰性免疫調(diào)節(jié)，使機(jī)體持續(xù)產(chǎn)生抗體，從而降低抗原劑量，減少接種次數(shù)；（4）增強(qiáng)抗原的免疫原性，提高免疫應(yīng)答的速度以及耐受性；（5）提高疫苗在免疫應(yīng)答較弱者和免疫缺損者的免疫效力。國際上對于佐劑的分類尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)化學(xué)成分的不同可以分為鋁鹽佐劑、蛋白類佐劑、核酸類佐劑、含脂類佐劑和混合佐劑等幾類。利用佐劑提高PRRS疫苗免疫效果是目前的研究熱點(diǎn)。徐磊等人開展了短肽佐劑增強(qiáng)PRRSV弱毒疫苗免疫保護(hù)力的研究，結(jié)果表面，短肽佐劑配合CH-1R弱毒疫苗免疫可增強(qiáng)IFN-γ、IL-18介導(dǎo)的細(xì)胞免疫及IL-4介導(dǎo)的體液免疫、減輕攻毒后IFN-γ、IL-18介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和組織損傷,提高免疫保護(hù)力；在抵抗HP-PRRSVTJ-F5攻毒時,共同免疫組的免疫保護(hù)力明顯高于單獨(dú)免疫組。謝印乾等人開展了PRRS蜂膠佐劑滅活疫苗的免疫效力研究，研究表面，蜂膠佐劑可以更有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞,提高細(xì)胞免疫水平，免疫后IFN-γ含量明顯增多進(jìn)一步證明了其對機(jī)體非特異性免疫能力的增強(qiáng)作用，蜂膠佐劑滅活疫苗是一種值得普及推廣的新型疫苗，這為PRRS疫苗的研究提供了新的思路。朱善元等人（CN101940787A）將仙臺病毒囊膜（HVJ-E）與PRRSV滅活苗共同免疫PRRSV陰性豬，同時設(shè)PBS對照組及PRRSV滅活苗組，與對照組相比，HVJ-E與PRRSV滅活苗免疫組能顯著提高免疫豬的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。免疫后，用PRRSV強(qiáng)毒株(JXA1)進(jìn)行攻毒，結(jié)果表明，與對照組相比，HVJ-E與PRRSV滅活苗免疫組的臨床表現(xiàn)及體重增加均優(yōu)于對照組，且產(chǎn)生的病毒血癥率、排毒率及病毒分布率均明顯下降。目前,這些佐劑僅部分用于商用的弱毒疫苗、自家滅活疫苗、DNA疫苗合成肽和重組肽疫苗研究,但是只有一少部分佐劑能提高疫苗的保護(hù)效應(yīng)，目前在PRRSV疫苗免疫佐劑方面還有很大的發(fā)展空間。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有專用于豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的免疫佐劑種類少/效果不一的技術(shù)問題，本發(fā)明旨在提供一種復(fù)合免疫佐劑，所述復(fù)合免疫佐劑安全有效，能有效地增強(qiáng)PRRSV疫苗的免疫刺激能力，適用于豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的免疫預(yù)防。同時本發(fā)明還提供所述復(fù)合免疫佐劑的制備方法。為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種復(fù)合免疫佐劑，其特征在于，所述復(fù)合免疫佐劑由以下重量百分含量的組分組成：魚腥草多糖1.5-3.5%，丙氨酸0.2%-0.55%，銀杏葉黃酮0.8-2.2%，聚乙烯蓖麻油5-8%，Span805-8%，聚乙二醇2.5-5%，角鯊烯6-10%，注射用大豆油30-35%，注射用水35-50%，以上各組分的重量百分含量之和為100%。所述復(fù)合免疫佐劑的制備方法包括如下步驟：步驟一，按重量百分含量配比稱取各原料；步驟二，將稱取的魚腥草多糖和丙氨酸與注射用水混合，攪拌至其充分溶劑，得到水相；步驟三，將稱取的銀杏葉黃酮與角鯊烯、注射用大豆油混合，攪拌均勻，得到油相；步驟四，將稱取的聚乙烯蓖麻油、Span80與聚乙二醇混合，然后加入步驟三所制得的油相，在650-700rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌3-5min，得到均勻的油相混合物；步驟五，將步驟四制得的油相混合物在580-600rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌，邊攪拌邊以每分鐘150-180微升的速度的速度滴加步驟二所制得的水相，待形成澄清透明的納米乳后，改為每分鐘600-800微升繼續(xù)添加步驟二所制得的水相，直至水相全部滴加完成，即得到所述的復(fù)合免疫佐劑。所述魚腥草多糖是以干魚腥草為原料，采用如下工藝制備得到：干魚腥草原料→粉碎機(jī)粉碎→熱水浸提→離心、抽濾→濾液→真空濃縮至原有體積的1/8醇沉過夜→離心分離、洗滌→真空干燥→魚腥草多糖，具體工藝包括如下步驟：步驟一，取干魚腥草為原料，采用粉碎機(jī)將其粉碎至100-120目，得到魚腥草粉末；步驟二，將魚腥草粉末與65-70℃的溫水按照15：1-25：1的比例混合進(jìn)行熱水浸提，并保持提取溫度在65-70℃，以30-50rpm的速度攪拌提取2-2.5小時，得到魚腥草熱水浸提物；步驟三，將步驟二制得的魚腥草浸提物在3000-4500rpm的轉(zhuǎn)速下離心10min，去上清液進(jìn)行抽濾得到濾液，將濾液真空濃縮至原有體積的1/8，并加入濃縮液體積4倍的無水乙醇，置于0-4℃條件下靜置過夜，棄去漂浮物，而后在4000-5000rpm的轉(zhuǎn)速下離心分離10min，得到沉淀，而后采用95%的乙醇洗滌沉淀2次，真空干燥，即得到魚腥草多糖。所述銀杏葉黃酮可以購買市售的銀杏葉黃酮產(chǎn)品，也可采用如下方法制備得到：銀杏葉片粉末→以質(zhì)量體積比1：25加60%乙醇水溶液→搖勻后微波(中高火，680W)處理120s→60℃水浴浸提2小時→4000r/min離心15min→取上清液即得銀杏葉黃酮。優(yōu)選地，所述復(fù)合免疫佐劑由以下重量百分含量的組分組成：魚腥草多糖2.5%，丙氨酸0.2%，銀杏葉黃酮1.4%，聚乙烯蓖麻油7%，Span807%，聚乙二醇3.4%，角鯊烯8%，注射用大豆油32%，注射用水38.5%。優(yōu)選地，所述復(fù)合免疫佐劑由以下重量百分含量的組分組成：魚腥草多糖1.5%，丙氨酸0.55%，銀杏葉黃酮2.2%，聚乙烯蓖麻油5%，Span808%，聚乙二醇5%，角鯊烯6%，注射用大豆油34%，注射用水37.75%。優(yōu)選地，所述復(fù)合免疫佐劑由以下重量百分含量的組分組成：魚腥草多糖3.5%，丙氨酸0.25%，銀杏葉黃酮1.2%，聚乙烯蓖麻油8%，Span805%，聚乙二醇3%，角鯊烯10%，注射用大豆油30%，注射用水39.05%。本發(fā)明還請求保護(hù)本發(fā)明所述的復(fù)合免疫佐劑在制備豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）疫苗中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述疫苗為PRRSV病毒滅活疫苗或者PRRSV減毒活疫苗。本發(fā)明還請求保護(hù)一種豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）疫苗，其是由本發(fā)明所述的復(fù)合免疫佐劑與PRRSV滅活病毒組成?；谝陨霞夹g(shù)方案，本發(fā)明具備如下有益效果：本發(fā)明選取魚腥草多糖、丙氨酸和銀杏葉黃酮作為復(fù)合免疫佐劑的主要活性成分，且通過有效的提取方式獲得了純度較高的魚腥草多糖，其中魚腥草多糖獲取自魚腥草，魚腥草具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋的功效，魚腥草粗多糖具有強(qiáng)的抗補(bǔ)體活性，能夠有效地增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，在本發(fā)明中，其與銀杏葉黃酮和丙氨酸聯(lián)合使用，三者相輔相成，協(xié)同增效，有效地提高了機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，提高了免疫保護(hù)效果。本發(fā)明中通過大量的試驗(yàn)對于復(fù)合佐劑的制備工藝進(jìn)行了大量的優(yōu)化，最終確定出合適的制備工藝參數(shù)，通過本發(fā)明的方法能夠獲得粒徑均一性好、粒度分布集中的納米乳，其在肌肉注射過程中能夠有效地擴(kuò)散，降低肌肉注射帶來的不利影響?？偠灾?，本發(fā)明提供的復(fù)合免疫佐劑能夠顯著地提高動物的免疫應(yīng)答水平，增強(qiáng)動物的免疫保護(hù)效果，特別是有效提高PRRSV疫苗的免疫效果，其在豬相關(guān)疾病控制中具有重要的意義。說明書附圖說明圖1：魚腥草多糖凝膠色譜圖，峰1為魚腥草多糖凝膠色譜圖的主峰；峰2為溶液中存在的少量單糖成分形成的峰；峰3為溶劑峰。圖2：透射電鏡觀察結(jié)果：（A）實(shí)施例2復(fù)合佐劑透射電鏡觀察結(jié)果；（B）實(shí)施例5所記載的對照用復(fù)合佐劑A透射電鏡觀察結(jié)果。圖3：實(shí)施例2所制得的復(fù)合佐劑。圖4：復(fù)合佐劑肌肉注射局部解剖圖：（A）實(shí)施例2的復(fù)合佐劑注射2天；（B）實(shí)施例2的復(fù)合佐劑注射10天；（C）實(shí)施例5對照用的復(fù)合佐劑A注射2天；（D）實(shí)施例5對照用的復(fù)合佐劑A注射10天。具體實(shí)施方式：實(shí)施例1：（1）魚腥草多糖的制備魚腥草多糖是以干魚腥草為原料，采用如下工藝制備得到：干魚腥草原料→粉碎機(jī)粉碎→熱水浸提→離心、抽濾→濾液→真空濃縮至原有體積的1/8醇沉過夜→離心分離、洗滌→真空干燥→魚腥草多糖，具體工藝包括如下步驟：步驟一，取干魚腥草為原料，采用粉碎機(jī)將其粉碎至120目，得到魚腥草粉末；步驟二，將魚腥草粉末與68℃的溫水按照20：1的比例混合進(jìn)行熱水浸提，并保持提取溫度在68℃，以40rpm的速度攪拌提取2.5小時，得到魚腥草熱水浸提物；步驟三，將步驟二制得的魚腥草浸提物在4000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10min，去上清液進(jìn)行抽濾得到濾液，將濾液真空濃縮至原有體積的1/8，并加入濃縮液體積4倍的無水乙醇，置于0℃條件下靜置過夜，棄去漂浮物，而后在4500rpm的轉(zhuǎn)速下離心分離10min，得到沉淀，而后采用95%的乙醇洗滌沉淀2次，真空干燥，即得到魚腥草多糖。取魚腥草多糖溶解，配制成2mg/mL的多糖溶液，采用高效凝膠滲透色譜法對魚腥草多糖的均一性進(jìn)行鑒定，結(jié)果參見說明書附圖圖1，由圖1可知，該法獲得多糖分子質(zhì)量分布較為集中，有1個較大主峰。（2）銀杏葉黃酮的制備：銀杏葉片粉末→以質(zhì)量體積比1：25加60%乙醇水溶液→搖勻后微波(中高火，680W)處理120s→60℃水浴浸提2小時→4000r/min離心15min→取上清液即得銀杏葉黃酮。實(shí)施例2：一種復(fù)合免疫佐劑，由以下重量百分含量的組分組成：魚腥草多糖2.5%，丙氨酸0.2%，銀杏葉黃酮1.4%，聚乙烯蓖麻油7%，Span807%，聚乙二醇3.4%，角鯊烯8%，注射用大豆油32%，注射用水38.5%。所述復(fù)合免疫佐劑的制備方法包括如下步驟：步驟一，按重量百分含量配比稱取各原料；步驟二，將稱取的魚腥草多糖和丙氨酸與注射用水混合，攪拌至其充分溶劑，得到水相；步驟三，將稱取的銀杏葉黃酮與角鯊烯、注射用大豆油混合，攪拌均勻，得到油相；步驟四，將稱取的聚乙烯蓖麻油、Span80與聚乙二醇混合，然后加入步驟三所制得的油相，在680rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌4min，得到均勻的油相混合物；步驟五，將步驟四制得的油相混合物在590rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌，邊攪拌邊以每分鐘165微升的速度的速度滴加步驟二所制得的水相，待形成澄清透明的納米乳后，改為每分鐘700微升繼續(xù)添加步驟二所制得的水相，直至水相全部滴加完成，即得到所述的復(fù)合免疫佐劑。實(shí)施例3：一種復(fù)合免疫佐劑，由以下重量百分含量的組分組成：魚腥草多糖1.5%，丙氨酸0.55%，銀杏葉黃酮2.2%，聚乙烯蓖麻油5%，Span808%，聚乙二醇5%，角鯊烯6%，注射用大豆油34%，注射用水37.75%。所述復(fù)合免疫佐劑的制備方法包括如下步驟：步驟一，按重量百分含量配比稱取各原料；步驟二，將稱取的魚腥草多糖和丙氨酸與注射用水混合，攪拌至其充分溶劑，得到水相；步驟三，將稱取的銀杏葉黃酮與角鯊烯、注射用大豆油混合，攪拌均勻，得到油相；步驟四，將稱取的聚乙烯蓖麻油、Span80與聚乙二醇混合，然后加入步驟三所制得的油相，在650rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌5min，得到均勻的油相混合物；步驟五，將步驟四制得的油相混合物在580rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌，邊攪拌邊以每分鐘150微升的速度的速度滴加步驟二所制得的水相，待形成澄清透明的納米乳后，改為每分鐘800微升繼續(xù)添加步驟二所制得的水相，直至水相全部滴加完成，即得到所述的復(fù)合免疫佐劑。實(shí)施例4：一種復(fù)合免疫佐劑，由以下重量百分含量的組分組成：魚腥草多糖3.5%，丙氨酸0.25%，銀杏葉黃酮1.2%，聚乙烯蓖麻油8%，Span805%，聚乙二醇3%，角鯊烯10%，注射用大豆油30%，注射用水39.05%。所述復(fù)合免疫佐劑的制備方法包括如下步驟：步驟一，按重量百分含量配比稱取各原料；步驟二，將稱取的魚腥草多糖和丙氨酸與注射用水混合，攪拌至其充分溶劑，得到水相；步驟三，將稱取的銀杏葉黃酮與角鯊烯、注射用大豆油混合，攪拌均勻，得到油相；步驟四，將稱取的聚乙烯蓖麻油、Span80與聚乙二醇混合，然后加入步驟三所制得的油相，在700rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌3min，得到均勻的油相混合物；步驟五，將步驟四制得的油相混合物在600rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌，邊攪拌邊以每分鐘180微升的速度的速度滴加步驟二所制得的水相，待形成澄清透明的納米乳后，改為每分鐘600微升繼續(xù)添加步驟二所制得的水相，直至水相全部滴加完成，即得到所述的復(fù)合免疫佐劑。實(shí)施例5：以實(shí)施例2為比較對象，設(shè)計以下對照試驗(yàn)以驗(yàn)證組成及制備方法等對于復(fù)合佐劑的影響：對照用復(fù)合免疫佐劑A，由以下重量百分含量的組分組成：魚腥草多糖2.5%，丙氨酸0.2%，銀杏葉黃酮1.4%，聚乙烯蓖麻油7%，Span807%，聚乙二醇3.4%，角鯊烯5%，注射用大豆油32%，注射用水41.5%。所述復(fù)合免疫佐劑的制備方法包括如下步驟：步驟一，按重量百分含量配比稱取各原料；步驟二，將稱取的魚腥草多糖和丙氨酸與注射用水混合，攪拌至其充分溶劑，得到水相；步驟三，將稱取的銀杏葉黃酮與角鯊烯、注射用大豆油混合，攪拌均勻，得到油相；步驟四，將稱取的聚乙烯蓖麻油、Span80與聚乙二醇混合，然后加入步驟三所制得的油相，在680rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌4min，得到均勻的油相混合物；步驟五，將步驟四制得的油相混合物在400rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌，邊攪拌邊以每分鐘220微升的速度的速度滴加步驟二所制得的水相，待形成澄清透明的納米乳后，繼續(xù)以每分鐘220微升繼續(xù)添加步驟二所制得的水相，直至水相全部滴加完成，即得到所述的對照用復(fù)合免疫佐劑A。透射電鏡結(jié)果顯示，實(shí)施例2所制得的復(fù)合佐劑為納米乳液，其納米乳的液滴呈球形，液滴大小均勻，分散性良好，見圖2-A。粒度分析結(jié)果表明，復(fù)合蜂膠納米乳平均粒徑為13.25納米；液滴大小均勻，PDI為0.176；粒徑分布范圍窄，基本呈正態(tài)分布。對照用復(fù)合免疫佐劑A所制得的復(fù)合佐劑也為納米乳液，其納米乳的液滴呈橢球形，液滴大小均勻性較差，分散性一般，見圖2-B。粒度分析結(jié)果表明，復(fù)合蜂膠納米乳平均粒徑為14.52納米；液滴大小均勻，PDI為0.325；粒徑分布范圍較寬，說明制備得到的粒子粒徑存在一定的差異。由以上透射電鏡結(jié)果可知，實(shí)施例2的方法所制得的復(fù)合佐劑的納米乳粒子粒徑更加均勻，且粒徑分布更加集中。另外，分別對實(shí)施例2的疫苗佐劑以及對照組復(fù)合佐劑A進(jìn)行了肌肉刺激性試驗(yàn)，分別以家兔作為注射對象，分別采用實(shí)施例2、對照組復(fù)合佐劑A對家兔進(jìn)行肌肉注射，觀察2天和10天后注射部位的情況，具體結(jié)果參見圖4。其中（A）和（B）分別為實(shí)施例2的復(fù)合佐劑注射2天和10天后的情況，注射部位未見腫脹、鼓包等炎癥反應(yīng)，肌肉顏色正常，無充血，水腫，變性壞死等現(xiàn)象；圖（C）和（D）為對照組復(fù)合佐劑A注射2天和10天后的情況，在注射2天后，注射部位出現(xiàn)小范圍腫脹，當(dāng)其為10天時，注射部位出現(xiàn)較大的鼓包，采用針尖刺激鼓包部位，出現(xiàn)小范圍的輕微出血斑，經(jīng)多次充分試驗(yàn)，均表現(xiàn)出鼓包癥狀?？梢?，采用實(shí)施例2所述方法制備復(fù)合免疫佐劑明顯優(yōu)于對照用復(fù)合佐劑A，其對于肌肉基本無刺激，適合作為肌肉注射用免疫佐劑。實(shí)施例6：毒性試驗(yàn)：分別對實(shí)施例1-3的復(fù)合佐劑進(jìn)行了以下安全性實(shí)驗(yàn)：（1）急性毒性試驗(yàn)按照最大注射劑量的2倍灌胃后28d內(nèi)，20只實(shí)驗(yàn)小鼠均正常存活，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，也沒有出現(xiàn)中毒現(xiàn)象。觀察期間小鼠進(jìn)食量、被毛、體重均正常，與空白對照小鼠無差異，表明該復(fù)方佐劑經(jīng)口實(shí)際無毒。（2）肌肉刺激性試驗(yàn)剖檢部位試驗(yàn)組與對照組無明顯區(qū)別，局部無充血、水腫、變性或壞死等現(xiàn)象，表明本發(fā)明的復(fù)合佐劑無肌肉刺激性。（3）細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)不同濃度的復(fù)合佐劑稀釋液對培養(yǎng)的ST豬睪丸細(xì)胞形態(tài)有不同程度的影響。當(dāng)復(fù)合佐劑采用MEN培養(yǎng)液稀釋500倍以上時，與正常組相比，ST豬睪丸細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)目及生長狀態(tài)，無明顯變化，對細(xì)胞的生長無顯著影響，以上結(jié)果表明本發(fā)明的佐劑無細(xì)胞毒性。實(shí)施例7：PRRS疫苗的制備（1）高致病性PRRSV-GD株病毒抗原的制備高致病性PRRSV-GD株的制備：高致病性PRRSV-GD株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心贈送，將毒種用MEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司)作10倍稀釋，按5％體積接種于MARC-145細(xì)胞培養(yǎng)，37℃吸附30分鐘，加入含4％犢牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的MEM細(xì)胞維持液，37℃培養(yǎng)4日，凍融2～3次，收獲病毒，病毒滴度為107.2TCID50/ml；而后將病毒液用孔徑0.22μm的中空纖維濾柱過濾，除去細(xì)胞碎片。向?yàn)V過的病毒液中加入甲醛溶液，滅活，使甲醛溶液的終濃度為0.2％(V/V)，隨即充分搖勻升溫，當(dāng)溫度升至37℃時開始計時，保持18小時滅活完畢，加入0.2％(w/v)的焦亞硫酸鈉終止滅活，置2～8℃保存，即得到高致病性PRRSV-GD株病毒抗原溶液。（2）含本發(fā)明的復(fù)合疫苗佐劑的PRRS疫苗組合物的制備：將以上制備得到的高致病性PRRSV-GD株病毒抗原溶液與本發(fā)明的復(fù)合免疫佐劑按照1：1.25的比例混合，在120-150rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌均勻，即得到PRRS疫苗組合物。具體參加下表1：表1PRRS疫苗組合物組成疫苗PRRSV病毒抗原溶液佐劑種類（用量均為12.5mL）疫苗110mL生理鹽水疫苗210mL實(shí)施例2復(fù)合免疫佐劑疫苗310mL實(shí)施例3復(fù)合免疫佐劑疫苗410mL實(shí)施例4復(fù)合免疫佐劑疫苗510mL對照復(fù)合佐劑B疫苗610mL對照復(fù)合佐劑C疫苗710mL對照復(fù)合佐劑D疫苗810mL對照復(fù)合佐劑E疫苗910mL對照復(fù)合佐劑F疫苗1010mL對照復(fù)合佐劑G疫苗1110mL實(shí)施例5對照復(fù)合佐劑A以上試驗(yàn)所涉及的對照復(fù)合佐劑B-G組成如下表2：表2復(fù)合免疫佐劑組成表實(shí)施例2佐劑B佐劑C佐劑D佐劑E佐劑F佐劑F魚腥草多糖2.5%2.5%--2.5%2.5%-丙氨酸0.2%-0.2%-0.2%-0.2%銀杏葉黃酮1.4%--1.4%-1.4%1.4%聚乙烯蓖麻油7%7%7%7%7%7%7%Span807%7%7%7%7%7%7%聚乙二醇3.4%3.4%3.4%3.4%3.4%3.4%3.4%角鯊烯8%8%8%8%8%8%8%注射用大豆油32%33.4%33.4%32%33.4%32%32%注射用水38.5%38.7%41%41.2%38.5%38.7%41%實(shí)施例8：免疫試驗(yàn)14日齡仔豬220頭隨機(jī)分成1-11組,每組20頭，分別采用實(shí)施例7表1中的疫苗1-11進(jìn)行免疫處理，于14日齡和28日齡頸部肌肉注射疫苗1mL/頭，第二次免疫接種14日后，分離血清用豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測試劑盒(ELISA)檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體水平，檢測所用試劑盒為美國IDEXX生產(chǎn)的豬繁殖與呼吸綜合征抗體ELISA試劑盒，具體檢測方法時，依據(jù)試劑盒產(chǎn)品說明書，采用豬藍(lán)耳病病毒N蛋白的基因工程表達(dá)產(chǎn)物包被微孔板。在試驗(yàn)中，加入稀釋的對照血清和待檢血清，經(jīng)溫育后，若樣品中含有豬藍(lán)耳病N蛋白的特異性抗體，則將與包被板上的抗原結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后；再加入酶標(biāo)二抗，與包被板上抗原抗體復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合：再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合酶結(jié)合物，在孔中加入TMB底物液，與酶反應(yīng)形成藍(lán)色產(chǎn)物，加入HF溶液終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀630nm波長測定各反應(yīng)孔中的OD值。判定標(biāo)準(zhǔn)為：樣品OD630nm值＞0.42，判為陽性；樣品OD630nm值介于0.387～0.42之間，判為可疑；樣品OD630nm值＜0.38，判為陰性。具體檢測結(jié)果見下表3：表3免疫試驗(yàn)結(jié)果由以上試驗(yàn)結(jié)果可知，疫苗2（本發(fā)明實(shí)施例2）的疫苗組合物具有最佳的免疫效果，接種面以后，平均抗體效價達(dá)到1：1250，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生理鹽水組，也顯著優(yōu)于疫苗5-11；其次，疫苗3、4（本發(fā)明實(shí)施例3、4）的疫苗組合物的免疫效果也優(yōu)于疫苗1、5-11的疫苗組合物接種后的免疫效果，且本發(fā)明實(shí)施例2-4的復(fù)合免疫佐劑與抗原結(jié)合后能夠顯著提高血清中的抗體水平，其OD630nm值＞1.2的比例能夠達(dá)到80-90%，即免疫接種后強(qiáng)陽性的水平較高，特別時OD630nm值＞1.8的陽性比例明顯高于其他組。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的組合物中，魚腥草多糖、丙氨酸和銀杏葉黃酮之間存在較強(qiáng)的協(xié)同增效作用，三者共同作用的效果明顯好于單獨(dú)運(yùn)用或者兩者組合，并且本發(fā)明的制備方法對于疫苗的免疫效果也具有較大的影響。另外，為了進(jìn)一步研究免疫佐劑的功效，本發(fā)明還對免疫后不同時期的抗體效價進(jìn)行了動態(tài)檢測，以下選取疫苗2、5、7、9、10的試驗(yàn)動物的血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行展示。具體結(jié)果見下表4：表4免疫后不同時期血清抗體效價由以上表4的結(jié)果可以看出，本發(fā)明的復(fù)合免疫佐劑所制得的疫苗組合物具有免疫后抗體效價高，免疫反應(yīng)快，抗體增長快的技術(shù)效果。實(shí)施例9：攻毒保護(hù)對于以上試驗(yàn)所用的動物，選取疫苗2、5、7、9、10的試驗(yàn)動物進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，采用高致病性PRRSV-GD感染豬的體液作為感染源，分別對試驗(yàn)動物進(jìn)行注射，而后，觀察試驗(yàn)動物的發(fā)病情況和死亡情況，具體結(jié)果見下表5：表5攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果組別發(fā)病率死亡率疫苗210%0%疫苗520%5%疫苗730%10%疫苗930%10%疫苗1025%10%由于動物數(shù)量的局限，其不能很好地反應(yīng)統(tǒng)計學(xué)意義上的攻毒保護(hù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，但是，通過本發(fā)明的試驗(yàn)結(jié)果可知，采用本發(fā)明實(shí)施例2佐劑所制備的疫苗組合物的發(fā)病率要低于其他對照組的疫苗組合物，且死亡率要低于其他組別，死亡動物數(shù)量為0，這也在一定程度上反應(yīng)了本發(fā)明的疫苗組合物能夠有效地提供免疫保護(hù)。當(dāng)前第1頁1 2 3