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      上面部紋的治療的制作方法

      文檔序號:40280031發(fā)布日期:2024-12-11 13:18閱讀:19來源:國知局
      上面部紋的治療的制作方法

      發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及美容治療(例如用于治療功能亢進面部紋)。更詳細地,本發(fā)明提供美容治療方法,包括施用長效神經(jīng)毒素,更具體地說,涉及使用長效肉毒桿菌毒素治療美容缺陷的方法。發(fā)明背景功能亢進面部紋是常見的美學(xué)缺陷,包括但不限于:眉間紋、外眥紋、額頭紋和皺紋、魚尾紋、眉間紋、鼻唇溝、唇紋和木偶紋。上部面部紋可出現(xiàn)在額頭、眉間和眶外側(cè)區(qū)域。皺眉表情也可能導(dǎo)致眉間和額頭區(qū)域出現(xiàn)皺紋,而微笑表情也可能導(dǎo)致外眥區(qū)域出現(xiàn)皺紋。該區(qū)域過于明顯的紋常常被誤解為疲勞,導(dǎo)致患者對其外表感到非??鄲馈J聦嵣?,過于明顯的面部紋是由于底層肌肉的功能性拉動而出現(xiàn)的,最終會導(dǎo)致皮膚起皺。在眉間復(fù)合體中,這些肌肉包括皺眉肌、降眉間肌和降眉肌,而眼輪匝肌負責(zé)產(chǎn)生外眥紋。在過去的幾十年里,隨著老齡人口的不斷增長,人們對美容手術(shù)的需求也越來越大,以扭轉(zhuǎn)衰老的面容,尤其是面部。人們對外表的日益關(guān)注導(dǎo)致了許多不同產(chǎn)品和程序的開發(fā),例如手術(shù)、各種類型的表面重修和使用填充劑。由于這些方法都不是完全沒有風(fēng)險的,因此需要持續(xù)研究以提供最安全、最有效的面部衰老治療方法。雖然有五個因素相互作用,導(dǎo)致面部衰老,但主要有兩個因素(皮膚和底層肌肉)相互作用,導(dǎo)致更明顯的細紋和褶皺,而不是皺紋。許多療法已經(jīng)發(fā)展到治療皺紋和治療紋和褶皺的皮膚因素,其中包括各種類型的表面重修、皮膚科產(chǎn)品和用于軟組織增強的注射。治療面部紋的另一種美容方法是向面部皮膚的底層肌肉施用神經(jīng)毒素,特別是肉毒梭菌神經(jīng)毒素。是一種含有從a型肉毒梭菌菌株(clostridium?botulinumtype?a?strain)中分離和純化的藥物bont/a血凝素復(fù)合物(btx-a-hac)的藥用產(chǎn)品。市場上還有幾種由肉毒梭菌自然產(chǎn)生的其他藥用bont/a產(chǎn)品。bont/a選擇性抑制突觸前神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿,從而阻斷神經(jīng)肌肉接頭處的膽堿能傳遞,導(dǎo)致肌肉收縮降低和肌肉張力降低,使注射的肌肉放松。獲批用于治療眉間紋,最大總劑量可達50單位,可在皺眉肌肌肉和降眉間肌肌肉上注射(見圖1)。dysport的臨床效果可持續(xù)長達四個月。臨床研究表明,重復(fù)給藥最多四次仍能保持療效。但是,dysport的施用頻率不應(yīng)超過每三個月一次。到目前為止,dysport尚未獲得fda批準用于治療額頭紋和外眥紋。為了避免全身神經(jīng)系統(tǒng)影響,許多基于梭菌毒素的美容治療利用梭菌毒素治療劑直接施用到給定靶位點(例如靶組織)。以這種方式施用基于梭菌毒素的治療劑時的一個問題是毒素會從施用位點擴散到周圍組織或全身循環(huán)中。毒素從目標組織擴散被認為是導(dǎo)致不良副作用的原因,在極端情況下可能會危及生命。當以高劑量、高濃度和高注射體積使用梭菌毒素治療劑(例如bont治療劑)時,這可能是一個特別令人擔憂的問題。據(jù)報道,與此問題相關(guān)的商業(yè)bont/a治療劑的不良反應(yīng)包括乏力、全身肌肉無力、復(fù)視、眼瞼下垂、吞咽困難、發(fā)聲困難、構(gòu)音障礙、尿失禁和呼吸困難。吞咽和呼吸困難可能危及生命,并且有報道稱毒素擴散會導(dǎo)致死亡。本發(fā)明克服了上述一個或多個問題。


      背景技術(shù):


      技術(shù)實現(xiàn)思路

      1、本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn),修飾的bont/a在面部紋的美容治療中具有特別的用途。修飾的bont/a可以包括bont/a輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域),這導(dǎo)致修飾的bont/a表現(xiàn)出在施用位點增加的保留(減少從施用位點的擴散)和增加的作用持續(xù)時間(例如6-9個月)。有利的是,修飾的bont/a具有與未修飾的bont/a(例如)相比改進的安全性。這種改進的安全性可以通過本文描述的修飾的bont/a的高安全比(safety?ratio)來表示。修飾的bont/a可以包括一個或多個表面暴露氨基酸殘基的修飾,從而導(dǎo)致凈正電荷增加。增加的電荷促進多肽與陰離子細胞外成分之間的靜電相互作用,從而促進多肽與細胞表面之間的結(jié)合。反過來,這會在施用位點增加藥物的保留(減少從施用位點的擴散),從而延長作用時間(例如6-9個月)。

      2、基于本文的臨床前數(shù)據(jù)(參見實施例11),已顯示可以向受試者施用更高的總量的修飾bont/a,同時在如此高的劑量下實現(xiàn)與未修飾bont/a(例如)相似的安全性。因此,在達到最大總劑量之前,修飾bont/a可以在面部紋的美容治療中注射到更多的肌肉/位點。這是一個重要且有利的發(fā)現(xiàn),并且產(chǎn)生了改進的面部紋美容治療,同時為臨床醫(yī)生提供了更廣泛的治療選擇。治療可以得到改進,因為與使用未修飾bont/a(例如)的治療相比,它提供更持久的治療(導(dǎo)致給藥頻率較低)和/或能夠針對受試者進行定制,例如,使臨床醫(yī)生能夠根據(jù)受試者的審美要求在特定位點施用。與常規(guī)治療方案相比,本發(fā)明的治療得到了改進。

      3、此外,本發(fā)明提供了方便、安全且有效的單劑量單位以及可在單次治療中安全施用的總(最大)劑量。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的指導(dǎo),指導(dǎo)所述劑量單位可施用到肌肉的次數(shù)(包括每塊肌肉的注射位點數(shù)),而不會對患者產(chǎn)生毒性。因此,根據(jù)本發(fā)明的治療對于臨床醫(yī)生來說要簡單得多,并且有助于避免劑量不足和/或劑量過量。

      4、
      技術(shù)實現(xiàn)要素:

      5、

      6、在一個方面,本發(fā)明提供了修飾的bont/a,其用于治療面部紋(例如,持續(xù)時間比未修飾的bont/a(例如,seq?id?no:2)治療的持續(xù)時間更長),其中修飾的bont/a通過肌肉內(nèi)注射施用在受試者面部的多個位點,

      7、其中修飾的bont/a以每個位點大于73單位修飾的bont/a的單位劑量施用,并且其中1單位是對應(yīng)于小鼠的計算半數(shù)致死量(ld50)的修飾的bont/a的量,

      8、其中,多個位點選自:

      9、皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點,用于治療眉間紋,

      10、額肌肌肉的最多五個位點,用于治療額頭紋;和

      11、眼輪匝肌肌肉的最多三個位點,用于治療外眥紋(例如,眼輪匝肌肌肉外部的最多三個位點,用于治療外眥紋),

      12、其中治療期間施用的修飾的bont/a的總劑量高達3,661單位,并且

      13、其中修飾的bont/a包括bont/a輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域,以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)。

      14、還提供了相應(yīng)(在制造藥物中)的用途和治療面部紋的方法。

      15、在相關(guān)方面,本發(fā)明提供了一種治療面部紋的方法(例如,持續(xù)時間比未修飾的bont/a(例如,seq?id?no:2)治療的持續(xù)時間更長),該方法包括通過肌肉內(nèi)注射將修飾的肉毒桿菌神經(jīng)毒素a(bont/a)施用到受試者面部的多個位點,

      16、其中修飾的bont/a以每個位點大于73單位修飾的bont/a的單位劑量施用,并且其中1單位是對應(yīng)于小鼠的計算半數(shù)致死量(ld50)的修飾的bont/a的量,

      17、其中,多個位點選自:

      18、皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點,用于治療眉間紋,

      19、額肌肌肉的最多五個位點,用于治療額頭紋;和

      20、眼輪匝肌肌肉的最多三個位點,用于治療外眥紋(例如,眼輪匝肌外部的最多三個位點,用于治療外眥紋),

      21、其中治療期間施用的修飾的bont/a的總劑量高達3,661單位,并且

      22、其中修飾的bont/a包括bont/a輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域,以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)。

      23、在另一個相關(guān)方面,本發(fā)明提供了修飾的肉毒桿菌神經(jīng)毒素a(bont/a)在制造用于治療面部紋的藥物中的用途(例如,持續(xù)時間比未修飾的bont/a(例如,seq?id?no:2)治療的持續(xù)時間更長),其中修飾的bont/a通過肌肉內(nèi)注射施用到受試者面部的多個位點,

      24、其中修飾的bont/a以每個位點大于73單位修飾的bont/a的單位劑量施用,并且其中1單位是對應(yīng)于小鼠的計算半數(shù)致死量(ld50)的修飾的bont/a的量,

      25、其中,多個位點選自:

      26、皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點,用于治療眉間紋,

      27、額肌肌肉的最多五個位點,用于治療額頭紋;和

      28、眼輪匝肌肌肉的最多三個位點,用于治療外眥紋(例如,眼輪匝肌外部的最多三個位點,用于治療外眥紋),

      29、其中治療期間施用的修飾的bont/a的總劑量高達3,661單位,并且

      30、其中修飾的bont/a包括bont/a輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域,以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)。

      31、在一個方面,本發(fā)明提供了用于治療面部紋的修飾的bont/a(例如,持續(xù)時間比未修飾的bont/a(例如,seq?id?no:2)治療的持續(xù)時間更長),其中修飾的bont/a通過肌肉內(nèi)注射施用到受試者面部的多個位點,

      32、其中修飾的bont/a以每個位點大于73單位修飾的bont/a的單位劑量施用,并且其中1單位是對應(yīng)于小鼠的計算半數(shù)致死量(ld50)的修飾的bont/a的量,

      33、其中,多個位點選自:

      34、皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點,用于治療眉間紋,

      35、額肌肌肉的最多五個位點,用于治療額頭紋;和

      36、眼輪匝肌肌肉的最多三個位點,用于治療外眥紋(例如,眼輪匝肌外部的最多三個位點,用于治療外眥紋),

      37、優(yōu)選地,其中多個位點包括最多皺眉肌肌肉的兩個位點和降眉間肌肌肉的一個位點(或由其組成),用于治療眉間紋,

      38、其中治療期間施用的修飾的bont/a的總劑量高達1144單位(例如高達1019單位),并且

      39、其中修飾的bont/a包括bont/a輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域,以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)。

      40、在相關(guān)方面,本發(fā)明提供了一種治療面部紋的方法(例如,持續(xù)時間比未修飾的bont/a(例如,seq?id?no:2)治療的持續(xù)時間更長),該方法包括通過肌肉內(nèi)注射將修飾的肉毒桿菌神經(jīng)毒素a(bont/a)施用到受試者面部的多個位置,

      41、其中修飾的bont/a以每個位點大于73單位修飾的bont/a的單位劑量施用,并且其中1單位是對應(yīng)于小鼠的計算半數(shù)致死量(ld50)的修飾的bont/a的量,

      42、其中,多個位點選自:

      43、皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點,用于治療眉間紋,

      44、額肌肌肉的最多五個位點,用于治療額頭紋;和

      45、眼輪匝肌肌肉的最多三個位點,用于治療外眥紋(例如,眼輪匝肌外部的最多三個位點,用于治療外眥紋),

      46、優(yōu)選地,其中多個位點包括皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點(或由其組成),用于治療眉間紋,

      47、其中治療期間施用的修飾bont/a的總劑量高達1144單位(例如高達1019單位),并且

      48、其中修飾的bont/a包括bont/a輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域,以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)。

      49、在另一個相關(guān)方面,本發(fā)明提供了修飾的肉毒桿菌神經(jīng)毒素a(bont/a)在制造用于治療面部紋的藥物中的用途(例如,持續(xù)時間比未修飾的bont/a(例如,seq?id?no:2)治療的持續(xù)時間更長),其中修飾的bont/a通過肌肉內(nèi)注射施用到受試者面部的多個位點,

      50、其中修飾的bont/a以每個位點大于73單位修飾的bont/a的單位劑量施用,并且其中1單位是對應(yīng)于小鼠的計算半數(shù)致死量(ld50)的修飾的bont/a的量,

      51、其中,多個位點選自:

      52、皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點,用于治療眉間紋,

      53、額肌肌肉的最多五個位點,用于治療額頭紋;和

      54、眼輪匝肌肌肉的最多三個位點,用于治療外眥紋(例如,眼輪匝肌外部的最多三個位點,用于治療外眥紋),

      55、優(yōu)選地,其中多個位點包括皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點(或由其組成),用于治療眉間紋,

      56、其中治療期間施用的修飾的bont/a的總劑量高達1144單位(例如高達1019單位),并且

      57、其中修飾的bont/a包括bont/a輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域,以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)。

      58、在另一方面,本發(fā)明提供了用于治療面部紋的修飾的bont/a(例如,持續(xù)時間比未修飾的bont/a(例如,seq?id?no:2)治療的持續(xù)時間更長),其中修飾的bont/a通過肌肉內(nèi)注射施用到受試者面部的多個位點,

      59、其中修飾的bont/a以每個位點大于1754pg(例如大于1800pg)修飾的bont/a的單位劑量施用,

      60、其中,多個位點選自:

      61、皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點,用于治療眉間紋,

      62、額肌肌肉的最多五個位點,用于治療額頭紋;和

      63、眼輪匝肌肌肉的最多三個位點,用于治療外眥紋(例如,眼輪匝肌外部的最多三個位點,用于治療外眥紋),

      64、其中治療期間施用的修飾的bont/a的總劑量高達88,000(例如高達80,000pg),并且

      65、其中修飾的bont/a包括bont/a輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域,以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)。

      66、在相關(guān)方面,本發(fā)明提供了一種治療面部紋的方法(例如,持續(xù)時間比未修飾的bont/a(例如,seq?id?no:2)治療的持續(xù)時間更長),該方法包括通過肌肉內(nèi)注射將修飾的肉毒桿菌神經(jīng)毒素a(bont/a)施用到受試者面部的多個位點,

      67、其中修飾的bont/a以每個位點大于1754pg(例如大于1800pg)修飾的bont/a的單位劑量施用,

      68、其中,多個位點選自:

      69、皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點,用于治療眉間紋,

      70、額肌肌肉的最多五個位點,用于治療額頭紋;和

      71、眼輪匝肌肌肉的最多三個位點,用于治療外眥紋(例如,眼輪匝肌外部的最多三個位點,用于治療外眥紋),

      72、其中治療期間施用的修飾的bont/a的總劑量高達88,000(例如高達80,000pg),并且

      73、其中修飾的bont/a包括bont/a輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域,以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)。

      74、在另一個相關(guān)方面,本發(fā)明提供了修飾的肉毒桿菌神經(jīng)毒素a(bont/a)在制造用于治療面部紋的藥物中的用途(例如,持續(xù)時間比未修飾的bont/a(例如,seq?id?no:2)治療的持續(xù)時間更長),其中修飾的bont/a通過肌肉內(nèi)注射施用到受試者面部的多個位點,

      75、其中修飾bont/a以每個位點大于1754pg(優(yōu)選大于1800pg,更優(yōu)選大于2555pg)修飾的bont/a的單位劑量施用,

      76、其中,多個位點選自:

      77、皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點,用于治療眉間紋,

      78、額肌肌肉的最多五個位點,用于治療額頭紋;和

      79、眼輪匝肌肌肉的最多三個位點,用于治療外眥紋(例如,眼輪匝肌外部的最多三個位點,用于治療外眥紋),

      80、其中治療期間施用的修飾的bont/a的總劑量高達88,000(例如高達80,000pg),并且

      81、其中修飾的bont/a包括bont/a輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域,以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)。

      82、在另一方面,本發(fā)明提供了用于治療面部紋的修飾的bont/a(例如,持續(xù)時間比未修飾的bont/a(例如,seq?id?no:2)治療的持續(xù)時間更長),其中修飾的bont/a通過肌肉內(nèi)注射施用到受試者面部的多個位點,

      83、其中,修飾的bont/a以每個位點大于1754pg(例如大于1800pg)修飾的bont/a的單位劑量施用,

      84、其中,多個位點選自:

      85、皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點,用于治療眉間紋,

      86、額肌肌肉的最多五個位點,用于治療額頭紋;和

      87、眼輪匝肌肌肉的最多三個位點,用于治療外眥紋(例如,眼輪匝肌外部的最多三個位點,用于治療外眥紋),

      88、優(yōu)選地,其中多個位點包括皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點(或由其組成),用于治療眉間紋,

      89、其中治療期間施用的修飾的bont/a的總劑量高達27,500(例如高達25,000pg),并且

      90、其中修飾的bont/a包括bont/a輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域,以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)。

      91、在相關(guān)方面,本發(fā)明提供了一種治療面部紋的方法(例如,持續(xù)時間比未修飾的bont/a(例如,seq?id?no:2)治療的持續(xù)時間更長),該方法包括通過肌肉內(nèi)注射將修飾的肉毒桿菌神經(jīng)毒素a(bont/a)施用到受試者面部的多個位點,

      92、其中修飾的bont/a以每個位點大于1754pg(例如大于1800pg)修飾的bont/a的單位劑量施用,

      93、其中,多個位點選自:

      94、皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點,用于治療眉間紋,

      95、額肌肌肉的最多五個位點,用于治療額頭紋;和

      96、眼輪匝肌肌肉的最多三個位點,用于治療外眥紋(例如,眼輪匝肌外部的最多三個位點,用于治療外眥紋),

      97、優(yōu)選地,其中多個位點包括皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點(或由其組成),用于治療眉間紋,

      98、其中治療期間施用的修飾bont/a的總劑量高達27,500(例如高達25,000pg),并且

      99、其中修飾的bont/a包括bont/a輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域,以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)。

      100、在另一個相關(guān)方面,本發(fā)明提供了修飾的肉毒桿菌神經(jīng)毒素a(bont/a)在制造用于治療面部紋的藥物中的用途(例如,持續(xù)時間比未修飾的bont/a(例如,seq?id?no:2)治療的持續(xù)時間更長),其中修飾的bont/a通過肌肉內(nèi)注射施用到受試者面部的多個位點,

      101、其中修飾bont/a以每個位點大于1754pg(優(yōu)選大于1800pg,更優(yōu)選大于2555pg)修飾的bont/a的單位劑量施用,

      102、其中,多個位點選自:

      103、皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點,用于治療眉間紋,

      104、額肌肌肉的最多五個位點,用于治療額頭紋;和

      105、眼輪匝肌肌肉的最多三個位點,用于治療外眥紋(例如,眼輪匝肌外部的最多三個位點,用于治療外眥紋),

      106、優(yōu)選地,多個位點包括皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點(或由其組成),用于治療眉間紋,

      107、其中治療期間施用的修飾的bont/a的總劑量高達27,500pg(例如高達25,000pg),并且

      108、其中修飾的bont/a包括bont/a輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域,以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)。

      109、所述面部紋最優(yōu)選被稱為“上面部紋”,并且(如上述方面所反映的)包括眉間紋、額頭紋和外眥紋。本發(fā)明可涉及治療所述面部紋中的任一種(例如,上面部紋)或其任何組合。例如,眉間紋、額頭紋和外眥紋這三種均可通過本發(fā)明的方法治療。盡管如此,可以靶向特定類型的面部紋。例如,所治療的面部紋可為眉間紋。此外,或替代地,所治療的面部紋可為額頭紋。此外,或替代地,所治療的面部紋可為外眥紋。

      110、本發(fā)明可以治療特定面部紋組合。面部紋組合的示例包括:

      111、眉間紋和額頭紋;

      112、眉間紋和外眥紋;

      113、額頭紋和外眥紋。

      114、本發(fā)明所治療的面部紋的優(yōu)選組合可為眉間紋和外眥紋。

      115、所指的“肌肉”是指受影響的肌肉,其對本發(fā)明所針對的潛在美學(xué)狀況有貢獻(例如,通過過度緊張(tightness)、拉伸(tension)或緊實(tone))。

      116、第一組肌肉由降眉間肌肌肉限定,第二組肌肉由皺眉肌肌肉限定,第三組肌肉由眼輪匝肌肌肉限定,并且第四組肌肉由額肌肌肉限定。

      117、在整個本公開內(nèi)容中,術(shù)語“皺眉肌肌肉的最多兩個位點”可以與術(shù)語“每塊皺眉肌肌肉的最多兩個位點”互換使用,注意有兩塊皺眉肌肌肉。因此,修飾的bont/a可以在皺眉肌肌肉的最多四個位點施用,例如,前提是修飾的bont/a在每塊皺眉肌肌肉的最多兩個位點施用。

      118、皺眉肌(corrugator)又稱為皺眉肌(corrugator?supercilli)。

      119、(向其施用單位劑量的修飾的bont/a的)眼輪匝肌的位點優(yōu)選位于眼輪匝肌的外部。術(shù)語“眼輪匝肌肌肉的外部”可與術(shù)語“外側(cè)上部眼輪匝肌肌肉”互換使用。

      120、在“眼輪匝肌肌肉的最多三個位點”進行施用可能包括:

      121、a)將單位劑量的修飾的bont/a施用至外側(cè)上部眼輪匝肌肌肉(例如,靠近受試者的第一只眼睛);

      122、b)將單位劑量的修飾的bont/a施用至內(nèi)側(cè)上部眼輪匝肌肌肉(例如,靠近受試者的第一只眼睛);并且

      123、c)將單位劑量的修飾的bont/a施用至外側(cè)下部眼輪匝肌肌肉(例如,靠近受試者的第一只眼睛)。

      124、在“眼輪匝肌肌肉的最多三個位點”進行施用可能包括:

      125、a)將單位劑量的修飾的bont/a施用至外側(cè)上部眼輪匝肌肌肉(例如,靠近受試者的第一只眼睛);

      126、b)將單位劑量的修飾的bont/a施用至外側(cè)下部眼輪匝肌肌肉的第一個位點(例如,靠近受試者的第一只眼睛);并且

      127、c)將單位劑量的修飾的bont/a施用至外側(cè)下部眼輪匝肌肌肉的第二個(不同)位點(例如,靠近受試者的第一只眼睛)。

      128、在整個本公開內(nèi)容中,術(shù)語“眼輪匝肌肌肉的最多三個位點”可以與術(shù)語“每塊眼輪匝肌肌肉的最多三個位點”互換使用,注意眼輪匝肌肌肉有兩塊。類似地,在整個本公開內(nèi)容中,術(shù)語“眼輪匝肌肌肉外部的最多三個位點”可以與術(shù)語“每塊眼輪匝肌肌肉的最多三個位點,位于眼輪匝肌肌肉外部”互換使用,注意眼輪匝肌肌肉有兩塊。因此,修飾的bont/a可以施用到眼輪匝肌肌肉的最多六個位點,例如,前提是修飾的bont/a施用到每塊眼輪匝肌肌肉的最多三個位點。

      129、在“眼輪匝肌肌肉的最多三個位點”進行施用可能包括:

      130、a)對每塊外側(cè)上部眼輪匝肌肌肉施用單位劑量的修飾的bont/a;

      131、b)對每塊內(nèi)側(cè)上部眼輪匝肌肌肉施用單位劑量的修飾的bont/a;并且

      132、c)對每塊外側(cè)下部眼輪匝肌肌肉施用單位劑量的修飾的bont/a。

      133、在“眼輪匝肌肌肉的最多三個位點”進行施用可能包括:

      134、a)對每塊外側(cè)上部眼輪匝肌肌肉(例如,靠近受試者的第一只眼睛)施用單位劑量的修飾的bont/a;

      135、b)將單位劑量的修飾的bont/a施用至外側(cè)下部眼輪匝肌肌肉的第一個位點(例如,靠近受試者的第一只眼睛);并且

      136、c)對每塊外側(cè)下部眼輪匝肌肌肉的第二個(不同)位點(例如,靠近受試者的第一只眼睛)施用單位劑量的修飾的bont/a。

      137、提到“上”眼輪匝肌肌肉時,是指上眼瞼的眼輪匝肌肌肉。同樣,提到“下”眼輪匝肌肌肉時,是指下眼瞼的眼輪匝肌肌肉。

      138、本領(lǐng)域技術(shù)人員理解術(shù)語“內(nèi)側(cè)”(例如在解剖學(xué)的背景下)意味著朝向身體的中線。類似地,本領(lǐng)域技術(shù)人員理解術(shù)語“外側(cè)”(例如在解剖學(xué)的背景下)意味著遠離身體的中線。因此:

      139、-“外側(cè)”上部眼輪匝肌肌肉是指上眼瞼的眼輪匝肌肌肉位點,遠離身體中線

      140、-“內(nèi)側(cè)”上部眼輪匝肌肌肉是指上眼瞼的眼輪匝肌肌肉位點,位于身體中線

      141、附近

      142、-“外側(cè)”下部眼輪匝肌肌肉是指下眼瞼的眼輪匝肌肌肉位點,遠離身體中線。

      143、術(shù)語“外側(cè)上部眼輪匝肌肌肉”可與術(shù)語“上眼瞼的眼輪匝肌肌肉外部”同義使用。術(shù)語“內(nèi)側(cè)上部眼輪匝肌肌肉”可與術(shù)語“上眼瞼的眼輪匝肌肌肉內(nèi)部”同義使用。術(shù)語“外側(cè)下部眼輪匝肌肌肉”可與術(shù)語“下眼瞼的眼輪匝肌肌肉外部”同義使用。

      144、眼輪匝肌肌肉由“瞼板前部”和“眶隔前部”(均可注射)組成。眼輪匝肌肌肉由“眶部”組成。

      145、優(yōu)選地,施用至眼輪匝肌肌肉的單位劑量可施用至所述肌肉的眶部,更優(yōu)選地施用至眼輪匝肌肌肉外部(例如外側(cè)部)的眶部。因此,用于治療外眥紋的多個位點可包括眼輪匝肌肌肉外部(例如外側(cè)部)的眶部的最多三個位點(或由其組成)。

      146、對外側(cè)上部眼輪匝肌肌肉進行施用可能意味著對外側(cè)“瞼板前”上部眼輪匝肌肌肉進行施用,或者對外側(cè)“眶隔前”上部眼輪匝肌肌肉進行施用。

      147、對內(nèi)側(cè)上部眼輪匝肌肌肉進行施用可能意味著對內(nèi)側(cè)上部“瞼板前”眼輪匝肌肌肉進行施用,或者對內(nèi)側(cè)上部“眶隔前”眼輪匝肌肌肉進行施用。

      148、對外側(cè)下部眼輪匝肌肌肉進行施用可能意味著對外側(cè)下部“瞼板前”眼輪匝肌肌肉進行施用,或者對外側(cè)下部“眶隔前”眼輪匝肌肌肉進行施用。

      149、當向外側(cè)上部眼輪匝肌肌肉施用時,所述單位劑量可施用至眶隔前部(換句話說,施用至外側(cè)“眶隔前”上部眼輪匝肌肌肉)。當向內(nèi)側(cè)上部眼輪匝肌肌肉施用時,所述單位劑量可施用至眶隔前部(換句話說,施用至內(nèi)側(cè)上部“眶隔前”眼輪匝肌肌肉)。當向外側(cè)下部眼輪匝肌肌肉施用時,所述單位劑量可施用至眶隔前部(換句話說,施用至外側(cè)下部“眶隔前”眼輪匝肌肌肉)。

      150、施用修飾的bont/a的位點數(shù)量可能根據(jù)待治療的面部紋而有所不同。

      151、例如,待治療的面部紋可為眉間紋,術(shù)語“多個位點”可以表示最多三個位點,其中多個位點包括皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點(或由其組成),用于治療眉間紋。優(yōu)選將兩個單位劑量的修飾的bont/a施用到皺眉肌的兩個不同位點,并將一個單位劑量施用到降眉間肌的一個位點,用于治療眉間紋(例如,使得三個單位劑量施用至三個不同位點)??梢灾委熋娌恳粋?cè)的眉間紋,術(shù)語“多個位點”可以表示如上定義的最多三個的位點,使得受試者接受最多三個單位劑量的修飾的bont/a。

      152、待治療的面部紋可為眉間紋,術(shù)語“多個位點”可以表示最多六個位點,其中單位劑量的修飾的bont/a作用于每塊皺眉肌肌肉上最多兩個位點和降眉間肌肌肉上最多一個位點,用于治療眉間紋。優(yōu)選將兩個單位劑量的修飾的bont/a施用到每塊皺眉肌的兩個不同位點,將一個單位劑量施用到降眉間肌的一個位點,用于治療眉間紋(例如,使得五個單位劑量施用至五個不同位點)??梢灾委熋娌績蓚?cè)的眉間紋,術(shù)語“多個位點”可以表示如上定義的最多六個位點,使得受試者接受最多六個單位劑量的修飾的bont/a。

      153、待治療的面部紋可為額頭紋,術(shù)語“多個位點”可以指額肌肌肉的最多兩個、三個、四個或五個位點,用于治療額頭紋。優(yōu)選將五個單位劑量施用到額肌的五個不同位點,用于治療額頭紋(例如,使得五個單位劑量施用至五個不同位點)。

      154、待治療的面部紋可為外眥紋,術(shù)語“多個位點”可以表示眼輪匝肌肌肉的最多兩個或三個位點(例如,眼輪匝肌肌肉外部的最多兩個或三個位點)。優(yōu)選將三個單位劑量的修飾的bont/a施用到眼輪匝肌肌肉的三個不同位點,用于治療外眥紋(例如,使得三個單位劑量施用至三個不同位點)。可以治療面部一側(cè)的外眥紋,術(shù)語“多個位點”可以表示如上定義的最多三個位點,使得受試者接受最多三個單位劑量的修飾的bont/a。

      155、待治療的面部紋可為外眥紋,術(shù)語“多個位點”可以表示每塊眼輪匝肌肌肉的最多兩個或三個位點(例如,每塊眼輪匝肌肌肉的最多兩個或三個位點,位于眼輪匝肌肌肉外部)。優(yōu)選將三個單位劑量的修飾的bont/a施用至每塊眼輪匝肌肌肉的三個不同位點以治療外眥紋(例如,使得六個單位劑量施用至六個不同位點)??梢灾委熋娌績蓚?cè)的外眥紋,術(shù)語“多個位點”可以表示如上定義的最多六個位點,使得受試者接受最多六個單位劑量的修飾的bont/a。

      156、待治療的面部紋可為眉間紋和額頭紋,術(shù)語“多個位點”可表示最多八個位點,其中多個位點包括皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點(或由其組成),用于治療眉間紋,以及額肌肌肉的最多五個位點(或由其組成),用于治療額頭紋。優(yōu)選將兩個單位劑量的修飾的bont/a施用到皺眉肌的兩個不同位點,和將一個單位劑量施用到降眉間肌的一個位點,用于治療眉間紋,和將五個單位劑量施用到額肌肌肉的五個不同位點,用于治療額頭紋(例如,使得八個單位劑量施用至八個不同位點)。

      157、待治療的面部紋可為眉間紋和額頭紋,術(shù)語“多個位點”可以表示最多十個位點,其中多個位點包括每塊皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點(或由其組成),用于治療眉間紋,以及額肌肌肉的最多五個位點(或由其組成),用于治療額頭紋。優(yōu)選將兩個單位劑量的修飾的bont/a施用到每塊皺眉肌的兩個不同位點,和將一個單位劑量施用到降眉間肌一個位點,用于治療眉間紋,和將五個單位劑量施用到額肌肌肉的五個不同位點,用于治療額頭紋(例如,使得十個單位劑量施用至十個不同位點)。

      158、待治療的面部紋可為眉間紋和外眥紋,術(shù)語“多個位點”可表示最多三個、四個、五個或六個位點,其中多個位點包括(或由)皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點,用于治療眉間紋,以及眼輪匝肌肌肉的最多兩個或三個位點(例如,眼輪匝肌肌肉外部的最多兩個或三個位點),用于治療外眥紋。優(yōu)選將兩個單位劑量的修飾的bont/a施用至皺眉肌的兩個不同位點,和將一個單位劑量施用至降眉間肌的一個位點,用于治療眉間紋,和將三個單位劑量的修飾的bont/a施用至眼輪匝肌肌肉的三個不同位點,用于治療外眥紋(例如,將六個單位劑量施用至六個不同位點)。

      159、待治療的面部紋可為眉間紋和外眥紋,且術(shù)語“多個位點”可表示最多三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或十一個位點,其中多個位點包括每塊皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點(或由其組成),用于治療眉間紋,以及每塊眼輪匝肌肌肉的最多兩個或三個位點(例如,每塊眼輪匝肌肌肉的最多兩個或三個位點,位于眼輪匝肌肌肉的外部),用于治療外眥紋。優(yōu)選地,將兩個單位劑量的修飾的bont/a施用到每塊皺眉肌的兩個不同位點,和將一個單位劑量施用到降眉間肌的一個位點,用于治療眉間紋,和將三個單位劑量的修飾的bont/a施用到每塊眼輪匝肌肌肉的三個不同位點,用于治療外眥紋(例如,使得十一個單位劑量施用至十一個不同位點)。

      160、待治療的面部紋可為額頭紋和外眥紋,術(shù)語“多個位點”可表示最多四個、五個、六個、七個或八個位點,其中多個位點包括額肌肌肉的最多兩個、三個、四個或五個位點(或由其組成),用于治療額頭紋,以及眼輪匝肌肌肉的最多兩個或三個位點(例如,眼輪匝肌肌肉外部的最多兩個或三個位點),用于治療外眥紋。優(yōu)選將五個單位劑量施用到額肌肌肉的五個不同位點,用于治療額頭紋,和將三個單位劑量的修飾的bont/a施用到眼輪匝肌肌肉的三個不同位點,用于治療外眥紋(例如,使得八個單位劑量施用至八個不同位點)。

      161、待治療的面部紋可為額頭紋和外眥紋,術(shù)語“多個位點”可表示最多四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或十一個位點,其中多個位點包括額肌肌肉的最多兩個、三個、四個或五個位點(或由其組成),用于治療額頭紋,以及每塊眼輪匝肌肌肉的最多兩個或三個位點(例如,每塊眼輪匝肌肌肉外部的最多兩個或三個位點),用于治療外眥紋。優(yōu)選將五個單位劑量施用到額肌肌肉的五個不同位點,用于治療額頭紋,和將三個單位劑量的修飾的bont/a施用到每塊眼輪匝肌肌肉的三個不同位點,用于治療外眥紋(例如,使得十一個單位劑量施用至十一個不同位點)。

      162、待治療的面部紋可為眉間紋、前額紋和外眥紋,術(shù)語“多個位點”可以表示最多四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個或十六個位點,其中多個位點包括(或由以下組成)

      163、-皺眉肌肌肉的最多兩個位點的和降眉間肌肌肉的最多一個位點,用于治療眉間紋,

      164、-額肌肌肉的最多兩個、三個、四個或五個位點,用于治療額頭紋,以及

      165、-眼輪匝肌肌肉的最多兩個或三個位點(例如,眼輪匝肌肌肉外部的最多兩個或三個位點),用于治療外眥紋。

      166、優(yōu)選的是:

      167、-將兩個單位劑量的修飾的bont/a施用至皺眉肌的兩個不同位點,并將一個單位劑量施用至降眉間肌的一個位點,用于治療眉間紋,

      168、-將五個單位劑量注射到額肌肌肉的五個不同位點,用于治療額頭紋,并且

      169、-將三個單位劑量的修飾的bont/a施用至眼輪匝肌肌肉的三個不同位點(例如其外部),用于治療外眥紋

      170、-(例如,將十一個單位劑量施用至十一個不同位點)。

      171、待治療的面部紋可為眉間紋、額頭紋和外眥紋,且術(shù)語“多個位點”可表示最多四、五、六、七、八、九、十、十一個、十二、十三個、十四個、十五或十六個位點,其中所述多個位點包括(或由以下組成):

      172、-每塊皺眉肌肌肉的最多兩個位點,降眉間肌肌肉的一個位點,用于治療眉間紋,

      173、-額肌肌肉的最多兩個、三個、四個或五個位點,用于治療額頭紋,以及

      174、-每塊眼輪匝肌肌肉的最多兩個或三個位點(例如,每塊眼輪匝肌肌肉外部的最多兩個或三個位點),用于治療外眥紋。

      175、優(yōu)選的是:

      176、-將兩個單位劑量的修飾的bont/a施用到每塊皺眉肌的兩個不同位點,并將一個單位劑量施用到降眉間肌的一個位點,用于治療眉間紋,

      177、-將五個單位劑量注射到額肌肌肉的五個不同位點,用于治療額頭紋,并且

      178、-將三個單位劑量的修飾的bont/a施用至每塊眼輪匝肌肌肉(例如其外部)的三個不同位置,用于治療外眥紋

      179、-(例如,將十六個單位劑量施用至十一個不同的位點)。

      180、因此,術(shù)語“多個位點”可以表示最多兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個或十六個位點。優(yōu)選地,術(shù)語“多個位點”可以指“最多16個位點”。

      181、術(shù)語“多個位點”可以表示兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個或十六個位點。優(yōu)選地,術(shù)語“多個位點”可以表示16個位點。

      182、因此,修飾的bont/a可通過肌肉內(nèi)注射的方式在受試者面部的最多16個位點進行施用,例如

      183、-皺眉肌肌肉的最多四個位點(例如,前提是將修飾的bont/a施用至每塊皺眉肌肌肉的最多兩個位點)和降眉間肌肌肉的一個位點,用于治療眉間紋;

      184、-額肌肌肉的最多五個位點,用于治療額頭紋;以及

      185、-眼輪匝肌肌肉的最多六個位點(例如,前提是將修飾的bont/a施用至每塊眼輪匝肌肌肉的最多三個位點),用于治療外眥紋。

      186、多個位點可位于同一肌肉群上(例如,左右皺眉肌肌肉、左右眼輪匝肌肌肉)。類似地,多個位點可位于同一肌肉上(例如,右皺眉肌肌肉或左皺眉肌肌肉;或右眼輪匝肌肌肉或左眼輪匝肌肌肉)。類似地,多個位點可位于所述肌肉和肌肉群的組合上。因此,可提供個性化治療方案。

      187、根據(jù)本發(fā)明使用的修飾的bont/a的效力優(yōu)選通過小鼠ld50測定法根據(jù)標準技術(shù)來確定。在所述測定法中,1單位定義為對應(yīng)于小鼠中計算的半數(shù)致死量(ld50)的修飾的bont/a的量。優(yōu)選地,對應(yīng)于小鼠中計算的半數(shù)致死腹膜內(nèi)劑量。

      188、具體而言,在所述測定中對應(yīng)于1單位的修飾bont/a的量優(yōu)選為24.04pg。

      189、術(shù)語“最多”用于指代某個值(例如最多3661單位)時,是指最多且包括所述值。因此,例如,提及施用“最多3661單位”修飾的bont/a包括施用3661單位的修飾bont/a以及施用少于3661單位的修飾bont/a。作為另一個示例,提及施用“最多80,000pg”修飾的bont/a包括施用80,000pg修飾的bont/a以及施用少于80,000pg修飾的bont/a。

      190、通過在多個位點肌肉內(nèi)注射來施用一劑修飾的bont/a。每個位點施用單個單位劑量。術(shù)語“施用(單個)單位劑量”是指施用基本上全部的(單個)單位劑量。優(yōu)選地,在已復(fù)原的修飾的bont/a的小瓶中最多僅殘留(例如高達1%、0.1%或0.01%)(單個)單位劑量。然而,優(yōu)選地施用全部的(單個)單位劑量。根據(jù)肌肉群,通常將(單個)單位劑量施用至選自第一群(本文所述)的肌肉,通常將2x單位施用至選自第二群(本文所述)的肌肉,通常將3x單位施用至選自第三群(本文所述)的肌肉,并且通常將5x單位施用至選自第四群(本文所述)的肌肉。

      191、單位劑量可以用修飾的bont/a的單位來表示。例如,24.04pg可能對應(yīng)于1單位的修飾的bont/a。例如,2404pg的bon/a可以表示為100單位的修飾的bont/a。

      192、單位劑量可為大于73單位的修飾的bont/a。單位劑量范圍的上限可為3,661、3000、2500、2000、1500、1000、500或100單位的修飾的bont/a。單位劑量范圍的下限可為75、100、150、200、300或500單位的修飾的bont/a。優(yōu)選地,修飾的bont/a的單位劑量大于73單位至3000單位、100單位至2500單位,更優(yōu)選地200單位至2000單位。

      193、如上所述,修飾的bont/a的單位劑量可以大于73單位。單位劑量范圍的上限可為300、250、200、150、100或50單位的修飾的bont/a,優(yōu)選上限為300單位。單位劑量范圍的下限可為75、100、150、200、300單位,優(yōu)選下限為100單位。優(yōu)選地,修飾的bont/a的單位劑量為100-300單位的修飾的bont/a,例如150單位至250單位。

      194、修飾的bont/a的單位劑量可選自:100單位至300單位、150單位至250單位、以及175單位至225單位。

      195、單位劑量可為大于1754pg至8000pg的修飾的bont/a。換言之,單位劑量可為大于1754pg且最多8000pg的修飾的bont/a。單位劑量范圍的上限可為8,000、7,000、6,000、5,000、4,000、3,000、2,000或1,000pg的修飾的bont/a,優(yōu)選上限為5,000pg。單位劑量范圍的下限可為1,800、2,000、2,500、3000或4,000pg的修飾的bont/a,優(yōu)選下限為1,800。修飾的bont/a的單位劑量可選自:1,800至8,000pg、2,000至6,000pg,最優(yōu)選3,000至6,000pg。修飾的bont/a的單位劑量可以為4,500至5,500pg的修飾的bont/a,例如4,900至5,100pg。

      196、單位劑量可大于1800pg修飾的bont/a。單位劑量可大于1800pg且最多7000pg的修飾的bont/a,例如大于1800pg且最多6000pg修飾的bont/a。單位劑量可大于2000pg且最多5000pg修飾的bont/a。

      197、單位劑量可大于2555pg。例如,單位劑量可大于2555pg且最多8000pg的修飾的bont/a,例如大于2555pg且最多6000pg。

      198、單位劑量可為2000pg、2500pg、3000pg、4000pg、4500pg、5000pg、5500pg、6000pg、6500pg、7000pg、7500pg或8000pg的修飾的bont/a。

      199、更優(yōu)選的是,單位劑量為2000至3500pg修飾的bont/a。例如,單位劑量可為2250pg至3250pg修飾的bont/a。特別優(yōu)選的單位劑量可為約2500pg(例如2500pg±10%)修飾的bont/a,例如單位劑量可以優(yōu)選為2500pg修飾的bont/a。另一優(yōu)選的單位劑量可為約3000pg(例如3000pg±10%)修飾的bont/a,例如單位劑量可為3000pg修飾的bont/a。

      200、單位劑量可為3500-5500pg修飾的bont/a。例如,單位劑量可為3800pg至4200pg修飾的bont/a。單位劑量可為4800至5200pg修飾的bont/a。特別優(yōu)選的單位劑量可為約4000pg(例如4000pg±10%)修飾的bont/a,例如單位劑量可為4000pg修飾的bont/a。另一特別優(yōu)選的單位劑量可為約5000pg(例如5000pg±10%)修飾的bont/a,例如單位劑量可為5000pg修飾的bont/a。

      201、單位劑量可以以“單位”來表示,也可以以pg量來表示。修飾的bont/a的單位劑量也可以同時以單位和量(pg)來表示。

      202、當治療面部紋時,修飾的bont/a可以施用到選自以下的多個位點:皺眉肌肌肉的最多兩個位點和降眉間肌肌肉的最多一個位點,用于治療眉間紋,額肌肌肉的最多五個位點,用于治療額頭紋;以及眼輪匝肌肌肉外部的最多三個位點,用于治療外眥紋。

      203、實施本發(fā)明的治療方案時所施用的總劑量最多可為3661單位。換句話說,在給定的治療期間施用的修飾的bont/a的總量最多可為3661單位。總劑量最多可為3500、3000、2500、2000、1500或1000單位的修飾的bont/a。優(yōu)選地,總劑量最多可為3327.8單位的修飾的bont/a。

      204、實施本發(fā)明的治療方案時施用的總劑量最多可為88000、85000、80000、75000、70000、65000、60000、55000、50000、45000、40000、35000或30000pg的修飾的bont/a,優(yōu)選地最多80000pg的修飾的bont/a。因此,總劑量的上限可為88000、85000、80000、75000、70000、65000、60000、55000、50000、45000、40000、35000或30000pg的修飾的bont/a,優(yōu)選為80000pg的修飾的bont/a。總劑量的下限可為25000、20000、15000、10000、5000pg、2000pg、1000pg、500pg或50pg的修飾的bont/a。例如,總劑量的下限可為25000、20000、15000、10000或5000pg的修飾的bont/a。

      205、實施本發(fā)明的治療方案時施用的總劑量可為7,000pg至8,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用7,000pg至8,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。特別優(yōu)選的總劑量可為約7,500pg(例如,7,500pg±10%)修飾的bont/a,例如總劑量可為7,500pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用約7,500pg(例如,7,500pg±10%)修飾的bont/a,例如可以向受試者施用7,500pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。

      206、實施本發(fā)明的治療方案時施用的總劑量可為10,000pg至20,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用10,000pg至20,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。例如,總劑量可為11,500pg至12,500pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用11,500pg至12,500pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。特別優(yōu)選的總劑量可為約12,000pg(例如,12,000pg±10%)修飾的bont/a,例如總劑量可為12,000pg修飾的bont/a。因此,可向受試者施用約12,000pg(例如12,000pg±10%)修飾的bont/a,例如可向受試者施用12,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。

      207、例如,總劑量可為12,000pg至13,000pg的修飾的bont/a。因此,可向受試者施用12,000pg至13,000pg的修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。特別優(yōu)選的總劑量可為約12,500pg(例如,12,500pg±10%)的修飾的bont/a,例如總劑量可為12,500pg的修飾的bont/a。因此,可向受試者施用約12,500pg(例如,12,500pg±10%)的修飾的bont/a,例如可向受試者施用12,500pg的修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。

      208、向受試者施用的總劑量可為14,000pg至16,000pg的修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用14,000pg至16,000pg的修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。特別優(yōu)選的總劑量可為約15,000pg(例如,15,000pg±10%)的修飾的bont/a,例如,總劑量可為15,000pg的修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用約15,000pg(例如,15,000pg±10%)的修飾bont/a,例如,可以向受試者施用15,000pg的修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。

      209、實施本發(fā)明的治療方案時施用的總劑量可為18,000pg至26,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用18,000pg至26,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。例如,總劑量可為19,000pg至21,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用19,000pg至21,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。特別優(yōu)選的總劑量可為約20,000pg(例如,20,000pg±10%)修飾的bont/a,例如總劑量可為20,000pg修飾的bont/a。因此,可向受試者施用約20,000pg(例如20,000pg±10%)修飾的bont/a,例如可向受試者施用20,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。

      210、實施本發(fā)明的治療方案時施用的總劑量可為22,000pg至23,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用22,000pg至23,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。特別優(yōu)選的總劑量可為約22,500pg(例如,22,500pg±10%)修飾的bont/a,例如總劑量可為22,500pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用約22,500pg(例如,22,500pg±10%)修飾的bont/a,例如可以向受試者施用22,500pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。

      211、向受試者施用的總劑量可為23,000pg至25,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用23,000pg至25,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。特別優(yōu)選的總劑量可為約24,000pg(例如,24,000pg±10%)修飾的bont/a,例如,總劑量可為24,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用約24,000pg(例如,24,000pg±10%)修飾的bont/a,例如,可以向受試者施用24,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。

      212、向受試者施用的總劑量可為24,000pg至26,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用24,000pg至26,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。特別優(yōu)選的總劑量可為約25,000pg(例如,24,000pg±10%)修飾的bont/a,例如總劑量可為25,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用約25,000pg(例如,25,000pg±10%)修飾的bont/a,例如可以向受試者施用25,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。

      213、向受試者施用的總劑量可為27,000pg至28,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用27,000pg至28,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。特別優(yōu)選的總劑量可為約27,500pg(例如,27,500pg±10%)修飾的bont/a,例如,總劑量可為27,500pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用約27,500pg(例如,27,500pg±10%)修飾的bont/a,例如,可以向受試者施用27,500pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。

      214、向受試者施用的總劑量可為31,000pg至33,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用31,000pg至33,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。特別優(yōu)選的總劑量可為約32,000pg(例如,32,000pg±10%)修飾的bont/a,例如,總劑量可為32,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用約32,000pg(例如,32,000pg±10%)修飾的bont/a,例如,可以向受試者施用32,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。

      215、總劑量可為35,000pg至37,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用35,000pg至37,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。特別優(yōu)選的總劑量可為約36,000pg(例如,36,000pg±10%)修飾的bont/a,例如總劑量可為36,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用約36,000pg(例如,36,000pg±10%)修飾的bont/a,例如可以向受試者施用36,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。

      216、實施本發(fā)明的治療方案時施用的總劑量可為35,000至45,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用35,000至45,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。特別優(yōu)選的總劑量可為約40,000pg(例如,40,000pg±10%)修飾的bont/a,例如總劑量可為40,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用約40,000pg(例如,40,000pg±10%)修飾的bont/a,例如可以向受試者施用40,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。

      217、實施本發(fā)明的治療方案時施用的總劑量可為43,000至44,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用43,000至44,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。特別優(yōu)選的總劑量可為約44,000pg(例如,44,000pg±10%)修飾的bont/a,例如總劑量可為44,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用約44,000pg(例如,44,000pg±10%)修飾的bont/a,例如可以向受試者施用44,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。

      218、實施本發(fā)明的治療方案時施用的總劑量可為60,000至70,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用60,000至70,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。實施本發(fā)明的治療方案時施用的優(yōu)選總劑量可為63,000至65,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用63,000至65,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。特別優(yōu)選的總劑量可為約64,000pg(例如,64,000pg±10%)修飾的bont/a,例如總劑量可為64,000pg修飾的bont/a。因此,可向受試者施用約64,000pg(例如64,000pg±10%)修飾的bont/a,例如可向受試者施用64,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)。

      219、總劑量可為12,000pg至13,000pg修飾的bont/a,單位劑量可為2000至3500pg修飾的bont/a。因此,可向受試者施用12,000pg至13,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量為2000至3500pg修飾的bont/a。

      220、特別優(yōu)選的總劑量可為約12,500pg(例如12,500pg±10%)的修飾bont/a,例如總劑量可為12,500pg修飾的bont/a,其中單位劑量是2000至3500pg修飾的bont/a。優(yōu)選的總劑量是12,500pg修飾的bont/a,其中單位劑量是2000至3500pg修飾的bont/a。更優(yōu)選的總劑量是12,500pg修飾的bont/a,其中單位劑量是2500pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用12,500pg修飾的bont/a,其中單位劑量是2500pg修飾的bont/a。

      221、總劑量可為14,000pg至16,000pg修飾的bont/a,單位劑量可為2000至3500pg修飾的bont/a。因此,可向受試者施用14,000pg至16,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量為2000至3500pg修飾的bont/a。特別優(yōu)選的總劑量可為約15,000pg(例如15,000pg±10%)的修飾的bont/a,例如總劑量可為15,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是2000至3500pg修飾的bont/a。優(yōu)選的總劑量是15,000pg的修飾的bont/a,其中單位劑量是2000至3500pg修飾的bont/a。更優(yōu)選的總劑量是15,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是2500pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用15,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是2500pg修飾的bont/a。

      222、實施本發(fā)明的治療方案時施用的總劑量可為18,000pg至26,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是3500-5500pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用18,000pg至26,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是3500-5500pg修飾的bont/a。

      223、特別優(yōu)選的總劑量可為約20,000pg(例如20,000pg±10%)修飾的bont/a,例如總劑量可為20,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是3500-5500pg修飾的bont/a。優(yōu)選的總劑量是20,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是3500-5500pg修飾的bont/a。更優(yōu)選的總劑量是20,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是4000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用20,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是4000pg修飾的bont/a。

      224、實施本發(fā)明的治療方案時,施用的總劑量可以為23,000pg至25,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量為3500-5500pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用23,000pg至25,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量為3500-5500pg修飾的bont/a。

      225、特別優(yōu)選的總劑量可為約24,000pg(例如24,000pg±10%)的修飾bont/a,例如總劑量可為24,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是3500-5500pg修飾的bont/a。優(yōu)選的總劑量是24,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是3500-5500pg修飾的bont/a。更優(yōu)選的總劑量是24,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是4000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用24,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是4000pg修飾的bont/a

      226、實施本發(fā)明的治療方案時施用的總劑量可為43,000至44,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是2000至3500pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用43,000至44,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是2000至3500pg修飾的bont/a。特別優(yōu)選的總劑量可為約44,000pg(例如44,000pg±10%)修飾的bont/a,其中單位劑量是2000至3500pg修飾的bont/a,例如總劑量可為44,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是2000至3500pg修飾的bont/a。因此,可向受試者施用約44,000pg(例如44,000pg±10%)修飾的bont/a,其中單位劑量為2000至3500pg修飾的bont/a。優(yōu)選可向受試者施用44,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量為2000至3500pg修飾的bont/a。例如,可向受試者施用約44,000pg(例如44,000pg±10%)修飾的bont/a,其中單位劑量為約2500pg(例如2500pg±10%)修飾的bont/a。更優(yōu)選可向受試者施用44,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量為2500pg修飾的bont/a。

      227、實施本發(fā)明的治療方案時所施用的總劑量可為60,000至70,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是3500-5500pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用60,000至70,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是3500-5500pg修飾的bont/a。實施本發(fā)明的治療方案時所施用的優(yōu)選總劑量可為63,000至65,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是3500-5500pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用63,000至65,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是3500-5500pg修飾的bont/a。特別優(yōu)選的總劑量可為約64,000pg(例如64,000pg±10%)修飾的bont/a,其中單位劑量是3500-5500pg修飾的bont/a。例如,總劑量可為64,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量是3500-5500pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用約64,000pg(例如64,000pg±10%)修飾的bont/a,其中單位劑量是3500-5500pg的修飾bont/a。優(yōu)選可以向受試者施用約64,000pg(例如64,000pg±10%)修飾的bont/a,其中單位劑量為約4000pg(例如4,000pg±10%)修飾的bont/a。更優(yōu)選可以向受試者施用64,000pg修飾的bont/a,其中單位劑量為4000pg修飾的bont/a。

      228、總劑量可能因待治療的面部紋或面部紋組合而異。下文將更詳細地討論任何給定面部紋的優(yōu)選總劑量示例。

      229、實施眉間紋治療方案時施用的總劑量最多可為30000、25000、20000、15000、10000或5000pg修飾的bont/a,優(yōu)選最多25000pg修飾的bont/a。實施眉間紋治療方案時可施用的特別優(yōu)選的總劑量可約為12,500pg(例如12,500pg±10%)修飾的bont/a,例如單位劑量可為12,500pg修飾的bont/a。實施眉間紋治療方案時可施用的另一特別優(yōu)選的總劑量可約為20,000pg(例如20,000pg±10%)修飾的bont/a,例如單位劑量可為20,000pg修飾的bont/a。

      230、實施眉間紋治療方案時施用的總劑量可為7,000pg至8,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用7,000pg至8,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約7,500pg(例如,7,500pg±10%)修飾的bont/a,以治療眉間紋,例如總劑量可為7,500pg修飾的bont/a,以治療眉間紋。因此,可向受試者施用約7,500pg(例如7,500pg±10%)修飾的bont/a以治療眉間紋,例如可向受試者施用7,500pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋。

      231、實施眉間紋的治療方案時施用的總劑量可為10,000pg至20,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用10,000pg至20,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋。例如,總劑量可為11,500pg至12,500pg修飾的bont/a,以治療眉間紋。因此,可以向受試者施用11,500pg至12,500pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約12,000pg(例如12,000pg±10%)修飾的bont/a,例如總劑量可為12,000pg修飾的bont/a,以治療眉間紋。因此,可以向受試者施用約12,000pg(例如12,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療眉間紋,例如可以向受試者施用12,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋。

      232、實施眉間紋的治療方案時施用的總劑量可為12,000pg至13,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用12,000pg至13,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約12,500pg(例如,12,500pg±10%)修飾的bont/a,以治療眉間紋,例如總劑量可為12,500pg修飾的bont/a,以治療眉間紋。因此,可向受試者施用約12,500pg(例如12,500pg±10%)修飾的bont/a以治療眉間紋,例如可向受試者施用12,500pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋。

      233、實施眉間紋的治療方案時施用的總劑量可為18,000pg至26,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用18,000pg至26,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋。例如,總劑量可為19,000pg至21,000pg修飾的bont/a,以治療眉間紋。因此,可以向受試者施用19,000pg至21,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約20,000pg(例如20,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療眉間紋,例如總劑量可為20,000pg修飾的bont/a,用于治療眉間紋。因此,可以向受試者施用約20,000pg(例如20,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療眉間紋,例如可以向受試者施用20,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)用于治療眉間紋。

      234、實施額頭紋的治療方案時施用的總劑量最多可為30000、25000、20000、15000、10000或5000pg修飾的bont/a,優(yōu)選地最多25000pg修飾的bont/a。

      235、實施額頭紋的治療方案時施用的總劑量可為12,000pg至13,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用12,000pg至13,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療額頭紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約12,500pg(例如,12,500pg±10%)修飾的bont/a以治療額頭紋,例如總劑量可為12,500pg修飾的bont/a以治療額頭紋。因此,可向受試者施用約12,500pg(例如12,500pg±10%)修飾的bont/a來治療額頭紋,例如可向受試者施用12,500pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)來治療額頭紋。

      236、實施額頭紋治療方案時施用的總劑量可為18,000pg至26,000pg修飾的bont/a。因此,可向受試者施用18,000pg至26,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療額頭紋。例如,總劑量可為19,000pg至21,000pg修飾的bont/a,以治療額頭紋。因此,可向受試者施用19,000pg至21,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療額頭紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約20,000pg(例如20,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療額頭紋,例如總劑量可為20,000pg修飾的bont/a,用于治療額頭紋。因此,可以向受試者施用約20,000pg(例如20,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療額頭紋,例如可以向受試者施用20,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)用于治療額頭紋。

      237、實施外眥紋治療方案時施用的總劑最多可為30000、25000、20000、15000、10000或5000pg修飾的bont/a,優(yōu)選地高達25000pg的修飾的bont/a。

      238、實施外眥紋治療方案時施用的總劑量可為7,000pg至8,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用7,000pg至8,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)用于治療外眥紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約7,500pg(例如,7,500pg±10%)修飾的bont/a,用于治療外眥紋,例如總劑量可為7,500pg修飾的bont/a,用于治療外眥紋。因此,可向受試者施用約7,500pg(例如7,500pg±10%)修飾的bont/a用于治療外眥紋,例如可向受試者施用7,500pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)用于治療外眥線。

      239、實施外眥紋治療方案時施用的總劑量可為10,000pg至20,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用10,000pg至20,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)用于治療外眥紋。例如,總劑量可為11,500pg至12,500pg修飾的bont/a,用于治療外眥紋。因此,可以向受試者施用11,500pg至12,500pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)用于治療外眥紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約12,000pg(例如12,000pg±10%)修飾的bont/a,如總劑量可為12,000pg的修飾bont/a,用于治療外眥紋。因此,可以向受試者施用約12,000pg(例如12,000pg±10%)的修飾bont/a,用于治療外眥紋,例如可以向受試者施用12,000pg的修飾bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)用于治療外眥紋。

      240、實施外眥紋治療方案時施用的總劑量可為14,000pg至16,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用14,000pg至16,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)用于治療外眥線。特別優(yōu)選的總劑量可為約15,000pg(例如,15,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療外眥紋,例如總劑量可為15,000pg修飾的bont/a,用于治療外眥紋。因此,可向受試者施用約15,000pg(例如15,000pg±10%)修飾的bont/a來治療外眥紋,例如可向受試者施用15,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)來治療外眥紋。

      241、實施外眥紋治療方案時施用的總劑量可為23,000pg至25,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用23,000pg至25,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療外眥紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約24,000pg(例如,24,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療外眥紋,例如總劑量可為24,000pg修飾的bont/a,用于治療外眥紋。因此,可向受試者施用約24,000pg(例如24,000pg±10%)修飾的bont/a用于治療外眥紋,例如可向受試者施用24,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療外眥紋。

      242、實施眉間紋和額頭紋的治療方案時施用的總劑量可為18,000pg至26,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用18,000pg至26,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋和額頭紋。例如,總劑量可為19,000pg至21,000pg修飾的bont/a,以治療眉間紋和額頭紋。因此,可以向受試者施用19,000pg至21,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋和前額頭紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約20,000pg(例如20,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療眉間紋和額頭紋,例如總劑量可為20,000pg修飾的bont/a,用于治療眉間紋和額頭紋。因此,可以向受試者施用約20,000pg(例如20,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療眉間紋和額頭紋,例如可以向受試者施用20,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)用于治療眉間紋和額頭紋。

      243、實施眉間紋和額頭紋的治療方案時施用的總劑量可為24,000pg至26,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用24,000pg至26,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋和額頭紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約25,000pg(例如,24,000pg±10%)修飾的bont/a以治療眉間紋和額頭紋,例如總劑量可為25,000pg修飾的bont/a以治療眉間紋和額頭紋。因此,可向受試者施用約25,000pg(例如25,000pg±10%)修飾的bont/a以治療眉間紋和額頭紋,例如可向受試者施用25,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋和額頭紋。

      244、實施眉間紋和額頭紋治療方案時施用的總劑量可為31,000pg至33,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用31,000pg至33,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋和額頭紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約32,000pg(例如,32,000pg±10%)修飾的bont/a以治療眉間紋和額頭紋,例如總劑量可為32,000pg修飾的bont/a以治療眉間紋和額頭紋。因此,可向受試者施用約32,000pg(例如32,000pg±10%)修飾的bont/a以治療眉間紋和額頭紋,例如可向受試者施用32,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋和額頭紋。

      245、實施眉間紋和額頭紋治療方案時施用的總劑量可為35,000至45,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用35,000至45,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋和額頭紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約40,000pg(例如,40,000pg±10%)修飾的bont/a以治療眉間紋和額頭紋,例如總劑量可為40,000pg修飾的bont/a以治療眉間紋和額頭紋。因此,可向受試者施用約40,000pg(例如40,000pg±10%)修飾的bont/a以治療眉間紋和額頭紋,例如可向受試者施用40,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋和額頭紋。

      246、實施眉間紋和外眥紋治療方案時施用的總劑量可為14,000pg至16,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用14,000pg至16,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋和外眥紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約15,000pg(例如,15,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療眉間紋和外眥紋,例如總劑量可為15,000pg修飾的bont/a,用于治療眉間紋和外眥紋。因此,可向受試者施用約15,000pg(例如15,000pg±10%)修飾的bont/a以治療眉間線和外眥紋,例如可向受試者施用15,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間線和外眥紋。

      247、實施眉間紋和外眥紋的治療方案時施用的總劑量可為18,000pg至26,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用18,000pg至26,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋和外眥紋。例如,總劑量可為19,000pg至21,000pg修飾的bont/a,以治療眉間紋和外眥紋。因此,可以向受試者施用19,000pg至21,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋和外眥紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約20,000pg(例如20,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療眉間紋和外眥紋,例如總劑量可為20,000pg修飾的bont/a,用于治療眉間紋和外眥紋。因此,可以向受試者施用約20,000pg(例如20,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療眉間紋和外眥紋,例如可以向受試者施用20,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)用于治療眉間紋和外眥紋。

      248、實施眉間紋和外眥紋的治療方案時施用的總劑量可為22,000pg至23,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用22,000pg至23,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋和外眥紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約22,500pg(例如,22,500pg±10%)修飾的bont/a以治療眉間紋和外眥紋,例如總劑量可為22,500pg修飾的bont/a以治療眉間紋和外眥紋。因此,可向受試者施用約22,500pg(例如22,500pg±10%)修飾的bont/a以治療眉間線和外眥紋,例如可向受試者施用22,500pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間線和外眥紋。

      249、實施眉間紋和外眥紋的治療方案時施用的總劑量可為23,000pg至25,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用23,000pg至25,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋和外眥紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約24,000pg(例如,24,000pg±10%)修飾的bont/a以治療眉間紋和外眥紋,例如總劑量可為24,000pg修飾的bont/a以治療眉間紋和外眥紋。因此,可向受試者施用約24,000pg(例如24,000pg±10%)修飾的bont/a以治療眉間紋和外眥紋,例如可向受試者施用24,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療外眥紋。

      250、實施眉間紋和外眥紋治療方案時施用的總劑量可為27,000pg至28,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用27,000pg至28,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)用于治療眉間紋和外眥紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約27,500pg(例如,27,500pg±10%)修飾的bont/a,用于治療眉間紋和外眥紋,例如總劑量可為27,500pg修飾的bont/a,用于治療眉間紋和外眥紋。因此,可向受試者施用約27,500pg(例如27,500pg±10%)修飾的bont/a以治療眉間紋和外眥紋,例如可向受試者施用27,500pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)用于治療眉間紋和外眥紋。

      251、實施眉間紋和外眥紋治療方案時施用的總劑量可為31,000pg至33,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用31,000pg至33,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)用于治療眉間紋和外眥紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約32,000pg(例如,32,000pg±10%)修飾的bont/a以治療眉間紋和外眥紋,例如總劑量可為32,000pg修飾的bont/a以治療眉間紋和外眥紋。因此,可向受試者施用約32,000pg(例如32,000pg±10%)修飾的bont/a用于治療眉間紋和外眥紋,例如可向受試者施用32,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)用于治療眉間紋和外眥紋。

      252、實施眉間紋和外眥紋治療方案時施用的總劑量可為35,000pg至37,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用35,000pg至37,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋和外眥紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約36,000pg(例如,36,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療眉間紋和外眥紋,例如總劑量可為36,000pg修飾的bont/a,用于治療眉間紋和外眥紋。因此,可向受試者施用約36,000pg(例如36,000pg±10%)修飾的bont/a以治療眉間紋和外眥紋,例如可向受試者施用36,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋和外眥紋。

      253、實施眉間紋和外眥紋治療方案時施用的總劑量可為43,000至44,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用43,000至44,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋和外眥紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約44,000pg(例如,44,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療眉間紋和外眥紋,例如總劑量可為44,000pg修飾的bont/a,用于治療眉間紋和外眥紋。因此,可向受試者施用約44,000pg(例如44,000pg±10%)修飾的bont/a以治療眉間紋和外眥紋,例如可向受試者施用44,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋和外眥紋。

      254、實施額頭紋和外眥紋的治療方案時施用的總劑量可為18,000pg至26,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用18,000pg至26,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療額頭紋和外眥紋。例如,總劑量可為19,000pg至21,000pg修飾的bont/a,以治療額頭紋和外眥紋。因此,可以向受試者施用19,000pg至21,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療額頭紋和外眥紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約20,000pg(例如20,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療額頭紋和外眥紋,例如總劑量可為20,000pg修飾的bont/a,用于治療額頭紋和外眥紋。因此,可以向受試者施用約20,000pg(例如20,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療額頭紋和外眥紋,例如可以向受試者施用20,000pg的修飾bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)用于治療額頭紋和外眥紋。

      255、實施額頭紋和外眥紋的治療方案時施用的總劑量可為27,000pg至28,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用27,000pg至28,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)用于治療額頭紋和外眥紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約27,500pg(例如,27,500pg±10%)修飾的bont/a,用于治療額頭紋和外眥紋,例如總劑量可為27,500pg修飾的bont/a,用于治療額頭紋和外眥紋。因此,可向受試者施用約27,500pg(例如27,500pg±10%)修飾的bont/a來治療額頭紋和外眥紋,例如可向受試者施用27,500pg修飾的bont/a(例如,通過本文描述的多個單位劑量)用于治療額頭紋和外眥紋。

      256、實施額頭紋和外眥紋的治療方案時施用的總劑量可為31,000pg至33,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用31,000pg至33,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療額頭紋和外眥紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約32,000pg(例如,32,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療額頭紋和外眥紋,例如總劑量可為32,000pg修飾的bont/a,用于治療額頭紋和外眥紋。因此,可向受試者施用約32,000pg(例如32,000pg±10%)修飾的bont/a來治療額頭紋和外眥紋,例如可向受試者施用32,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)來治療額頭紋和外眥紋。

      257、實施額頭紋和外眥紋的治療方案時施用的總劑量可為43,000至44,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用43,000至44,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療額頭紋和外眥紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約44,000pg(例如,44,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療額頭紋和外眥紋,例如總劑量可為44,000pg修飾的bont/a,用于治療額頭紋和外眥紋。因此,可向受試者施用約44,000pg(例如44,000pg±10%)修飾的bont/a來治療額頭紋和外眥紋,例如可向受試者施用44,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)用于治療額頭紋和外眥紋。

      258、實施眉間紋、額頭紋和外眥紋的治療方案時施用的總劑量可為43,000至44,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用43,000至44,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋、額頭紋和外眥紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約44,000pg(例如,44,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療眉間紋、額頭紋和外眥紋,例如總劑量可為44,000pg修飾的bont/a,用于治療眉間紋、額頭紋和外眥紋。因此,可向受試者施用約44,000pg(例如44,000pg±10%)修飾的bont/a以治療眉間紋、額頭紋和外眥紋,例如可向受試者施用44,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)用于治療眉間紋、額頭紋和外眥紋。

      259、實施治療眉間紋、額頭紋和外眥紋的方案時施用的總劑量可為60,000至70,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用60,000至70,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋、額頭紋和外眥紋。實施眉間紋、額頭紋和外眥紋的治療方案時施用的優(yōu)選總劑量可為63,000至65,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用63,000至65,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋、額頭紋和外眥紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約64,000pg(例如64,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療眉間紋、額頭紋和外眥紋,例如總劑量可為64,000pg修飾的bont/a,用于治療眉間紋、額頭紋和外眥紋。因此,可以向受試者施用約64,000pg(例如64,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療眉間紋、額頭紋和外眥紋,例如可以向受試者施用64,000pg修飾的bont/a(例如通過本文所述的多個單位劑量)用于治療眉間紋、額頭紋和外眥紋。

      260、實施眉間紋、額頭紋和外眥紋的治療方案時施用的總劑量可為75,000pg至88,000pg修飾的bont/a。因此,可以向受試者施用75,000pg至88,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)以治療眉間紋、額頭紋和外眥紋。特別優(yōu)選的總劑量可為約80,000pg(例如,80,000pg±10%)修飾的bont/a,用于治療眉間紋、額頭紋和外眥紋,例如總劑量可為80,000pg修飾的bont/a,用于治療眉間紋、額頭紋和外眥紋。因此,可向受試者施用約80,000pg(例如80,000pg±10%)修飾的bont/a用于治療眉間紋、額頭紋和外眥紋,例如可向受試者施用80,000pg修飾的bont/a(例如,通過本文所述的多個單位劑量)用于治療眉間紋、額頭紋和外眥紋。

      261、當治療眉間紋、額頭紋和外眥紋時,總劑量可高達88,000pg(例如最多80,000pg)。

      262、技術(shù)人員將考慮受試者最近是否接受過(或隨后是否接受過)梭菌神經(jīng)毒素(例如bont)的額外治療,例如作為美容治療或不同適應(yīng)癥治療的一部分。使用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù),技術(shù)人員將相應(yīng)地調(diào)整本治療方案。

      263、根據(jù)本發(fā)明,對多塊肌肉的施用優(yōu)選在同一治療過程中進行。

      264、與未修飾的bont/a(例如)相比,本發(fā)明的修飾的bont/a優(yōu)選具有更長的作用持續(xù)時間。術(shù)語“治療面部紋的持續(xù)時間比未修飾bont/a治療的持續(xù)時間更長”可能意味著與施用未修飾bont/a相比,施用本發(fā)明的修飾的bont/a后面部紋減少的時間更長。所述作用持續(xù)時間可以至少為1.25×、1.5×、1.75×、2.0×或2.25×。修飾的bont/a的作用持續(xù)時間可以為6至9個月。例如,作用持續(xù)時間可以至少為:4.5個月(從開始)、5.0個月、5.5個月、6個月、6.5個月、7.0個月、7.5個月、8.0個月、8.5個月或9.0個月。在特定實施方案中,作用持續(xù)時間可以大于9.0個月。優(yōu)選地,作用持續(xù)時間可以大于9.0個月。所述減少可以通過與表現(xiàn)出等效癥狀的等效對照受試者進行比較來確定,所述等效癥狀已經(jīng)用未修飾的bont/a治療。在對照受試者的一種或多種癥狀的嚴重程度與未修飾的bont/a治療之前基本相同(例如相同)的時間段內(nèi),用根據(jù)本發(fā)明的修飾的bont/a治療的受試者可以表現(xiàn)出等效的一種或多種癥狀的改善,與用修飾的bont/a治療之前的一種或多種癥狀的嚴重程度相比,改善至少5%、10%、25%或50%。未修飾的bont/a優(yōu)選為以雙鏈形式存在的seq?id?no:2。換句話說,本文所述的未修飾的bont/a優(yōu)選為seq?id?no:2的雙鏈形式。

      265、可以在施用修飾的bont/a后的適當時間段重復(fù)治療。鑒于作用持續(xù)時間約為未修飾的bont/a(例如)的兩倍,因此后續(xù)施用之間的間隔比用未修飾的bont/a(例如)治療受試者時適當更長??梢栽谇按问┯煤笾辽?8、20、25或30周向受試者再次施用根據(jù)本發(fā)明的修飾的bont/a。例如,可以在前次施用后至少18-45周、優(yōu)選20-35周向受試者再次施用根據(jù)本發(fā)明的修飾的bont/a。

      266、本文所用的“受試者”可為哺乳動物,例如人類或其他哺乳動物。優(yōu)選地,“受試者”是指人類受試者。受試者優(yōu)選為沒有與施用修飾的bont/a的肌肉相關(guān)的疾病狀態(tài)的受試者。例如,優(yōu)選地,受試者沒有眼瞼痙攣或面肌痙攣(例如典型的面肌痙攣)。特別優(yōu)選地,受試者沒有眼瞼痙攣。

      267、根據(jù)本發(fā)明進行治療的受試者可為不適合用未修飾的bont/a和/或用另一種梭菌神經(jīng)毒素進行治療的受試者。所述受試者可為對未修飾的bont/a和/或另一種梭菌神經(jīng)毒素的治療有抗性的受試者。抗性可能是由于受試者對梭菌神經(jīng)毒素產(chǎn)生免疫反應(yīng)而產(chǎn)生的,包括產(chǎn)生抗梭菌神經(jīng)毒素抗體。

      268、術(shù)語“治療(treat)”或“治療(treating)”是指面部紋的美容治療,包括預(yù)防性治療(例如,防止面部紋的出現(xiàn))以及矯正性治療(治療已有面部紋的受試者)。因此,本文所述的任何方法、使用的修飾的bont/a或用途均可適當?shù)孛枋鰹椤笆褂盟鲂揎椀腷ont/a治療所述面部紋的美容方法”。此外或替代地,本文所述的任何方法、使用的修飾的bont/a或用途均可適當?shù)孛枋鰹椤爸委熕雒娌考y的所述修飾的bont/a的非治療性用途”。

      269、優(yōu)選地,本文所用的“治療(treat)”或“治療(treating)”指矯正治療。本文所用的術(shù)語“治療(treat)”或“治療(treating)”是指面部紋和/或其癥狀。本文所述的治療可以使眉間紋的水平相對于治療前的眉間紋的水平降低至少5%、10%、25%或50%。本文所述的治療可以使額頭紋的水平相對于治療前的額頭紋的水平降低至少5%、10%、25%或50%。本文所述的治療可以使外眥紋的水平相對于治療前的外眥紋的水平降低至少5%、10%、25%或50%。本文所述的治療可以使眉間紋和外眥紋的水平相對于治療前的眉間紋和外眥紋的水平降低至少5%、10%、25%或50%。本文所述的治療可以使眉間紋和額頭紋的水平相對于治療前的眉間紋和額頭紋的水平降低至少5%、10%、25%或50%。本文所述的治療可以使外眥紋和額頭紋的水平相對于治療前的外眥紋和額頭紋的水平降低至少5%、10%、25%或50%。本文所述的治療可以使眉間紋、外眥紋和額頭紋的水平相對于治療前的眉間紋、外眥紋和額頭紋的水平降低至少5%、10%、25%或50%。

      270、bont/a梭狀芽胞桿菌屬細菌產(chǎn)生的梭菌神經(jīng)毒素的一個例子。此類梭菌神經(jīng)毒素的其他例子包括破傷風(fēng)梭菌(tent)和肉毒梭菌(bont)血清型b-g和x產(chǎn)生的毒素(參見wo2018/009903?a2),以及巴氏梭菌(c.baratii)和丁酸梭菌(c.butyricum)產(chǎn)生的毒素。所述神經(jīng)毒素具有高度效力和特異性,可毒害神經(jīng)元和它們所遞送到的其他細胞。梭菌毒素是已知的最強毒素之一。例如,肉毒桿菌神經(jīng)毒素對小鼠的半數(shù)致死量(ld50)值范圍為0.5至5ng/kg,具體取決于血清型。破傷風(fēng)和肉毒桿菌毒素均通過抑制受影響神經(jīng)元的功能起作用,特別是抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。肉毒桿菌毒素作用于神經(jīng)肌肉接頭并抑制周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的膽堿能傳遞,而破傷風(fēng)毒素作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

      271、自然界中,梭菌神經(jīng)毒素(包括bont/a)合成為單鏈多肽,該多肽在翻譯后通過蛋白水解切割事件進行修飾,形成由二硫鍵連接在一起的兩條多肽鏈。切割發(fā)生在特定的切割位點,通常稱為活化位點(例如活化環(huán)),該位點位于提供鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基之間。這種雙鏈形式是毒素的活性形式。這兩條鏈被稱為重鏈(h鏈)(其分子量約為100kda)和輕鏈(l鏈)(其分子量約為50kda)。h鏈包含n端易位成分(hn結(jié)構(gòu)域)和c端靶向成分(hc結(jié)構(gòu)域)。切割位點位于l鏈和易位結(jié)構(gòu)域成分之間。在hc結(jié)構(gòu)域與其靶神經(jīng)元結(jié)合并在通過內(nèi)體內(nèi)化將結(jié)合的毒素內(nèi)化到細胞內(nèi)之后,hn結(jié)構(gòu)域?qū)鏈轉(zhuǎn)移穿過內(nèi)體膜并進入細胞溶膠,而l鏈則提供蛋白酶功能(也稱為非細胞毒性蛋白酶(non-cytotoxic?protease))。

      272、非細胞毒性蛋白酶通過蛋白水解切割細胞內(nèi)運輸?shù)鞍?稱為snare蛋白,例如snap-25、vamp或syntaxin)起作用-參見gerald?k(2002)《細胞與分子生物學(xué)》(第4版)約翰·威利父子出版公司("cell?and?molecular?biology”(4th?edition)john?wiley&sons,inc.)。首字母縮略詞snare源自術(shù)語可溶性nsf附著受體(soule?nsf?attachmentreceptor),其中nsf表示n-乙基馬來酰亞胺敏感因子(n-ethylmaleimide-sensitive-facor)。snare蛋白是細胞內(nèi)囊泡融合不可或缺的,因此也是通過囊泡運輸從細胞中分泌分子不可或缺的。蛋白酶功能是鋅依賴性內(nèi)切肽酶活性,并對snare蛋白表現(xiàn)出高底物特異性。因此,一旦遞送到所需的靶細胞,非細胞毒性蛋白酶就能夠抑制靶細胞的細胞分泌。梭菌毒素的l鏈蛋白酶是非細胞毒性蛋白酶,可切割snare蛋白。

      273、鑒于snare蛋白的普遍存在性,肉毒桿菌毒素等梭菌神經(jīng)毒素已成功應(yīng)用于多種治療。

      274、肉毒梭菌和破傷風(fēng)梭菌產(chǎn)生毒素的遺傳基礎(chǔ)的更多詳細信息,請參閱henderson等人(1997)出版的《梭菌:分子生物學(xué)和發(fā)病機制》,美國學(xué)術(shù)出版社。

      275、如上所述,梭菌神經(jīng)毒素由兩條多肽鏈組成,重鏈(h鏈)的分子量約為100kda,輕鏈(l鏈)的分子量約為50kda。h鏈包含c端靶向成分(受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或hc結(jié)構(gòu)域)和n端易位成分(hn結(jié)構(gòu)域)。

      276、梭菌神經(jīng)毒素結(jié)構(gòu)域在下文中更詳細地描述。

      277、l鏈參考序列的示例包括:

      278、a型肉毒桿菌神經(jīng)毒素:氨基酸殘基1-448

      279、b型肉毒桿菌神經(jīng)毒素:氨基酸殘基1-440

      280、上述參考序列應(yīng)被視為指南,因為根據(jù)亞血清型可能會出現(xiàn)輕微的變化。例如,us2007/0166332(在此以引用的方式全文并入)引用了略有不同的梭菌序列:

      281、a型肉毒桿菌神經(jīng)毒素:氨基酸殘基m1-k448

      282、b型肉毒桿菌神經(jīng)毒素:氨基酸殘基m1-k441

      283、易位結(jié)構(gòu)域是梭菌神經(jīng)毒素h鏈的片段,約相當于h鏈的氨基末端一半,或?qū)?yīng)于完整h鏈中該片段的結(jié)構(gòu)域。

      284、參考易位結(jié)構(gòu)域的示例包括:

      285、a型肉毒桿菌神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(449-871)

      286、b型肉毒桿菌神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(441-858)

      287、上述參考序列應(yīng)被視為指南,因為根據(jù)亞血清型可能會出現(xiàn)輕微變化。例如,us2007/0166332(在此通過引用并入)引用了略有不同的梭菌序列:

      288、a型肉毒桿菌神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(a449-k871)

      289、b型肉毒桿菌神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(a442-s858)

      290、在本發(fā)明的上下文中,多種包含易位結(jié)構(gòu)域的bont/ahn區(qū)域可用于本發(fā)明的方面。bont/a重鏈的hn區(qū)域長度約為410-430個氨基酸,并包含易位結(jié)構(gòu)域。研究表明,梭菌神經(jīng)毒素重鏈的hn區(qū)域的整個長度對于易位結(jié)構(gòu)域的易位活性而言并非必需的。因此,該實施方案的方面可以包括包含易位結(jié)構(gòu)域的bont/ahn區(qū)域,該易位結(jié)構(gòu)域的長度例如為至少350個氨基酸、至少375個氨基酸、至少400個氨基酸或至少425個氨基酸。該實施方案的其它方面可以包括包含易位結(jié)構(gòu)域的bont/a?hn區(qū)域,該易位結(jié)構(gòu)域的長度例如為最多350個氨基酸、最多375個氨基酸、最多400個氨基酸或最多425個氨基酸。

      291、術(shù)語hn涵蓋天然存在的bont/a?hn部分,以及具有自然界中不存在的氨基酸序列和/或合成氨基酸殘基的修飾的bont/a?hn部分。優(yōu)選地,所述修飾的bont/a?hn部分仍表現(xiàn)出上述的易位功能。

      292、梭菌神經(jīng)毒素受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc)參考序列的示例包括:

      293、bont/a——n872-l1296

      294、bont/b——e859-e1291

      295、梭菌神經(jīng)毒素(如bont)的~50kda?hc結(jié)構(gòu)域包含兩個不同的結(jié)構(gòu)特征,稱為hcc和hcn結(jié)構(gòu)域,每個結(jié)構(gòu)特征通常為~25kda。參與受體結(jié)合的氨基酸殘基被認為主要位于hcc結(jié)構(gòu)域中。天然梭菌神經(jīng)毒素的hc結(jié)構(gòu)域可包含約400-440個氨基酸殘基。該事實由以下出版物證實,每個出版物均通過引用整體并入本文:umland?tc(1997)nat.struct.biol.4:788-792;herreros?j(2000)biochem.j.347:199-204;halpern?j(1993)j.biol.chem.268:15,pp.11188-11192;rummel?a?(2007)pnas104:359-364;lacey?db(1998)nat.struct.biol.5:898-902;knapp(1998)am.cryst.assoc.abstract?papers?25:90;swaminathan和eswaramoorthy(2000)nat.struct.biol.7:1751-1759;以及rummel?a(2004)mol.microbiol.51(3),631-643。

      296、hcn結(jié)構(gòu)域的示例(參考)包括:

      297、a型肉毒桿菌神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(872-1110)

      298、b型肉毒桿菌神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(859-1097)

      299、上述序列位置可能根據(jù)血清型/亞型略有不同,(參考)hcn結(jié)構(gòu)域的進一步例子包括:

      300、a型肉毒桿菌神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(874-1110)

      301、b型肉毒桿菌神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(861-1097)

      302、hcc結(jié)構(gòu)域的示例(參考)包括:

      303、a型肉毒桿菌神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(y1111-l1296)

      304、b型肉毒桿菌神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(y1098-e1291)

      305、wo?2017/191315?a1(以引用的方式并入本文)教導(dǎo)了修飾的bont/a(例如“嵌合梭菌神經(jīng)毒素”)及其制備和制造方法。因此,用于本發(fā)明的包含肉毒桿菌神經(jīng)毒素a(bont/a)輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域(bont/a?hn)以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)的修飾的bont/a可為wo?2017/191315?a1中教導(dǎo)的修飾的bont/a。

      306、修飾的bont/a可稱為“嵌合梭菌神經(jīng)毒素(chimeric?clostridialneurotoxin)”。本文所用的術(shù)語“嵌合梭菌神經(jīng)毒素”或“嵌合神經(jīng)毒素”是指包含來自第一梭菌神經(jīng)毒素血清型的梭菌神經(jīng)毒素輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域(hn結(jié)構(gòu)域)以及源自第二不同梭菌神經(jīng)毒素血清型的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)(優(yōu)選由其組成)的神經(jīng)毒素。具體而言,用于本發(fā)明的經(jīng)修飾的bont/a(例如嵌合梭菌神經(jīng)毒素)包含肉毒桿菌神經(jīng)毒素a(bont/a)輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域(hn結(jié)構(gòu)域)以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)。經(jīng)修飾的bont/a(例如嵌合梭菌神經(jīng)毒素)的bont/a?lhn結(jié)構(gòu)域與bont/b?hc結(jié)構(gòu)域共價連接。本發(fā)明的修飾的bont/a(例如嵌合梭菌神經(jīng)毒素)可稱為嵌合肉毒桿菌神經(jīng)毒素。所述嵌合梭菌神經(jīng)毒素在本文中也稱為“bont/ab”、“mrbont/ab”或“bont/ab嵌合體”。

      307、l鏈和hn結(jié)構(gòu)域(任選地包括完整或部分活化環(huán),例如當修飾的bont/a為單鏈形式時為完整活化環(huán),當修飾的bont/a為雙鏈形式時為切割的/部分活化環(huán))可統(tǒng)稱為lhn結(jié)構(gòu)域。因此,lhn結(jié)構(gòu)域不進一步包括hc結(jié)構(gòu)域。

      308、修飾的bont/a可能基本上由肉毒桿菌神經(jīng)毒素a(bont/a)輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域(hn結(jié)構(gòu)域)以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)組成。

      309、術(shù)語“基本上由……組成”是指修飾的bont/a不進一步包含賦予多肽額外功能(例如,當施用于受試者時)的一個或多個氨基酸殘基。換句話說,“基本上由”肉毒桿菌神經(jīng)毒素a(bont/a)輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域(hn結(jié)構(gòu)域)以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)組成的多肽可以進一步包含一個或多個氨基酸殘基(與肉毒桿菌毒素a(bont/a)輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域(hn結(jié)構(gòu)域)以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)的氨基酸殘基相同),但所述一個或多個其他氨基酸殘基不賦予多肽額外功能(例如,當施用于受試者時)。額外功能可以包括酶活性、結(jié)合活性和/或任何生理活性。

      310、除任何梭菌神經(jīng)毒素序列外修飾的bont/a還可包含非梭菌神經(jīng)毒素序列,只要非梭菌神經(jīng)毒素序列不破壞修飾的bont/a(例如,嵌合梭菌神經(jīng)毒素)實現(xiàn)其治療效果的能力即可。優(yōu)選地,非梭菌神經(jīng)毒素序列不是具有催化活性(例如,酶活性)的序列。在一個實施方案中,本發(fā)明的修飾的bont/a不包含非梭菌催化活性結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中,修飾的bont/a不包含進一步的催化活性結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中,非梭菌序列不是與細胞受體結(jié)合的序列。換句話說,在一個實施方案中,非梭菌序列不是細胞受體的配體。細胞受體可為蛋白質(zhì)細胞受體,例如整合膜蛋白。細胞受體的例子可以在iuphar?guide?topharmacology?database,2019.4版中找到,網(wǎng)址為https://www.guidetopharmacology.org/download.jsp#db_reports。非梭菌神經(jīng)毒素序列可以包括有助于純化的標簽,例如his標簽。在一個實施方案中,本發(fā)明的修飾的bont/a不包含標簽或用于添加標簽的位點,例如分選酶受體或供體位點。

      311、優(yōu)選地,修飾的bont/a可以由肉毒桿菌神經(jīng)毒素a(bont/a)輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域(hn結(jié)構(gòu)域)以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)組成。

      312、修飾的bont/a包含輕鏈,該輕鏈能夠表現(xiàn)出非細胞毒性蛋白酶活性并能夠在靶神經(jīng)元的胞質(zhì)溶膠中切割snare蛋白。可使用基于細胞的和體內(nèi)的測定來確定包含l鏈和功能性細胞結(jié)合和易位結(jié)構(gòu)域的梭菌神經(jīng)毒素是否具有非細胞毒性蛋白酶活性。本領(lǐng)域中常規(guī)使用諸如趾外展評分(das)測定、背根神經(jīng)節(jié)(drg)測定、脊髓神經(jīng)元(scn)測定和小鼠中膈神經(jīng)偏側(cè)膈(pnhd)測定之類的測定。用于確定非細胞毒性蛋白酶活性的合適測定可為aokikr,toxicon?39:1815-1820;2001或donald等人(2018),pharmacol?res?perspect,e00446,1-14中描述的測定,其通過引用并入本文。

      313、當施用于受試者時,修飾的bont/a優(yōu)選處于其活性雙鏈形式,其中輕鏈和重鏈通過二硫鍵連接在一起。當bont/a(例如修飾的bont/a)在本文中通過多肽序列(seq?id?no)定義時,序列(seq?id?no)的l鏈部分可構(gòu)成雙鏈梭菌神經(jīng)毒素(例如雙鏈修飾的bont/a)的第一鏈,并且hn和hc結(jié)構(gòu)域一起可構(gòu)成雙鏈梭菌神經(jīng)毒素(例如雙鏈修飾的bont/a)的第二鏈,其中第一鏈和第二鏈通過二硫鍵連接在一起。技術(shù)人員將理解蛋白酶可在梭菌神經(jīng)毒素(例如修飾的bont/a)的活化環(huán)內(nèi)的一個或多個位置處進行切割,優(yōu)選在活化環(huán)內(nèi)的兩個位置處切割。當切割發(fā)生在活化環(huán)內(nèi)的多于一個位置(優(yōu)選兩個位置)時,序列的c末端l鏈部分的小片段可能不存在于雙鏈梭菌神經(jīng)毒素序列(例如雙鏈修飾的bont/a)中。鑒于此,雙鏈梭菌神經(jīng)毒素(例如雙鏈修飾的bont/a)的序列可能與相應(yīng)的單鏈梭菌神經(jīng)毒素(例如單鏈修飾的bont/a)的序列略有不同。該小片段可為1-15個氨基酸。具體地,在一個實施方案中,當使用lys-c將單鏈修飾的bont/a轉(zhuǎn)換為雙鏈修飾的bont/a時,序列的c末端l鏈部分中不存在的小片段可為seq?id?no:9或10。

      314、最優(yōu)選地,用于本發(fā)明的修飾的bont/a可包含bont/a輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域(bont/alhn結(jié)構(gòu)域)和bont/b?hc結(jié)構(gòu)域。bont/a?lhn結(jié)構(gòu)域與bont/bhc結(jié)構(gòu)域共價連接。所述修飾的bont/a在本文中也稱為“bont/ab”或“bont/ab嵌合體”。

      315、lhn結(jié)構(gòu)域的c端氨基酸殘基可以對應(yīng)于分隔bont/a的lhn和hc結(jié)構(gòu)域的310螺旋的第一氨基酸殘基,并且hc結(jié)構(gòu)域的n端氨基酸殘基可以對應(yīng)于分隔bont/b中的lhn和hc結(jié)構(gòu)域的310螺旋的第二氨基酸殘基。

      316、bont/a多肽序列的一個例子如seq?id?no:2所示。

      317、bont/b多肽序列的一個例子是seq?id?no:8(uniprot登記號b1inp5)。

      318、本文提及的分隔bont/a的lhn和hc結(jié)構(gòu)域的310螺旋的第一氨基酸殘基”是指分隔lhn和hc結(jié)構(gòu)域的310螺旋的n端殘基。

      319、分隔bont/b的lhn和hc結(jié)構(gòu)域的310螺旋的第二個氨基酸殘基”是指分隔lhn和hc結(jié)構(gòu)域的310螺旋的n端殘基之后的氨基酸殘基。

      320、“310螺旋”是蛋白質(zhì)和多肽中發(fā)現(xiàn)的一種二級結(jié)構(gòu),與α螺旋、β折疊和反向轉(zhuǎn)彎一起存在。310螺旋中的氨基酸排列成右手螺旋結(jié)構(gòu),其中每個完整轉(zhuǎn)彎由三個殘基和十個原子完成,這些原子將它們之間的分子內(nèi)氫鍵分開。每個氨基酸對應(yīng)于螺旋中的120°轉(zhuǎn)彎(即螺旋每個轉(zhuǎn)彎有三個殘基),沿螺旋軸平移(=0.2nm),并且在通過形成氫鍵形成的環(huán)中有10個原子。最重要的是,氨基酸的nh基團與三個殘基之前的氨基酸的c=o基團形成氫鍵;這種重復(fù)的i+3→i氫鍵定義了310螺旋。310螺旋是結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的標準概念,本領(lǐng)域技術(shù)人員對此很熟悉。

      321、此310螺旋對應(yīng)于形成實際螺旋的四個殘基和兩個帽(或過渡)殘基,這四個殘基的兩端各有一個帽殘基。本文使用的術(shù)語“分隔lhn和hc結(jié)構(gòu)域的310螺旋”由這6個殘基組成。

      322、通過進行結(jié)構(gòu)分析和序列比對,確定了一條310螺旋,該螺旋將lhn和hc結(jié)構(gòu)域分隔開來。該310螺旋的n端(即lhn結(jié)構(gòu)域的c端部分)被α螺旋包圍,c端(即hc結(jié)構(gòu)域的n端部分)被β鏈包圍。310螺旋的第一個(n端)殘基(帽或過渡殘基)螺旋也對應(yīng)于該α螺旋的c端殘基。

      323、分隔lhn和hc結(jié)構(gòu)域的310螺旋可以通過例如公開可用的肉毒桿菌神經(jīng)毒素晶體結(jié)構(gòu)確定,例如3bta(http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureid=3bta)和1epw(http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureid=1epw)分別代表肉毒桿菌神經(jīng)毒素a1和b1。

      324、公開可用的計算機建模和比對工具也可用于確定其他神經(jīng)毒素中分隔lhn和hc結(jié)構(gòu)域的310螺旋的位置,例如同源性建模服務(wù)器loopp(學(xué)習(xí)、觀察和輸出蛋白質(zhì)模式,http://loopp.org)、phyre(蛋白質(zhì)同源性/模擬識別引擎,http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)和rosetta(https://www.rosettacommons.org/)、蛋白質(zhì)疊加服務(wù)器superpose(http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)、比對程序clustal?omega(http://www.clustal.org/omega/)以及分子和細胞生物學(xué)家互聯(lián)網(wǎng)資源(http://molbiol-tools.ca/)中列出的許多其他工具/服務(wù)。特別是“hn/hcn”連接處周圍的區(qū)域可能在結(jié)構(gòu)上高度保守,這使其成為疊加不同血清型的理想?yún)^(qū)域。

      325、例如,可采用以下方法確定其他神經(jīng)毒素中該310螺旋的序列:

      326、1.結(jié)構(gòu)同源性建模工具loop(http://loopp.org)可用于基于bont/a1晶體結(jié)構(gòu)(3bta.pdb)獲取其他bont血清型的預(yù)測結(jié)構(gòu);

      327、2.這樣獲得的結(jié)構(gòu)(pdb)文件可以編輯為僅包含hcn結(jié)構(gòu)域的n末端及其之前約80個殘基(屬于hn結(jié)構(gòu)域的一部分),從而保留結(jié)構(gòu)上高度保守的“hn/hcn”區(qū)域;

      328、3.蛋白質(zhì)疊加服務(wù)器superpose(http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)可用于將每種血清型疊加到3bta.pdb結(jié)構(gòu)上;

      329、4.可以檢查疊加的pdb文件來定位bont/a1的hc結(jié)構(gòu)域起始處的310螺旋,然后可以識別另一血清型中的相應(yīng)殘基。

      330、5.可以將其他bont血清型序列與clustal?omega比對,以檢查相應(yīng)殘基是否正確。

      331、lhn、hc和310螺旋結(jié)構(gòu)域的示例如下所示:

      332、

      333、

      334、通過結(jié)構(gòu)分析和序列比對發(fā)現(xiàn),在所有肉毒桿菌和破傷風(fēng)神經(jīng)毒素中,分隔lhn和hc結(jié)構(gòu)域的310螺旋之后的β鏈都是保守結(jié)構(gòu),并且從分隔lhn和hc結(jié)構(gòu)域的310螺旋的第一個殘基開始時,從第8個殘基開始(例如,對于bont/a1,從殘基879開始)。

      335、bont/ab嵌合體可以包含與來自bont/b的hc結(jié)構(gòu)域共價連接的來自bont/a的lhn結(jié)構(gòu)域,其中l(wèi)hn結(jié)構(gòu)域的c末端氨基酸殘基對應(yīng)于位于bont/a的hc結(jié)構(gòu)域起點(n末端)的β鏈的n末端第八個氨基酸殘基,并且其中hc結(jié)構(gòu)域的n末端氨基酸殘基對應(yīng)于位于bont/b的hc結(jié)構(gòu)域起點(n末端)的β鏈的n末端第七個氨基酸殘基。

      336、bont/ab嵌合體可以包含與來自bont/b的hc結(jié)構(gòu)域共價連接的來自bont/a的lhn結(jié)構(gòu)域,其中l(wèi)hn結(jié)構(gòu)域的c末端氨基酸殘基對應(yīng)于位于bont/a的lhn結(jié)構(gòu)域末端(c末端)的α螺旋的c末端氨基酸殘基,并且其中hc結(jié)構(gòu)域的n末端氨基酸殘基對應(yīng)于緊鄰位于bont/b的lhn結(jié)構(gòu)域末端(c末端)的α螺旋的c末端氨基酸殘基的c末端的氨基酸殘基。

      337、bont/ab嵌合體的設(shè)計原理是盡量確保二級結(jié)構(gòu)不受影響,從而盡量減少對三級結(jié)構(gòu)和每個結(jié)構(gòu)域功能的任何改變。不受理論的束縛,假設(shè)通過不破壞310螺旋的四個中心氨基酸殘基,可以確保修飾的bont/a(例如嵌合神經(jīng)毒素)具有最佳構(gòu)象,從而使修飾的bont/a(例如嵌合神經(jīng)毒素)能夠充分發(fā)揮其功能。

      338、事實上,令人驚訝的是,僅保留bont/a的310螺旋的第一個氨基酸殘基和bont/b的310螺旋以后的第二個氨基酸殘基,不僅可以產(chǎn)生可溶的、功能性的bont/ab嵌合體,而且可以產(chǎn)生優(yōu)于其他bont/ab嵌合體的特性,特別是效力提高、安全比提高和/或作用持續(xù)時間延長(以及與未修飾的bont/a-例如seq?id?no:2,如雙鏈形式的seq?id?no:2相比,安全比提高和/或作用持續(xù)時間增加)。

      339、bont/a輕鏈、bont/a易位結(jié)構(gòu)域和/或bont/b?hc結(jié)構(gòu)域可為修飾的bont/a輕鏈、bont/a易位結(jié)構(gòu)域和/或bont/b?hc結(jié)構(gòu)域或其衍生物,包括但不限于下文所述的那些。修飾的bont/a輕鏈、bont/a易位結(jié)構(gòu)域和/或bont/b?hc結(jié)構(gòu)域或衍生物可含有一個或多個與bont/a輕鏈、bont/a易位結(jié)構(gòu)域和/或bont/b?hc結(jié)構(gòu)域的天然(未修飾)形式相比已被修飾的氨基酸,或者可含有一個或多個插入的氨基酸,這些氨基酸在bont/a輕鏈、bont/a易位結(jié)構(gòu)域和/或bont/b?hc結(jié)構(gòu)域的天然(未修飾)形式中不存在。舉例來說,相對于天然(未修飾)bont/a輕鏈、bont/a易位結(jié)構(gòu)域和/或bont/b?hc結(jié)構(gòu)域序列,修飾的bont/a輕鏈、bont/a易位結(jié)構(gòu)域和/或bont/b?hc結(jié)構(gòu)域可在一個或多個結(jié)構(gòu)域中具有修飾的氨基酸序列。此類修飾可修飾其功能方面,例如生物活性或持久性。因此,在一個實施方案中,bont/a輕鏈、bont/a易位結(jié)構(gòu)域和/或bont/b?hc結(jié)構(gòu)域是修飾的bont/a輕鏈、bont/a易位結(jié)構(gòu)域和/或bont/b?hc結(jié)構(gòu)域,或修飾的bont/a輕鏈、bont/a易位結(jié)構(gòu)域和/或bont/b?hc結(jié)構(gòu)域衍生物。

      340、修飾的bont/b?hc結(jié)構(gòu)域可具有一個或多個修飾,以改變與靶神經(jīng)細胞的結(jié)合,例如與天然(未修飾)bont/b?hc結(jié)構(gòu)域相比,提供更高或更低的親和力結(jié)合。bont/b?hc結(jié)構(gòu)域中的此類修飾可包括修飾hc結(jié)構(gòu)域的神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合位點或蛋白質(zhì)(例如突觸結(jié)合蛋白)結(jié)合位點中的殘基,從而改變與靶神經(jīng)細胞的神經(jīng)節(jié)苷脂受體和/或蛋白質(zhì)受體的結(jié)合。此類修飾的神經(jīng)毒素的例子在wo?2006/027207和wo?2006/114308中有所描述,這兩篇文獻均以引用的方式全文并入本文。

      341、修飾的輕鏈可在其氨基酸序列中具有一個或多個修飾,例如底物結(jié)合或催化結(jié)構(gòu)域中的修飾,其可改變或修飾修飾的輕鏈的snare蛋白特異性,優(yōu)選條件是所述修飾不會催化失活所述輕鏈。此類修飾的神經(jīng)毒素的例子在wo?2010/120766和us2011/0318385中描述,兩者均通過引用全文并入本文。

      342、bont/a的lhn結(jié)構(gòu)域可對應(yīng)于seq?id?no:2的氨基酸殘基1至872,或與其具有至少70%序列同一性的多肽序列。bont/a的lhn結(jié)構(gòu)域可對應(yīng)于seq?id?no:2的氨基酸殘基1至872,或與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的多肽序列。優(yōu)選地,bont/a的lhn結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于seq?id?no:2的氨基酸殘基1至872。

      343、bont/b的hc結(jié)構(gòu)域可對應(yīng)于seq?id?no:8的氨基酸殘基860至1291,或與其具有至少70%序列同一性的多肽序列。bont/b的hc結(jié)構(gòu)域可對應(yīng)于seq?id?no:8的氨基酸殘基860至1291,或與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的多肽序列。優(yōu)選地,bont/b的hc結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于seq?id?no:8的氨基酸殘基860至1291。

      344、優(yōu)選地,bont/ab嵌合體包含bont/a1?lhn結(jié)構(gòu)域和bont/b1?hc結(jié)構(gòu)域。更優(yōu)選地,lhn結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于bont/a1(seq?id?no:2)的氨基酸殘基1至872,而hc結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于bont/b1(seq?id?no:8)的氨基酸殘基860至1291。

      345、最優(yōu)選地,bont/b?hc結(jié)構(gòu)域還包含hcc亞結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸殘基取代、插入、插入缺失(indel)或缺失,與天然bont/b序列相比,所述hcc亞結(jié)構(gòu)域具有增加bont/b神經(jīng)毒素對人sytii的結(jié)合親和力的效果。wo?2013/180799和wo?2016/154534(均通過引用并入本文)中公開了bont/b?hcc亞結(jié)構(gòu)域中的合適氨基酸殘基取代、插入、插入缺失或缺失。

      346、hcc亞結(jié)構(gòu)域中的合適氨基酸殘基取代、插入、插入缺失或缺失可以包括選自下列的取代突變:v1118m;y1183m;e1191m;e1191i;e1191q;e1191t;s1199y;s1199f;s1199l;s1201v;e1191c、e1191v、e1191l、e1191y、s1199w、s1199e、s1199h、w1178y、w1178q、w1178a、w1178s、y1183c、y1183p及其組合。

      347、hcc亞結(jié)構(gòu)域中的合適氨基酸殘基取代、插入、插入缺失或缺失還可包括選自下列的兩個取代突變的組合:e1191m和s1199l、e1191m和s1199y、e1191m和s1199f、e1191q和s1199l、e1191q和s1199y、e1191q和s1199f、e1191m和s1199w、e1191m和w1178q、e1191c和s1199w、e1191c和s1199y、e1191c和w1178q、e1191q和s1199w、e1191v和s1199w、e1191v和s1199y或e1191v和w1178q。

      348、bont/b?hcc亞結(jié)構(gòu)域中的合適的氨基酸殘基取代、插入、插入缺失或缺失還可以包括三種取代突變的組合,即e1191m、s1199w和w1178q。

      349、bont/b?hcc亞結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基取代、插入、插入/缺失或缺失包括兩個取代突變的組合,即e1191m和s1199y。此類修飾存在于例如seq?id?no:5和seq?id?no:6的修飾的bont/a(例如bont/ab嵌合體)中。e1191m可以對應(yīng)于seq?id?no:6的位置1204,而s1199y可以對應(yīng)于位置1212。因此,seq?id?no:6可以包括1204m和1212y。

      350、該修飾可為與seq?id?no:8所示的未修飾bont/b相比的修飾,其中氨基酸殘基編號通過與seq?id?no:8比對確定。由于seq?id?no:8位置1處存在甲硫氨酸殘基(以及對應(yīng)于本文所述修飾bont/a多肽的seq?id?no)是可選的,因此技術(shù)人員在確定氨基酸殘基編號時會考慮甲硫氨酸殘基的存在/不存在。例如,當seq?id?no:8包括甲硫氨酸時,位置編號將如上所定義(例如,e1191將是seq?id?no:8的e1191)?;蛘撸攕eq?id?no:8中不存在甲硫氨酸時,氨基酸殘基編號應(yīng)修改-1(例如,e1191將是seq?id?no:8的e1190)。因此,修飾的bont/a多肽序列的起始甲硫氨酸氨基酸殘基可為可選的或不存在的。當本文所述其他多肽序列的位置1處的甲硫氨酸存在/不存在時,適用類似的考慮,并且技術(shù)人員將使用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)容易地確定正確的氨基酸殘基編號。

      351、用于本發(fā)明的修飾的bont/a可包含與選自seq?id?no:3-7的多肽序列具有至少70%序列同一性的多肽序列。例如,與選自seq?id?no:3-7的多肽序列具有至少80%、90%、95%或99.9%序列同一性的多肽序列。優(yōu)選地,用于本發(fā)明的修飾的bont/a可包含選自seqid?no:3-7的多肽序列(更優(yōu)選地由其組成)。

      352、優(yōu)選修飾的bont/a包含與seq?id?no:6具有至少70%序列同一性的多肽序列。例如,與seq?id?no:6具有至少80%、90%、95%或99.9%序列同一性的多肽序列。最優(yōu)選,用于本發(fā)明的修飾的bont/a可以包含(更優(yōu)選由其組成)seq?id?no:6。

      353、本文所用的術(shù)語“缺失”是指多肽中一個或多個氨基酸殘基被去除,而缺失位點的一個或多個氨基酸殘基未被替換。因此,當從具有x個氨基酸殘基的多肽序列(例如)中刪除一個氨基酸殘基時,所得多肽具有x-1個氨基酸殘基。

      354、本文所用的術(shù)語“插入缺失”是指多肽中一個或多個氨基酸殘基的缺失,以及在缺失位點插入與缺失的氨基酸殘基數(shù)不同數(shù)量的氨基酸殘基(更多或更少的氨基酸殘基)。因此,對于從具有x個氨基酸殘基(例如)的多肽序列中缺失兩個氨基酸殘基的插入缺失,所得多肽具有x-1個氨基酸殘基或x+≥1個氨基酸殘基。插入和缺失可以按任何順序進行,可以連續(xù)進行,也可以同時進行。

      355、本文所用的術(shù)語“取代”是指在同一位置用相同數(shù)量的氨基酸殘基替換一個或多個氨基酸殘基。因此,對于具有x個氨基酸殘基(例如)的多肽序列的取代,所得多肽也具有x個氨基酸殘基。優(yōu)選地,取代是在單個氨基酸位置的取代。

      356、本文所用的術(shù)語“插入”是指在插入位點處添加一個或多個多肽的氨基酸殘基,而不缺失一個或多個多肽的氨基酸殘基。因此,當將一個氨基酸殘基插入具有x個氨基酸殘基(例如)的多肽序列時,所得多肽具有x+1個氨基酸殘基。

      357、通過取代、插入或缺失氨基酸殘基來修飾蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的。例如,可以通過修飾編碼bont/a(例如編碼未修飾的bont/a)的dna序列來引入氨基酸修飾。這可以使用標準分子克隆技術(shù)來實現(xiàn),例如通過定點誘變,其中使用編碼所需氨基酸的短鏈dna(寡核苷酸)來使用聚合酶替換原始編碼序列,或者通過使用多種酶(例如連接酶和限制性內(nèi)切酶)插入/刪除基因的部分?;蛘撸梢曰瘜W(xué)合成修飾的基因序列。通常,可以通過修飾編碼天然梭菌神經(jīng)毒素(或其部分)的核酸來進行修飾,使得由核酸編碼的修飾的bont/a(或其部分)包含修飾?;蛘?,可合成編碼包含所述修飾的經(jīng)修飾的梭菌神經(jīng)毒素(或其部分)的核酸。

      358、當本文所述的修飾的bont/a的多肽序列包含標簽(例如用于純化的his標簽)時,所述標簽是可選的。優(yōu)選地,在使用根據(jù)本發(fā)明的修飾的bont/a之前去除所述標簽。

      359、如上所述,本文所述的修飾的bont/a具有增強的組織保留特性,這還提供了增強的效力和/或作用持續(xù)時間,并且可以允許增加劑量而不會產(chǎn)生任何額外的負面影響。定義這些有利特性的一種方式是修飾的bont/a的安全比。在這方面,可以通過測量相關(guān)動物模型(例如小鼠,在施用后七天內(nèi)檢測到體重減輕)中的體重減輕百分比來實驗評估梭菌毒素的不良影響(由毒素從施用位點擴散引起)。相反,可以通過趾外展評分(das)測定(一種肌肉麻痹的測量方法)來實驗評估梭菌毒素所需的中靶效應(yīng)。das測定可通過將20μl梭菌毒素(配制于明膠磷酸鹽緩沖液中)注射到小鼠腓腸肌/比目魚肌復(fù)合體中,然后使用aoki的方法(aoki?kr,toxicon?39:1815-1820;2001)評估趾外展評分來進行。在das測定中,將小鼠短暫地通過尾巴懸掛,以引發(fā)特征性的驚嚇反應(yīng),小鼠會伸展后肢并外展后指。注射梭菌毒素后,根據(jù)五分量表對不同程度的趾外展進行評分(0=正常至4=趾外展和腿部伸展最大程度減少)。

      360、然后,神經(jīng)毒素(例如,本發(fā)明的修飾的bont/a(或用于比較的未修飾的bont/a))的安全比可以表示為體重下降10%所需的毒素量(在小鼠給藥后前七天內(nèi)達到峰值效果時測量)與das評分為2所需的神經(jīng)毒素量之間的比率。因此,需要高安全比評分,并且表明神經(jīng)毒素能夠有效地麻痹靶肌肉,而幾乎沒有不良的脫靶效應(yīng)。本發(fā)明的修飾的bont/a的安全比高于等效未修飾的(天然)bont/a的安全比。

      361、高安全比在治療中特別有利,因為它代表治療指數(shù)的增加。換句話說,這意味著與替代梭菌神經(jīng)毒素療法相比,可以使用減少的劑量和/或可以使用增加的劑量而不會產(chǎn)生任何額外的(例如有害的)影響。使用更高劑量的神經(jīng)毒素而不會產(chǎn)生額外影響的可能性特別有利,因為更高的劑量通常會導(dǎo)致神經(jīng)毒素的作用時間更長。

      362、修飾的bont/a的效力可以表示為當施用于小鼠腓腸肌/比目魚肌復(fù)合體時導(dǎo)致給定das評分的神經(jīng)毒素的最小劑量,例如das評分為2(ed50劑量)或das評分為4。修飾的bont/a的效力還可以表示為在測量神經(jīng)毒素切割snare的細胞測定中的ec50劑量,例如在測量修飾的bont/a切割snap25的細胞測定中的ec50劑量。

      363、修飾的bont/a的作用持續(xù)時間可以表示為在向小鼠腓腸肌/比目魚肌復(fù)合體施用給定劑量的神經(jīng)毒素(例如導(dǎo)致das評分為4的最小劑量的神經(jīng)毒素)后恢復(fù)das評分為0所需的時間。

      364、因此,在一個實施方案中,本發(fā)明的修飾的bont/a具有大于7的安全比(例如,至少8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50),其中安全比計算如下:-10%體重變化所需的毒素劑量(pg/小鼠)除以das?ed50(pg/小鼠)[ed50=產(chǎn)生das評分2所需的劑量]。例如,修飾的bont/a可具有至少8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50的安全比。

      365、在一個實施方案中,本發(fā)明的修飾的bont/a具有至少10的安全比。在一個實施方案中,本發(fā)明的修飾的bont/a具有至少15的安全比。

      366、優(yōu)選地,修飾的bont/a具有至少10的安全比(例如安全比為10),更優(yōu)選至少12或13(例如14-15)。

      367、修飾的bont/a的安全比可大于7至50,例如8-45、10-20或12-15。

      368、在使用中,本發(fā)明的修飾bont/a為雙鏈形式。

      369、用于本發(fā)明的修飾的bont/a可包含與選自seq?id?no:3-7的多肽序列具有至少70%序列同一性的多肽序列。例如,與選自seq?id?no:3-7的多肽序列具有至少80%、90%、95%或99.9%序列同一性的多肽序列。優(yōu)選地,用于本發(fā)明的修飾的bont/a可包含選自seqid?no:3-7的多肽序列(更優(yōu)選地由其組成)。在所述修飾的bont/a神經(jīng)毒素(例如嵌合梭菌神經(jīng)毒素)中,優(yōu)選seq?id?no:6。

      370、因此,優(yōu)選修飾的bont/a(例如,嵌合梭菌神經(jīng)毒素)包含與seq?id?no:6具有至少70%序列同一性的多肽序列。更優(yōu)選地,包含與seq?id?no:6具有至少80%、90%、95%或99.9%序列同一性的多肽序列。最優(yōu)選地,用于本發(fā)明的修飾的bont/a(例如,嵌合梭菌神經(jīng)毒素)可包含seq?id?no:6(更優(yōu)選地由其組成)。

      371、本發(fā)明的雙鏈修飾的bont/a可包含與seq?id?no:3-7中的任一項具有至少70%、80%、90%、95%、99.9%或100%序列同一性的多肽序列的l鏈部分,構(gòu)成雙鏈修飾的bont/a的第一鏈,并且可包含與seq?id?no:3-7中的任一項具有至少70%、80%、90%、95%、99.9%或100%序列同一性的多肽序列的hn和hc結(jié)構(gòu)域,共同構(gòu)成雙鏈修飾的bont/a的第二鏈,其中第一鏈和第二鏈通過二硫鍵連接在一起。

      372、當切割發(fā)生在包含與seq?id?no:3-7中的任一項具有至少70%、80%、90%、95%、99.9%或100%序列同一性的多肽序列的修飾的bont/a的活化環(huán)內(nèi)的多于一個位置(優(yōu)選兩個位置)上時,則與seq?id?no:3-7中任一項具有至少70%、80%、90%、95%、99.9%或100%序列同一性的序列的c端l鏈部分的小片段可能不存在于雙鏈修飾的bont/a中。鑒于此,雙鏈修飾的bont/a(例如,包含與seq?id?no:3-7中任一項具有至少70%、80%、90%、95%、99.9%或100%序列同一性的多肽序列)的序列可能與包含與seq?id?no:3-7中任一項具有至少70%、80%、90%、95%、99.9%或100%序列同一性的多肽序列的相應(yīng)單鏈修飾的bont/a的序列略有不同。小片段可為1-15個氨基酸。具體地,在一個實施方案中,當使用lys-c將單鏈修飾的bont/a轉(zhuǎn)換為雙鏈梭菌神經(jīng)毒素時,缺失的所述序列的c末端l鏈部分的小片段可為seq?id?no:9或10。

      373、優(yōu)選地,本發(fā)明的雙鏈修飾的bont/a可包含與seq?id?no:6具有至少70%、80%、90%、95%、99.9%或100%序列同一性的多肽序列的l鏈部分,構(gòu)成雙鏈修飾的bont/a的第一鏈,并且可包含與seq?id?no:6具有至少70%、80%、90%、95%、99.9%或100%序列同一性的多肽序列的hn和hc結(jié)構(gòu)域,一起構(gòu)成雙鏈修飾的bont/a的第二鏈,其中第一鏈和第二鏈通過二硫鍵連接在一起。

      374、當切割發(fā)生在包含與seq?id?no:6具有至少70%、80%、90%、95%、99.9%或100%序列同一性的多肽序列的修飾的bont/a的活化環(huán)內(nèi)的多于一個位置(優(yōu)選兩個位置)上時,則與seq?id?no:6具有至少70%、80%、90%、95%、99.9%或100%序列同一性的序列的c端l鏈部分的小片段可能不存在于雙鏈修飾的bont/a中。鑒于此,雙鏈修飾的bont/a(例如,包含與seq?id?no:6具有至少70%、80%、90%、95%、99.9%或100%序列同一性的多肽序列)的序列可能與包含與seq?id?no:6具有至少70%、80%、90%、95%、99.9%或100%序列同一性的多肽序列的相應(yīng)單鏈修飾的bont/a的序列略有不同,小片段可為1-15個氨基酸。具體地,在一個實施方案中,當使用lys-c將單鏈修飾的bont/a轉(zhuǎn)換為雙鏈修飾的bont/a時,缺失的所述序列的c末端l鏈部分的小片段可為seq?id?no:9或10。

      375、在特別優(yōu)選的實施方案中,雙鏈修飾的bont/a包括包含與seq?id?no:11或12(優(yōu)選seq?id?no:11)具有至少70%、80%、90%、95%或99.9%序列同一性的多肽序列的輕鏈和包含與seq?id?no:13具有至少70%、80%、90%、95%或99.9%序列同一性的多肽序列的重鏈(或由其組成),其中輕鏈和重鏈通過二硫鍵連接在一起。更優(yōu)選地,雙鏈修飾的bont/a包括包含seq?id?no:11或12(優(yōu)選seq?id?no:11)的輕鏈和包含seq?id?no:13的重鏈(或由其組成),其中輕鏈和重鏈通過二硫鍵連接在一起。甚至更優(yōu)選地,雙鏈修飾的bont/a包含具有seq?id?no:11的輕鏈和具有seq?id?no:13的重鏈(或由其組成),其中輕鏈和重鏈通過二硫鍵連接在一起。二硫鍵優(yōu)選由seq?id?no:11或12的半胱氨酸殘基429和seq?id?no:13的半胱氨酸殘基6形成和/或位于兩者之間。

      376、在優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明的修飾的bont/a(例如嵌合梭菌神經(jīng)毒素)不包含除輕鏈和重鏈之外的治療劑或診斷劑(例如核酸、蛋白質(zhì)、肽或小分子治療劑或診斷劑)。例如,在一個實施方案中,修飾的bont/a(例如嵌合梭菌神經(jīng)毒素)可以不包含共價或非共價關(guān)聯(lián)的治療劑或診斷劑。因此,本發(fā)明的修飾的bont/a(例如嵌合梭菌神經(jīng)毒素)優(yōu)選不作為進一步的治療劑或診斷劑的遞送載體。

      377、在其中本文描述的修飾的bont/a(例如,嵌合梭菌神經(jīng)毒素)具有用于純化的標簽(例如,his標簽)和/或接頭的實施方案中,所述標簽和/或接頭是可選的。

      378、修飾的bont/a優(yōu)選是非復(fù)合形式(即可以不含存在于天然存在的梭菌神經(jīng)毒素復(fù)合物(例如bont/a復(fù)合物)中的復(fù)合蛋白)。此類復(fù)合蛋白的例子包括神經(jīng)毒素相關(guān)蛋白(nap)和無毒非血凝素組分(ntnh)。然而,修飾的bont/a優(yōu)選是重組修飾的bont/a。本發(fā)明的修飾的bont/a可以使用重組核酸技術(shù)來生產(chǎn)。因此,在一個實施方案中,修飾的bont/a(如本文所述)是重組修飾的bont/a(例如嵌合梭菌神經(jīng)毒素)。

      379、在一個實施方案中,提供包含編碼修飾的bont/a的核酸序列的核酸(例如,dna)。在一個實施例中,將核酸序列制備為包含啟動子和終止子的dna載體的一部分。核酸序列可從本文所述的任何核酸序列中選擇。

      380、在優(yōu)選的實施方案中,載體具有選自以下的啟動子:

      381、

      382、在另一優(yōu)選例中,所述載體具有選自以下的啟動子:

      383、

      384、核酸分子可以使用本領(lǐng)域已知的任何合適方法制備。因此,核酸分子可以使用化學(xué)合成技術(shù)制備?;蛘?,本發(fā)明的核酸分子可以使用分子生物學(xué)技術(shù)制備。

      385、本發(fā)明的dna構(gòu)建體優(yōu)選在計算機上設(shè)計,然后通過常規(guī)dna合成技術(shù)合成。

      386、上述核酸序列信息可根據(jù)需要采用的最終宿主細胞(例如大腸桿菌)表達系統(tǒng)進行密碼子偏向性修飾。

      387、術(shù)語“核苷酸序列”和“核酸”在本文中同義使用。優(yōu)選地,核苷酸序列是dna序列。

      388、本發(fā)明的修飾的bont/a可以以單鏈或雙鏈形式存在。然而,修飾的bont/a優(yōu)選以雙鏈形式存在,其中l(wèi)鏈通過二硫鍵與h鏈(或其組分,例如hn結(jié)構(gòu)域)連接。

      389、可以使用如下方法生產(chǎn)具有輕鏈和重鏈的單鏈修飾bont/a,所述方法包括在表達宿主中表達編碼修飾bont/a的核酸,裂解宿主細胞以提供含有單鏈修飾的bont/a的宿主細胞勻漿,以及分離單鏈修飾bont/a??梢允褂萌缦路椒▽Ρ疚乃龅膯捂溞揎椀腷ont/a進行蛋白水解處理,所述方法包括將單鏈修飾的bont/a與蛋白酶(例如lys-c)接觸,所述蛋白酶水解修飾的bont/a的活化環(huán)中的肽鍵,從而將單鏈修飾的bont/a轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的雙鏈修飾的bont/a(例如其中輕鏈和重鏈通過二硫鍵連接在一起)。優(yōu)選通過這種方法獲得雙鏈修飾bont/a。

      390、本文所用的術(shù)語“可獲得”也涵蓋術(shù)語“已獲得”。在一個實施方案中,術(shù)語“可獲得”意為已獲得。

      391、因此,本發(fā)明中使用的修飾的bont/a優(yōu)選為由單鏈bont/a產(chǎn)生的雙鏈修飾bont/a,其中單鏈bont/a包含本文所述的多肽序列或由其組成。例如,本發(fā)明中使用的修飾的bont/a優(yōu)選是由包含與seq?id?no:6具有至少70%(例如至少80%、90%、95%或99.9%)序列同一性的多肽序列的多肽產(chǎn)生的雙鏈修飾的bont/a。最優(yōu)選地,本發(fā)明中使用的修飾的bont/a是由包含seq?id?no:6(甚至更優(yōu)選地由其組成)的多肽產(chǎn)生的雙鏈修飾的bont/a。因此,在一些實施方案中,修飾的bont/a是雙鏈修飾的bont/a,其中輕鏈(l鏈)通過二硫鍵與重鏈(h鏈)連接,所述二硫鍵可通過包括使單鏈修飾的bont/a與水解其活化環(huán)中的肽鍵的蛋白酶接觸的方法獲得,從而將單鏈修飾的bont/a轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的雙鏈修飾的bont/a。因此,在一些實施方案中,修飾的bont/a是雙鏈修飾的bont/a,其中輕鏈(l鏈)通過二硫鍵與重鏈(h鏈)連接,所述二硫鍵可通過包括將包含seq?id?no:6的單鏈修飾的bont/a與水解其活化環(huán)中的肽鍵的蛋白酶接觸的方法獲得,從而將單鏈修飾的bont/a轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的雙鏈修飾的bont/a。在一些實施方案中,修飾的bont/a是雙鏈修飾的bont/a,其中l(wèi)鏈通過二硫鍵與h鏈連接,所述二硫鍵可通過將包含seq?id?no:6的單鏈修飾的bont/a與水解其活化環(huán)中的肽鍵的蛋白酶接觸的方法獲得,從而將單鏈修飾的bont/a轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的雙鏈修飾的bont/a。

      392、用于切割活化環(huán)的蛋白酶優(yōu)選是lys-c。wo?2014/080206、wo?2014/079495和ep2677029a2中教導(dǎo)了切割活化環(huán)以產(chǎn)生雙鏈梭菌神經(jīng)毒素的合適蛋白酶和方法,這些文獻以引用的方式并入本文中。lys-c可以切割活化環(huán)c端的一個或多個賴氨酸殘基。當lys-c切割活化環(huán)不止一次時,技術(shù)人員將理解,與本文所示的seq?id?no相比,雙鏈修飾的bont/a的活化環(huán)的小肽可能不存在。

      393、本文使用的術(shù)語“一個或多個”可表示至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20。在一個實施方案中,其中“一個或多個”位于列表之前,“一個或多個”可表示該列表的所有成員。類似地,本文使用的術(shù)語“至少一個”可表示至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20。在一個實施方案中,其中“至少一個”位于列表之前,“至少一個”可表示該列表的所有成員。

      394、本文所用的術(shù)語“障礙(disorder)”也涵蓋“疾病”。在一個實施例中,障礙是疾病。

      395、本發(fā)明的修飾型bont/a可以以任何適合的方式配制以施用于受試者,例如作為藥物組合物的一部分。此類藥物組合物包含本發(fā)明的修飾型bont/a和藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、佐劑、推進劑和/或鹽。

      396、液體劑型通常利用修飾的bont/a和無熱原無菌媒介物制備。修飾的bont/a可以溶解或懸浮在媒介物中,具體取決于所用的媒介物和濃度。在制備溶液時,修飾的bont/a可以溶解在媒介物中,如果需要,可以通過添加氯化鈉使溶液等滲,并使用無菌技術(shù)通過無菌過濾器過濾進行滅菌,然后裝入合適的無菌小瓶或安瓿瓶中并密封?;蛘撸绻芤悍€(wěn)定性足夠,則可以通過高壓滅菌對密封容器中的溶液進行滅菌。有利的是,可以將諸如緩沖劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑或殺菌劑、懸浮劑或乳化劑和/或局部麻醉劑等添加劑溶解在媒介物中。

      397、干粉在使用前溶解或懸浮在合適的媒介物中,可通過在無菌區(qū)域使用無菌技術(shù)將預(yù)滅菌成分裝入無菌容器中來制備?;蛘撸部稍跓o菌區(qū)域使用無菌技術(shù)將成分溶解在合適的容器中。然后將產(chǎn)品冷凍干燥,并在無菌條件下密封容器。

      398、適用于本文所述給藥途徑的腸外懸浮液以基本相同的方式制備,不同之處在于無菌成分懸浮在無菌媒介物中,而不是溶解,并且不能通過過濾進行滅菌。這些成分可以在無菌狀態(tài)下分離,或者也可以在分離后進行滅菌,例如通過伽馬射線滅菌。

      399、有利的是,可在組合物中包含懸浮劑(例如聚乙烯吡咯烷酮)以促進組分的均勻分布。

      400、在一個實施方案中,本發(fā)明提供了用于治療上面部紋的修飾的肉毒桿菌神經(jīng)毒素a(bont/a)的單位劑量形式(unit?dosage?form),其包含:

      401、a.大于73單位的修飾的bont/a;或

      402、b.大于1754pg(優(yōu)選大于1800pg)的修飾的bont/a;以及

      403、c.任選地,藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、佐劑和/或鹽,

      404、其中修飾的bont/a包括bont/a輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域,以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)。

      405、在一個方面,本發(fā)明提供了用于治療上面部紋的修飾的肉毒桿菌神經(jīng)毒素a(bont/a)的單位劑量形式,該單位劑量形式包含:

      406、a.大于73單位至332.8單位的修飾bont/a,其中1單位是對應(yīng)于小鼠的計算半數(shù)致死量(ld50)的修飾的bont/a的量;或者

      407、b.大于1754pg(優(yōu)選大于1800pg)至8000pg的修飾bont/a;以及

      408、c.任選地,藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、佐劑和/或鹽,

      409、d.其中修飾的bont/a包括bont/a輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域(hn結(jié)構(gòu)域)以及bont/b受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(hc結(jié)構(gòu)域)。

      410、所述單位劑量形式可包括:

      411、a.100單位至200單位修飾的bont/a;或

      412、b.4000pg至6000pg的修飾的bont/a。

      413、用于治療面部紋的單位劑量形式可包含73單位至332.8單位修飾的bont/a。所述范圍的上限可為300、250、200、150或100單位修飾的bont/a,優(yōu)選上限為200單位。所述范圍的下限可為80、90、100、150、200或250單位修飾的bont/a,優(yōu)選下限為100單位。優(yōu)選地,單位劑量形式包含90至250單位修飾的bont/a,例如100單位至200單位。

      414、用于治療面部紋的單位劑量形式可包含1755pg至8000pg修飾的bont/a。所述范圍的上限可為7500、7000、6500、6000、5500、5000、4500、4000、3500或3000pg修飾的bont/a,優(yōu)選上限為7000pg。所述范圍的下限可為1800、2000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500或5,000pg修飾的bont/a,優(yōu)選下限為2000pg。優(yōu)選地,單位劑量形式包含2000pg至7000pg修飾的bont/a,例如4,000pg至6,000pg。

      415、單位劑量形式可以包含1800-7000pg、2000-6500pg、2500-6000修飾的bont/a,優(yōu)選4000-5500pg修飾的bont/a。

      416、單位劑量形式可包含大于1754pg至8000pg的修飾的bont/a。單位劑量形式的上限可為8,000、7,000、6,000、5,000、4,000、3,000、2,000或1,000pg修飾的bont/a,優(yōu)選上限為5,000pg。單位劑量形式的下限可為1,800、2,000、2,500、3000或4,000pg修飾的bont/a,優(yōu)選下限為1,800pg修飾的bont/a。單位劑量形式可包含:1,800至8,000pg,或2,000至6,000pg的修飾的bont/a,更優(yōu)選3,000至6,000pg修飾的bont/a。單位劑量形式可為4,500至5,500pg的修飾的bont/a,例如4,900至5,100pg修飾的bont/a。

      417、單位劑量形式可包含大于1800pg的修飾的bont/a。單位劑量形式可包含大于1800pg最多7000pg的修飾的bont/a,例如大于1800pg最多6000pg的修飾bont/a。單位劑量形式可包含大于2000pg最多5000pg的修飾的bont/a。

      418、單位劑量形式可包含大于2555pg。例如,單位劑量形式可包含大于2555pg最多8000pg修飾的bont/a,例如大于2555pg最多6000pg的修飾的bont/a。

      419、單位劑量形式可包含2000pg、2500pg、3000pg、4000pg、4500pg、5000pg、5500pg、6000pg、6500pg、7000pg、7500pg或8000pg的修飾的bont/a。

      420、更優(yōu)選的是,單位劑量形式可包含2000至3500pg修飾的bont/a。例如,單位劑量形式可包含2250pg至3250pg修飾的bont/a。特別優(yōu)選的單位劑量形式可包含約2500pg(例如2500pg±10%)修飾的bont/a,例如,單位劑量形式可優(yōu)選包含2500pg修飾的bont/a。另一種合適的單位劑量形式可包含約3000pg(例如3000pg±10%)修飾的bont/a,例如,單位劑量形式可包含3000pg修飾的bont/a。

      421、單位劑量形式可包含3500-5500pg修飾的bont/a。例如,單位劑量形式可包含3800pg至4200pg修飾的bont/a。單位劑量形式可包含4800至5200pg修飾的bont/a。特別合適的單位劑量形式可包含約4000pg(例如4000pg±10%)修飾的bont/a,例如單位劑量形式可包含4000pg修飾的bont/a。另一種特別優(yōu)選的單位劑量形式可包含約5000pg(例如5000pg±10%)修飾的bont/a,例如單位劑量形式可優(yōu)選包含5000pg修飾的bont/a。

      422、還提供了試劑盒,其包括:

      423、a.如上文所定義的單位劑量形式;以及

      424、b.用于治療面部紋的說明;以及

      425、c.可選地,稀釋劑。

      426、還提供了試劑盒,其包括:

      427、a.如上文所定義的單位劑量形式;以及

      428、b.用于治療眉間紋的使用說明;以及

      429、c.可選地,稀釋劑。

      430、還提供了試劑盒,其包括:

      431、a.如上文所定義的單位劑量形式;以及

      432、b.用于治療額頭紋的使用說明;以及

      433、c.可選地,稀釋劑。

      434、還提供了試劑盒,其包括:

      435、a.如上文所定義的單位劑量形式;以及

      436、b.用于治療外眥紋的使用說明;以及

      437、c.可選地,稀釋劑。

      438、還提供了試劑盒,其包括:

      439、a.如上文所定義的單位劑量形式;以及

      440、b.用于治療眉間紋、額頭紋和外眥紋的使用說明;以及

      441、c.可選地,稀釋劑。

      442、單位劑量形式中的修飾bont/a可包含與seq?id?no:3-7中任一項具有至少70%序列同一性的多肽序列。例如,與seq?id?no:3-7中任一項具有至少80%、90%、95%或99.9%序列同一性的多肽序列。

      443、優(yōu)選單位劑量形式中的修飾bont/a包含與seq?id?no:6具有至少70%序列同一性的多肽序列。例如,與seq?id?no:6具有至少80%、90%、95%或99.9%序列同一性的多肽序列。最優(yōu)選,修飾bont/可包含seq?id?no:6(更優(yōu)選由其組成)。

      444、與本發(fā)明的各種治療用途相關(guān)的實施方案可應(yīng)用于本發(fā)明的方法、組合物(例如單位劑量形式)和試劑盒,反之亦然。

      445、序列同源性

      446、可以使用多種序列比對方法中的任一種來確定百分比同一性,包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法,例如片段方法。確定百分比同一性的方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的常規(guī)程序。全局方法將序列從分子的開頭到結(jié)尾進行比對,并通過將各個殘基對的分數(shù)相加并施加空位罰分來確定最佳比對。非限制性方法包括例如clustal?w,參見例如julie?d.thompson等人,clustal?w:improving?the?sensitivity?of?progressivemultiple?sequence?alignment?through?sequence?weighting,position-specific?gappenalties?and?weight?matrix?choice,22(22)nucleic?acids?research?4673-4680(1994);以及迭代細化,參見例如osamu?gotoh,improving?the?sensitivity?ofprogressive?multiple?sequence?alignment?through?sequence?weighting,position-specific?gap?penalties?and?weight?matrix?choice?264(4)j.mol.biol.823-838(1996)。局部方法通過識別所有輸入序列共有的一個或多個保守基序來比對序列。非限制性方法包括,例如,匹配框(match-box),參見,例如,eric?depiereux和ernest?feytmans,match-box:afundamentally?new?algorithm?for?the?simultaneous?alignment?ofseveral?protein?sequences,8(5)cabios?501-509(1992);吉布斯抽樣,參見,例如,c.e.lawrence等人,detecting?subtle?sequence?signals:agibbs?sampling?strategyfor?multiple?alignment,262(5131)science?208-214(1993);align-m,參見例如ivo?vanwaiie等人,align-m-anew?algorithm?for?multiple?alignment?ofhighly?divergentsequences,20(9)bioinformatics:1428-1435(2004)。

      447、因此,百分比序列同一性是通過常規(guī)方法確定的。參見,例如,altschul等人,bull.math.bio.48:603-16,1986和henikoff和henikoff,proc.natl.acad.sci.usa89:10915-19,1992。簡而言之,將兩個氨基酸序列進行比對,以優(yōu)化比對分數(shù),使用空位開放罰分為10,空位延伸罰分為1,以及henikoff和henikoff的“blosum?62”評分矩陣(同上),如下所示(氨基酸用標準單字母代碼表示)。

      448、兩個或多個核酸或氨基酸序列之間的“序列同一性百分比”是序列所共有的相同位置數(shù)量的函數(shù)。因此,同一性百分比可以計算為相同核苷酸/氨基酸的數(shù)量除以核苷酸/氨基酸的總數(shù),再乘以100。序列同一性百分比的計算還可以考慮空位的數(shù)量以及需要引入以優(yōu)化兩個或多個序列的比對的每個空位的長度。序列比較和兩個或多個序列之間的同一性百分比的確定可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的特定數(shù)學(xué)算法(例如blast)進行。

      449、用于確定序列同一性的比對分數(shù)

      450、

      451、然后按如下公式計算同一性百分比:

      452、相同匹配總數(shù)

      453、______________________________________________________x100

      454、[較長序列的長度加上

      455、引入較長序列的空位數(shù)量

      456、以便對齊兩個序列]

      457、基本同源的多肽的特征是具有一個或多個氨基酸取代、缺失或添加。這些變化優(yōu)選是輕微的,即保守的氨基酸取代(見下文)和其他不會顯著影響多肽折疊或活性的取代;小的缺失,通常為1到約30個氨基酸;以及小的氨基或羧基末端延伸,例如氨基末端的甲硫氨酸殘基、最多約20-25個殘基的小接頭肽或親和標簽。

      458、保守氨基酸取代

      459、

      460、除了20種標準氨基酸外,非標準氨基酸(例如4-羥基脯氨酸、6-n-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可取代本發(fā)明多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、非遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可取代多肽氨基酸殘基。本發(fā)明多肽還可包含非天然存在的氨基酸殘基。

      461、非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2,4-亞甲基脯氨酸、順式-4-羥基脯氨酸、反式-4-羥基脯氨酸、n-甲基甘氨酸、異蘇氨酸、甲基蘇氨酸、羥基乙基半胱氨酸、羥基乙基同型半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、同型谷氨酰胺、哌可酸、叔亮氨酸、正纈氨酸、2-氮雜苯丙氨酸、3-氮雜苯丙氨酸、4-氮雜苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。本領(lǐng)域已知多種將非天然存在的氨基酸殘基摻入蛋白質(zhì)的方法。例如,可以采用體外系統(tǒng),其中使用化學(xué)氨?;囊种苩rna來抑制無義突變。合成氨基酸和氨酰化trna的方法是本領(lǐng)域已知的。含有無義突變的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄和翻譯是在包含大腸桿菌s30提取物和市售酶及其他試劑的無細胞系統(tǒng)中進行的。蛋白質(zhì)通過色譜法純化。參見例如robertson等人,j.am.chem.soc.113:2722,1991;ellman等人,methods?enzymol.202:301,1991;chung等人,science?259:806-9,1993;和chung等人,proc.natl.acad.sci.usa90:10145-9,1993)。在第二種方法中,通過微注射突變的mrna和化學(xué)氨基酰化的抑制trna在爪蟾卵母細胞(xenopus?oocytes)中進行翻譯(turcatti等人,j.biol.chem.271:19991-8,1996)。在第三種方法中,在不存在要替換的天然氨基酸(例如苯丙氨酸)的情況下以及存在所需的非天然存在氨基酸(例如2-氮雜苯丙氨酸、3-氮雜苯丙氨酸、4-氮雜苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的情況下培養(yǎng)大腸桿菌細胞。將非天然存在氨基酸摻入多肽中以取代其天然對應(yīng)物。參見koide等人,biochem.33:7470-6,1994??梢酝ㄟ^體外化學(xué)修飾將天然氨基酸殘基轉(zhuǎn)化為非天然存在物種?;瘜W(xué)修飾可以與定點誘變相結(jié)合,以進一步擴大取代的范圍(wynn?and?richards,protein?sci.2:395-403,1993)。

      462、有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可以取代本發(fā)明多肽的氨基酸殘基。

      463、本發(fā)明多肽中的必需氨基酸可根據(jù)本領(lǐng)域已知方法鑒定,例如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(cunningham?and?wells,science?244:1081-5,1989)。生物相互作用位點也可結(jié)合假定接觸位點氨基酸的突變,通過結(jié)構(gòu)物理分析來確定,如通過核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標記等技術(shù)來確定。參見,例如,de?vos等人,science?255:306-12,1992;smith等人,j.mol.biol.224:899-904,1992;wlodaver等人,febs?lett.309:59-64,1992。必需氨基酸的身份也可以通過與本發(fā)明多肽的相關(guān)成分(例如易位或蛋白酶成分)的同源性分析來推斷。

      464、可以使用已知的誘變和篩選方法進行和測試多個氨基酸取代,例如reidhaar-olson和sauer(science?241:53-7,1988)或bowie和sauer(proc.natl.acad.sci.usa86:2152-6,1989)公開的方法。簡而言之,這些作者公開了同時隨機化多肽中兩個或多個位置、選擇功能性多肽、然后對誘變多肽進行測序以確定每個位置上允許的取代范圍的方法??梢允褂玫钠渌椒òㄊ删w展示(例如lowman等人,biochem.30:10832-7,1991;ladner等人,美國專利號5,223,409;huse,wipo出版物wo?92/06204)和區(qū)域定向誘變(derbyshire等人,gene46:145,1986;ner等人,dna7:127,1988)。

      465、除非另有定義,本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。singleton等人的《微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典》,第20版,john?wiley和sons,new?york(1994),以及hale&marham的《哈珀柯林斯生物學(xué)詞典》,harper?perennial,ny(1991)為技術(shù)人員提供了本公開內(nèi)容中使用的許多術(shù)語的通用詞典。

      466、本公開內(nèi)容不受本文公開的示例性方法和材料限制,任何與本文所述方法和材料類似或等同的方法和材料均可用于實踐或測試本公開內(nèi)容的實施方案。數(shù)值范圍包括定義范圍的數(shù)字。除非另有說明,否則任何核酸序列均以5'到3'方向從左到右書寫;氨基酸序列以氨基到羧基方向從左到右書寫。

      467、本文提供的標題并非對本公開內(nèi)容的各個方面或?qū)嵤├南拗啤?/p>

      468、本文使用氨基酸的名稱、三個字母的縮寫或單個字母的縮寫來指代氨基酸。本文所用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”包括蛋白質(zhì)、多肽和肽。本文所用的術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“多肽”和/或術(shù)語“蛋白質(zhì)”同義。在某些情況下,“氨基酸序列”與術(shù)語“肽”同義。在某些情況下,“氨基酸序列”與術(shù)語“酶”同義。術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文中可互換使用。在本公開內(nèi)容和權(quán)利要求中,可以使用氨基酸殘基的常規(guī)單字母和三字母代碼。氨基酸的三字母代碼符合iupaciub生物化學(xué)命名聯(lián)合委員會(jcbn)的定義。還應(yīng)理解,由于遺傳密碼的簡并性,多肽可以由多于一個核苷酸序列編碼。

      469、在整個說明書中可能出現(xiàn)其他術(shù)語定義。在更詳細地描述示例性實施方案之前,應(yīng)理解本公開內(nèi)容不限于所描述的特定實施方案,因此可能有所不同。還應(yīng)理解,本文使用的術(shù)語僅用于描述特定實施方案,并非旨在限制,因為本公開內(nèi)容的范圍僅由附加的權(quán)利要求限定。

      470、當提供數(shù)值范圍時,應(yīng)理解,還明確披露了該范圍的上限和下限之間的每個中間值(除非上下文另有明確規(guī)定),精確到下限單位的十分之一。在規(guī)定范圍內(nèi)的任何規(guī)定值或中間值與該規(guī)定范圍內(nèi)的任何其他規(guī)定值或中間值之間的每個較小范圍均涵蓋在本公開內(nèi)容內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可以獨立地包括在該范圍內(nèi)或排除在該范圍外,并且在較小范圍內(nèi)包括任一限值、不包括限值或包括兩個限值的每個范圍也涵蓋在本公開內(nèi)容內(nèi),但不包括所述范圍內(nèi)的任何明確排除的限值。當所述范圍包括一個或兩個限值時,排除其中一個或兩個限值的范圍也涵蓋在本公開內(nèi)容內(nèi)。

      471、必須注意的是,如本文和所附權(quán)利要求書中所用,單數(shù)形式“一”、“一個”和“該”包括復(fù)數(shù)指代物,除非上下文另有明確規(guī)定。因此,例如,提及“一種肉毒桿菌神經(jīng)毒素a”包括多種此類候選藥物,提及“該肉毒桿菌神經(jīng)毒素a”包括提及一種或多種梭菌神經(jīng)毒素及其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等效物,等等。

      472、本文討論的出版物僅因其在本技術(shù)的提交日期之前披露而提供。本文的任何內(nèi)容均不應(yīng)被解釋為承認此類出版物構(gòu)成所附權(quán)利要求的現(xiàn)有技術(shù)。

      473、附圖簡要說明

      474、現(xiàn)在將參考以下附圖和實施例僅通過示例的方式來描述本發(fā)明的實施方案。

      475、圖1顯示了fda批準用于治療成人面部紋的劑量。

      476、圖2顯示了純化的重組bont/ab嵌合體1、2和3a(分別為seq?id?no:3-4)的sds-page。泳道標記為“maker”(分子量標記)、“-dtt”(氧化bont/ab嵌合體樣品)和“+dtt”(還原bont/ab嵌合體樣品)。

      477、圖3顯示了重組bont/ab嵌合體1、2和3a(分別轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:3、4和5)對大鼠脊髓神經(jīng)元中snap-25的切割。將培養(yǎng)的大鼠原代脊髓神經(jīng)元(scn)暴露于不同濃度的重組bont/ab嵌合體1、2或3a24小時,溫度為37℃,10%?co2的濕潤氛圍中。然后用補充有dtt和核酸酶(benzonase)的1xnupage緩沖液裂解細胞。將樣品轉(zhuǎn)移到微量離心管中,在加熱塊上以90℃加熱5分鐘,然后儲存在-20℃下,然后通過蛋白質(zhì)印跡分析snap-25切割情況。使用多克隆抗體檢測snap-25,該抗體可檢測snap-25的全長和切割形式(sigma#s9684)??雇胔rp(sigma#a6154)用作二抗。

      478、圖4顯示了小鼠趾外展評分試驗。在短暫全身麻醉下,將藥物注射到小鼠的一條后肢的腓腸肌-比目魚肌復(fù)合肌中;使用趾外展評分(das)以0-4的量表測量肌肉無力。確定每種劑量的das最大值并繪制劑量圖,將數(shù)據(jù)擬合到4參數(shù)logistic方程,確定ed50和導(dǎo)致das4的劑量(das?4劑量)值。

      479、圖5顯示純化的重組bont/ab嵌合體3b和3c(分別為seq?id?no:6和7)的sds-page。泳道標記為“maker”(分子量標記)、“-dtt”(氧化bont/ab嵌合體樣品)和“+dtt”(還原bont/ab嵌合體樣品)。

      480、圖6顯示了人類誘導(dǎo)性多能干細胞來源的周圍神經(jīng)元(peri.4u-axiogenesis,德國)中未修飾的bont/a和bont/ab嵌合體3b和3c(分別為seq?id?no:2、6和7)對snap-25的切割。將peri.4u細胞暴露于不同濃度的重組bont/a或bont/ab嵌合體3b或3c中24小時,在37℃,含5%?co2的濕潤co2氛圍中。然后用補充有dtt和核酸酶(benzonase)的1x?nupage緩沖液裂解細胞。將樣品轉(zhuǎn)移到微量離心管中,在加熱塊上以90℃加熱5分鐘,并儲存在-20℃下,然后通過蛋白質(zhì)印跡分析snap-25切割情況。使用多克隆抗體檢測snap-25,該抗體可檢測snap-25的全長和切割形式(sigma#s9684)??雇胔rp(sigma#a6154)用作二抗。

      481、圖7顯示了小鼠趾外展評分試驗中肌肉無力隨時間的變化。在短暫全身麻醉下,將藥物注射到小鼠的一條后肢的腓腸肌-比目魚肌復(fù)合肌中;使用趾外展評分(das)以0-4的量表測量肌肉無力。對在注射的前四天誘導(dǎo)das為4的最低劑量組的動物進行監(jiān)測,直到肌肉無力完全恢復(fù)到das為0(未觀察到肌肉無力)。

      482、圖8顯示了治療眉間紋時修飾的bont/a肌肉施用的注射位點。

      483、圖9顯示了治療眉間紋和額頭紋時修飾的bont/a肌肉施用的注射位點。

      484、圖10顯示了僅治療外眥紋時修飾的bont/a肌肉施用的注射位點。

      485、圖11顯示了治療眉間紋、額頭紋和外眥紋時修飾的bont/a肌肉施用的注射位點。

      486、序列表

      487、當下列任一seq?id?no中指出了起始met氨基酸殘基或相應(yīng)的起始密碼子時,所述殘基/密碼子是可選的。

      488、seq?id?no:1(未修飾bont/a的核苷酸序列)

      489、

      490、

      491、seq?id?no:2(未修飾bont/a的多肽序列)

      492、

      493、

      494、seq?id?no:3(修飾的bont/a“嵌合體1”的多肽序列)

      495、

      496、seq?id?no:4(修飾的bont/a“嵌合體2”的多肽序列)

      497、

      498、

      499、seq?id?no:5(修飾的bont/a“嵌合體3a”的多肽序列)

      500、

      501、seq?id?no:6(修飾的bont/a“嵌合體3b”的多肽序列)

      502、

      503、

      504、seq?id?no:7(修飾的bont/a“嵌合體3c”的多肽序列)

      505、

      506、seq?id?no:8(bont/b多肽序列)

      507、

      508、

      509、seq?id?no:9–c端l鏈片段

      510、

      511、seq?id?no:10–c端l鏈片段2

      512、

      513、seq?id?no:11–雙鏈l鏈1

      514、

      515、seq?id?no:12–雙鏈l鏈2

      516、

      517、seq?id?no:13–雙鏈h鏈

      518、

      519、實施例

      520、實施例1

      521、bont/ab嵌合體的克隆、表達和純化

      522、使用標準分子生物學(xué)技術(shù),從編碼親本血清型分子的dna和適當?shù)墓押塑账針?gòu)建bont/ab嵌合構(gòu)建體1、2、3a、3b和3c(分別為seq?id?no:3-7)。然后將它們克隆到帶有或不帶有c端his10標簽的pj401表達載體中,并轉(zhuǎn)化到blr(de3)大腸桿菌細胞中以進行過度表達。這些細胞在2l帶擋板錐形瓶中以37℃和225rpm振蕩培養(yǎng),其中含有1l修飾的terrificbroth(mtb),并補充了適當?shù)目股?。一旦a600達到>0.5,培養(yǎng)箱溫度就會降低到16℃,然后在一小時后用1mm?iptg誘導(dǎo)20小時,以225rpm振蕩,以表達重組bont/ab構(gòu)建體。

      523、收獲的細胞通過超聲波裂解,并在4℃下以4500rpm的速度離心1小時以澄清。然后在硫酸銨中提取重組bont/ab嵌合分子,并通過標準快速蛋白液相色譜(fplc)技術(shù)純化。這涉及使用疏水相互作用樹脂進行捕獲和使用陰離子交換樹脂進行中間純化步驟。然后用內(nèi)蛋白酶lys-c對部分純化的分子進行蛋白水解切割以產(chǎn)生活性雙鏈。用第二個疏水相互作用樹脂進一步純化以獲得最終的bont/ab嵌合體。

      524、對于帶有十組氨酸標簽(h10)(嵌合體1、2、3a)的bont/ab嵌合分子,捕獲步驟采用固定化鎳樹脂代替疏水相互作用樹脂。。

      525、每個嵌合體的序列如表1所示。

      526、

      527、表1–嵌合bont/ab構(gòu)建體

      528、實施例2

      529、bont/ab嵌合體1、2和3a的比較

      530、具有c端his10標簽和e1191m/s1199y雙突變的bont/ab嵌合體1、2和3a按照實施例1(圖2)所述進行純化,并進行功能活性測試。

      531、大鼠脊髓神經(jīng)元snap-25切割試驗

      532、制備大鼠脊髓神經(jīng)元(scn)的原代培養(yǎng)物,并在96孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)3周(如masuyer等人,2011,j.struct.biol.structure?and?activity?of?a?functionalderivative?of?clostridium?botulinum?neurotoxin?b;以及chaddock等人,2002,protein?expr.purif.expression?and?purification?of?catalytically?active,non-toxic?endopeptidase?derivatives?of?clostridium?botulinum?toxin?type?a中所述)。在scn補料培養(yǎng)基中制備bont/ab的連續(xù)稀釋液。收集并過濾待處理的孔中的生長培養(yǎng)基(0.2μm過濾器)。將125μl過濾培養(yǎng)基加回到每個測試孔中。然后將125μl稀釋毒素添加到板中(重復(fù)三個孔)。將處理過的細胞在37℃、10%?co2下孵育24±1小時)。

      533、使用snap-25切割試驗分析bont活性

      534、處理后,去除bont,并在pbs(gibco,英國)中清洗細胞一次。在補充有0.1m二硫蘇糖醇(dtt)和250單位/ml核酸酶(benzonase)(sigma)的1x?nupage裂解緩沖液(lifetechnologies)中裂解細胞。通過sds-page分離裂解物蛋白并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用snap-25特異性的一抗(sigma#s9684)探測膜,該抗體可識別未切割的snap-25以及被bont/a內(nèi)肽酶切割的snap-25。使用的二抗是hrp偶聯(lián)的抗兔igg(sigma#a6154)。通過增強化學(xué)發(fā)光檢測條帶并使用pxi6?access(synoptics,英國)進行成像。使用genetools軟件(syngene,劍橋,英國)測定條帶強度,并計算在每個bont濃度下切割的snap-25百分比。數(shù)據(jù)擬合到4參數(shù)logistic方程,并使用graphpad?prism版本6(graphpad)計算pec50。

      535、下表2提供了在大鼠scn?snap-25切割試驗中確定的嵌合體1、2和3a的pec50值。這些結(jié)果表明,三種bont/ab嵌合體保留了進入大鼠脊髓神經(jīng)元并切割其目標底物的能力。然而,在該試驗中,嵌合體3a比嵌合體1和2更有效(另見圖3)。

      536、 <![cdata[pec<sub>50</sub>±sem]]> 嵌合體1 12.42±0.04 嵌合體2 12.57±0.01 嵌合體3a 12.89±0.04

      537、表2.pec50值。

      538、趾外展評分(das)測定

      539、在das測定中測量bont/ab嵌合體1、2和3a活性的方法是基于小鼠在短暫地用尾巴懸掛時的驚跳反應(yīng)趾伸展反射。這種反射被記為趾外展評分(das),在將bont注射到后爪的腓腸肌-比目魚肌中后,這種反射受到抑制。小鼠被短暫地用尾巴懸掛以引起特征性的驚跳反應(yīng),動物會伸展后肢并外展后趾。(aoki等人,1999,eur.j.neurol.;6(補充4)s3-s10)。

      540、注射當天,小鼠在麻醉室中接受含3%異氟烷的氧氣麻醉。每只小鼠在右后爪腓腸肌-比目魚肌肉內(nèi)注射bont/ab嵌合體或媒介物(含0.2%明膠的磷酸鹽緩沖液)。

      541、注射神經(jīng)毒素后,對不同程度的趾外展進行評分,評分范圍為0至4,其中0=正常,4=趾外展和腿部伸展最大程度減少。ed50是通過非線性調(diào)整分析確定的,使用每個劑量的最大效應(yīng)的平均值。所用的數(shù)學(xué)模型是4參數(shù)logistic模型。

      542、服藥后第一天每2小時進行一次das;此后每天進行3次,持續(xù)4天。

      543、圖4顯示了嵌合體1、2和3a(分別將seq?id?no:3、4和5轉(zhuǎn)化為雙鏈形式)的擬合曲線。嵌合體3a曲線向左移動,這意味著與嵌合體1和2相比,較低劑量的嵌合體3a實現(xiàn)了類似的das反應(yīng),因此表明在小鼠das測定中,嵌合體3a比其他嵌合體更有效;另見下表(表3),其中提供了每個嵌合體的計算ed50值和導(dǎo)致das?4(最高分數(shù))的劑量。

      544、下表3提供了未修飾重組bont/a1(rbont/a1–轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:2)和嵌合體1、2和3a在小鼠das測定中確定的ed50和das?4劑量。這些結(jié)果表明,在三種嵌合體中,嵌合體3a在體內(nèi)誘導(dǎo)肌肉無力方面具有最高的效力。圖4和表3中所示的研究是在從charles?river實驗室獲得的小鼠中進行的。

      545、

      546、表3.ed50值。

      547、實施例3

      548、bont/ab嵌合體3b、3c與未修飾的bont/a1的比較

      549、未標記的bont/ab嵌合體3b和3c(分別存在和不存在e1191m/s1199y雙突變)(seqid?no:6和7)如實施例1(圖5)所述進行純化,并且使用未修飾的bont/a(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:2)作為參考測試功能活性。人類多能干細胞snap-25切割試驗

      550、冷凍保存的peri.4u細胞購自axiogenesis(德國科隆)。按照制造商的建議進行細胞解凍和接種。簡而言之,將裝有細胞的冷凍管在37℃水浴中解凍2分鐘。輕輕重新懸浮后,將細胞轉(zhuǎn)移到50ml管中。用制造商提供的1ml?解凍培養(yǎng)基清洗冷凍管,然后將培養(yǎng)基逐滴轉(zhuǎn)移到50ml管中的細胞懸浮液中,然后再將2ml?解凍培養(yǎng)基逐滴添加到50ml管中。然后使用血細胞計數(shù)器計數(shù)細胞。此后,將另外6ml?解凍培養(yǎng)基添加到細胞懸浮液中。在室溫下以260xg(例如1,100rpm)離心6分鐘,獲得細胞沉淀。然后將細胞懸浮于制造商提供的完全培養(yǎng)基中。將細胞以50,000至150,000細胞/cm2的密度接種在涂有聚l-鳥氨酸和層粘連蛋白的細胞培養(yǎng)板上。細胞在37℃、濕潤的co2氣氛下培養(yǎng),培養(yǎng)期間每2-3天徹底更換培養(yǎng)基。

      551、對于毒素處理,在培養(yǎng)基中制備bont的連續(xù)稀釋液。收集并過濾待處理孔中的培養(yǎng)基(0.2μm過濾器)。將125μl過濾后的培養(yǎng)基加回到每個測試孔中。然后將125μl稀釋的毒素添加到板中(三個重復(fù)孔)。將處理過的細胞在37℃、10%?co2下孵育48±1小時)。

      552、使用snap-25切割試驗分析bont活性

      553、處理后,去除bont,并在pbs(gibco,英國)中清洗細胞一次。在補充有0.1m二硫蘇糖醇(dtt)和250單位/ml核酸酶(benzonase)(sigma)的1xnupage裂解緩沖液(lifetechnologies)中裂解細胞。通過sds-page分離裂解物蛋白并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用snap-25特異性的一抗(sigma#s9684)探測膜,該抗體可識別未切割的snap-25以及被bont/a內(nèi)肽酶切割的snap-25。使用的二抗是hrp偶聯(lián)的抗兔igg(sigma#a6154)。通過增強化學(xué)發(fā)光檢測條帶并使用pxi6?access(synoptics,英國)進行成像。使用genetools軟件(syngene,劍橋,英國)測定條帶強度,并計算在每個bont濃度下切割的snap-25百分比。數(shù)據(jù)擬合到4參數(shù)logistic方程,并使用graphpad?prism版本6(graphpad)計算pec50。

      554、圖6顯示,嵌合體3b和3c在誘導(dǎo)性人類多能干細胞中切割snap-25時表現(xiàn)出比rbont/a1更強的效力,但前者明顯更強。這可以通過雙重突變來解釋,這種突變增加了嵌合體3b對這些細胞中存在的人類突觸結(jié)合蛋白ii蛋白受體的親和力(圖6、表4)。

      555、 <![cdata[pec<sub>50</sub>±sem]]> rbont/a1 10.21±0.05 嵌合體3b 12.38±0.06 嵌合體3c 10.72±0.08

      556、表4.pec50值。

      557、趾外展評分(das)測試–安全比

      558、在das測定中測量bont活性的方法是基于小鼠在短暫地用尾巴懸掛時的驚跳反應(yīng)趾伸展反射。這種反射被記為趾外展評分(das),在將bont注射到后爪的腓腸肌-比目魚肌中后,這種反射會受到抑制。小鼠被短暫地用尾巴懸掛以引起特征性的驚跳反應(yīng),動物會伸展后肢并外展后趾。(aoki等人,1999,eur.j.neurol.;6(補充4)s3-s10)。

      559、注射當天,小鼠在麻醉室中接受含3%異氟烷的氧氣麻醉。每只小鼠在右后爪的腓腸肌-比目魚肌肉內(nèi)注射bont或媒介物(含0.2%明膠的磷酸鹽緩沖液)。

      560、注射神經(jīng)毒素后,對不同程度的趾外展進行評分,評分范圍為0至4,其中0=正常,4=趾外展和腿部伸展最大程度減少。ed50是通過非線性調(diào)整分析確定的,使用每個劑量的最大效應(yīng)的平均值。所用的數(shù)學(xué)模型是4參數(shù)logistic模型。

      561、給藥后第一天每2小時進行一次das;此后所有劑量的das每天進行3次,持續(xù)4天。注射媒介物和注射前四天誘導(dǎo)das為4的最低劑量組的動物隨后受到監(jiān)測,直到肌肉無力完全恢復(fù)至das為0(未觀察到肌肉無力)。

      562、為了計算安全比,所有動物在注射毒素前一天(d0)稱重,此后在整個研究期間每天稱重一次。每天計算每個劑量組的平均體重、其標準偏差和標準誤差平均值。為了獲得bont的安全比(-10%δbw/ed50),將研究期間任何時間劑量組的平均體重低于同一劑量組d0時平均體重的10%的劑量除以所研究的bont的ed50。致死劑量定義為該劑量組中一只或多只動物死亡的劑量。

      563、圖7顯示了未修飾的bont/a、嵌合體3b和嵌合體3c(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:2、6和7)在小鼠趾外展評分測定中肌肉無力持續(xù)時間隨時間的變化,表明嵌合體的作用持續(xù)時間更長。

      564、下表5提供了小鼠das測定中rbont/a1和嵌合體3b和3c的ed50和das?4劑量。該表還提供了das?4劑量直至肌無力完全恢復(fù)至das?0(未觀察到肌無力)的總作用持續(xù)時間。此外,該表還顯示了小鼠致死劑量和安全比(-10%δbw/ed50),如上文所定義。與rbont/a1相比,嵌合體3b和3c的作用持續(xù)時間更長、安全比更好、致死劑量更高。圖7和表5中所示的研究是在從janvier實驗室獲得的小鼠中進行的。

      565、

      566、表5.bont/ab嵌合體的das和安全比。

      567、實施例4

      568、治療眉間紋的劑量方案

      569、修飾的bont/a以凍干粉形式提供,裝在2ml透明玻璃小瓶中,每瓶含有15ng修飾的bont/a。凍干粉用無菌氯化鈉0.9%v/w無防腐劑溶液和稀釋劑(僅含有修飾的bont/a賦形劑的配方緩沖液)混合物重構(gòu)。重構(gòu)后,根據(jù)需要進一步稀釋溶液。

      570、中度至重度眉間紋按照圖8所示的注射方案進行治療。

      571、單位劑量為20-300pg(2-35單位)。

      572、肌肉內(nèi)注射按單位劑量最多可在5個位點進行,最大總劑量為1500pg(177單位)。

      573、實施例5

      574、治療眉間紋和額頭紋的劑量方案

      575、修飾的bont/a以凍干粉形式提供,裝在2ml透明玻璃小瓶中,每瓶含有15ng修飾的bont/a。凍干粉用無菌氯化鈉0.9%v/w無防腐劑溶液和稀釋劑(僅含有修飾的bont/a賦形劑的配方緩沖液)混合物重構(gòu)。重構(gòu)后,根據(jù)需要進一步稀釋溶液。

      576、中度至重度眉間紋和額頭紋按照圖9所示的注射方案進行治療。

      577、單位劑量為20-300pg(2-35單位)。

      578、肌肉內(nèi)注射按單位劑量最多可在10個位點進行,最大總劑量為3000pg(355單位)。

      579、實施例6

      580、治療外眥紋的劑量方案

      581、修飾的bont/a以凍干粉形式提供,裝在2ml透明玻璃小瓶中,每瓶含有15ng修飾的bont/a。凍干粉用無菌氯化鈉0.9%v/w無防腐劑溶液和稀釋劑(僅含有修飾的bont/a賦形劑的配方緩沖液)混合物重構(gòu)。重構(gòu)后,根據(jù)需要進一步稀釋溶液。

      582、中度至重度外眥紋按照圖10所示的注射方案進行治療。

      583、單位劑量為20-300pg(2-35單位)。

      584、肌肉內(nèi)注射按單位劑量最多可在6個位點進行,最大總劑量為1800pg(213單位)。

      585、實施例7

      586、治療眉間紋、額頭紋和外眥紋的劑量方案

      587、修飾的bont/a以凍干粉形式提供,裝在2ml透明玻璃小瓶中,每瓶含有15ng修飾的bont/a。凍干粉用無菌氯化鈉0.9%v/w無防腐劑溶液和稀釋劑(僅含有修飾的bont/a賦形劑的配方緩沖液)混合物重構(gòu)。重構(gòu)后,根據(jù)需要進一步稀釋溶液。

      588、中度至重度眉間紋、額頭紋和外眥紋按照圖11所示的注射方案進行治療。

      589、單位劑量為20-300pg(2-35單位)。

      590、肌肉內(nèi)注射按單位劑量最多可在16個位點進行,最大總劑量為4800pg(569單位)。

      591、實施例8

      592、修飾的bont/a(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:6)的進一步表征

      593、轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的修飾的bont/a(例如bont/ab嵌合體)seq?id?no:6在小鼠ld50測定中進行了測試,結(jié)果為1.202ng/kg。因此,1單位的seq?id?no:6在該測定中對應(yīng)于24.04pg。

      594、此外,在大鼠das測定中測試了所述bont/ab嵌合體,以確定與相比的作用持續(xù)時間(按照實施例6)。結(jié)果列于下表6中:

      595、

      596、表6.作用持續(xù)時間。

      597、總之,bont/ab的作用持續(xù)時間比長得多并且與seq?id?no:6相似。因此,預(yù)計seq?id?no:6的單位劑量和給藥方案可以類似地應(yīng)用于bont/ab,以提供更好的面部紋治療。

      598、實施例9

      599、針對上面部紋的修飾的bont/a(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:6)單位劑量的計算

      600、根據(jù)臨床前藥理學(xué)數(shù)據(jù),計算出了適合人體使用修飾的bont/a的單位劑量范圍(ud)。

      601、計算得出seq?id?no:6的das?ed50為13pg/kg。ed50被視為最低藥理活性劑量,比同一動物物種中4ng/kg的未觀察到不良反應(yīng)水平(noael)低約300倍。大鼠中seq?id?no:6的ed50為13pg/kg,相當于體重60公斤的人的0.8ng劑量。

      602、因此,選定單位劑量的下限為20pg,上限為1500pg,該劑量低于兩個非臨床安全性物種(大鼠和猴子)的noael?4ng/kg換算成60kg體重的人體劑量。

      603、鑒于安全性的提高,治療上面部紋的最大總劑量設(shè)定為24,000pg,這是根據(jù)非臨床安全物種(大鼠和猴子)的noael?4ng/kg換算成60kg體重的人體劑量得出的。

      604、實施例10

      605、使用修飾的bont/a(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的?seq?id?no:?6)治療眉間紋的給藥方案

      606、修飾的bont/a以凍干粉形式提供,裝于小瓶中,每瓶含36ng修飾的bont/a。凍干粉經(jīng)過重組。

      607、中度至重度眉間紋按照圖8所示的注射方案進行治療。

      608、單位劑量為20-1500pg(0.8-62單位)。

      609、肌肉內(nèi)注射按單位劑量最多注射5個位點,最大總劑量為7500pg(312單位)。

      610、實施例11

      611、使用修飾的bont/a(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:6)治療眉間紋和額頭紋的給藥方案

      612、修飾的bont/a以凍干粉形式提供,裝于小瓶中,每瓶含36ng修飾的bont/a。凍干粉經(jīng)過重組。

      613、中度至重度眉間紋和額頭紋按照圖9所示的注射方案進行治療。

      614、單位劑量為20-1500pg(0.8-62單位)。

      615、肌肉內(nèi)注射按單位劑量最多可在10個位點進行,最大總劑量為15,000pg(624單位)。

      616、實施例12

      617、使用修飾的bont/a(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:?6)治療外眥紋的給藥方案

      618、修飾的bont/a以凍干粉形式提供,裝于小瓶中,每瓶含36ng修飾的bont/a。凍干粉經(jīng)過重組。

      619、中度至重度外眥紋按照圖10所示的注射方案進行治療。

      620、單位劑量為20-1500pg(0.8-62單位)。

      621、肌肉內(nèi)注射按單位劑量最多可在6個位點進行,最大總劑量為9000pg(374單位)。

      622、實施例13

      623、使用修飾的bont/a(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:6)治療眉間紋、額頭紋和外眥紋的給藥方案

      624、修飾的bont/a以凍干粉形式提供,裝于小瓶中,每瓶含36ng修飾的bont/a。凍干粉經(jīng)過重組。

      625、中度至重度眉間紋、額頭紋和外眥紋按照圖11所示的注射方案進行治療。

      626、單位劑量為20-1500pg(0.8-62單位)。

      627、肌肉內(nèi)注射按單位劑量最多可在16個位點進行,最大總劑量為24,000pg(998單位)。

      628、實施例14

      629、使用修飾的bont/a(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:6)在人體中的安全性和有效性

      630、進行了一項綜合i/ii期多中心、雙盲、隨機、dysport和安慰劑對照的劑量遞增和劑量探索研究,以評估修飾的bont/a(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:6)在治療成人中度至重度上面部紋方面的安全性和有效性。所述上面部紋包括眉間紋、額頭紋和外眥紋。該研究包括對具有成人上面部紋的獨特患者隊列進行人體順序劑量遞增。所述上面部皺紋包括眉間紋、額頭紋和外眥紋。每塊肌肉內(nèi)注射單位劑量的修飾的bont/a、dysport或安慰劑。6個隊列施用了不同(增加)量的修飾的bont/a(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:6)??倓┝糠秶鸀?.1至6.0ng。修飾的bont/a注射到了臉部上方最多16個位點(眉間紋5個位點、額頭紋5個位點以及外眥紋兩側(cè)各3個位點-見圖11)。

      631、結(jié)果表明,盡管每塊肌肉的劑量極高,但所有測試的修飾的bont/a單位劑量和總劑量(即高達6,000pg)均有效、安全耐受,并且未觀察到任何不良反應(yīng)。這表明修飾的bont/a不會從注射位點擴散,并凸顯了修飾的bont/a(seq?id?no:6)的卓越安全性?;谶@些發(fā)現(xiàn),可以相信可向每塊肌肉施用更高的單位劑量而不會產(chǎn)生不良反應(yīng)。此外,鑒于毒素不會全身擴散,可以相信可施用最多13-14倍的單位劑量而不會產(chǎn)生安全問題。

      632、因此,我們選擇高達5,000pg+/-10%的單位劑量,在面部上部區(qū)域最多注射16次(例如,眉間紋的五個位點、額頭紋的五個位點以及外眥紋兩側(cè)的三個位點),用于治療上面部紋。因此,治療期間注射的總劑量將分別高達80,000(+/-10%)。

      633、例如,已選擇高達5,000pg+/-10%的單位劑量來治療眉間紋(每個皺眉肌兩個,降眉間肌一個),眉間區(qū)域的總劑量高達25,000pg,這比兩個非臨床安全物種(大鼠和猴子)的4ng/kg的noael轉(zhuǎn)化為60kg體重的人體劑量低約10倍。

      634、事實上,如實施例21所解釋的,5次注射(每個皺眉肌兩次,降眉間肌一次)每次4,000pg單位劑量(以提供20,000pg的總劑量)耐受性良好。

      635、實施例15

      636、使用修飾的bont/a(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:?6)治療眉間紋的給藥方案

      637、修飾的bont/a以凍干粉形式提供,裝于小瓶中,每瓶含36ng修飾的bont/a。凍干粉經(jīng)過重組。

      638、中度至重度眉間紋按照圖11所示的注射方案進行治療。也就是說,每塊皺眉肌最多注射兩個單位劑量,降眉間肌注射一個單位劑量。

      639、單位劑量為>1754pg至5,000ng。治療期間施用的修飾的bont/a總劑量高達88,000pg。這比在治療面部紋時可以施用的最大總劑量高出14倍多,不會接近毒性極限(傳統(tǒng)治療方案的顧慮)。因此,臨床醫(yī)生能夠根據(jù)患者的情況量身定制治療方案,因為醫(yī)生知道可以施用總劑量88,000pg,而不用擔心毒性,從而可以治療受試者的其他肌肉和/或確保每塊肌肉和/或位點都接受有效劑量。

      640、實施例16

      641、使用修飾的bont/a(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:6)治療眉間紋和額頭紋的給藥方案

      642、修飾的bont/a以凍干粉形式提供,裝于小瓶中,每瓶含36ng修飾的bont/a。凍干粉經(jīng)過重組。

      643、中度至重度眉間紋和額頭紋按照圖9所示的注射方案進行治療。即,每塊皺眉肌最多注射兩個單位劑量,降眉間肌注射一個單位劑量;額肌最多注射五個單位劑量。

      644、單位劑量為>1754pg至5,000ng。治療期間施用的修飾的bont/a總劑量高達88,000pg。這比在治療面部皺紋時可以施用的最大總劑量高出14倍多,不會接近毒性極限(傳統(tǒng)治療方案的顧慮)。因此,臨床醫(yī)生能夠根據(jù)患者的情況量身定制治療方案,因為醫(yī)生知道可以施用總劑量88,000pg,而不用擔心毒性,從而可以治療受試者的其他肌肉和/或確保每塊肌肉和/或位點都接受有效劑量。

      645、實施例17

      646、使用修飾的bont/a(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:6)治療外眥紋的給藥方案

      647、修飾的bont/a以凍干粉形式提供,裝于小瓶中,每瓶含36ng修飾的bont/a。凍干粉經(jīng)過重組。

      648、中度至重度外眥紋按照圖10所示的注射方案進行治療。也就是說,每塊眼輪匝肌最多注射三個單位劑量。

      649、單位劑量為>1754pg至5,000ng。治療期間施用的修飾的bont/a總劑量高達88,000pg。這比在治療面部皺紋時可以施用的最大總劑量高出14倍多,不會接近毒性極限(傳統(tǒng)治療方案的顧慮)。因此,臨床醫(yī)生能夠根據(jù)患者的情況量身定制治療方案,因為醫(yī)生知道可以施用總劑量88,000pg,而不用擔心毒性,從而可以治療受試者的其他肌肉和/或確保每塊肌肉和/或位點都接受有效劑量。

      650、實施例18

      651、使用修飾的bont/a(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:6)治療眉間紋、額頭紋和外眥紋的給藥方案

      652、修飾的bont/a以凍干粉形式提供,裝于小瓶中,每瓶含36ng修飾的bont/a。凍干粉經(jīng)過重組。

      653、中度至重度眉間紋、額頭紋和外眥紋按照圖11所示的注射方案進行治療。也就是說,每塊皺眉肌最多注射兩個單位劑量,降眉間肌注射一個單位劑量;額肌最多注射五個單位劑量;每塊眼輪匝肌最多注射三個單位劑量。

      654、單位劑量為>1754pg至5,000ng。治療期間施用的修飾的bont/a總劑量高達88,000pg。這比在治療面部皺紋時可以施用的最大總劑量高出14倍多,不會接近毒性極限(傳統(tǒng)治療方案的顧慮)。因此,臨床醫(yī)生能夠根據(jù)患者的情況量身定制治療方案,因為醫(yī)生知道可以施用總劑量88,000pg,而不用擔心毒性,從而可以治療受試者的其他肌肉和/或確保每塊肌肉和/或位點都接受有效劑量。

      655、實施例19

      656、上臉部紋患者的治療

      657、john,55歲,患有嚴重的眉間紋、額頭紋和外眥紋。將修飾的bont/a(seq?id?no:6)以一個或多個單位劑量(1x單位劑量=5000pg)的方式施用至以下肌肉:

      658、-兩個單位劑量(因此皺眉肌上有四個單位劑量)至每塊皺眉肌肌肉和降眉間肌肌肉的一個位點,用于治療眉間紋,

      659、-五個單位劑量至額肌肌肉,用于治療額頭紋;以及

      660、-三個單位劑量(因此在眼輪匝肌上注射六個單位劑量)至每塊眼輪匝肌肌肉外部,用于治療外眥紋。

      661、施用的總劑量為80,000ng(+/-10%)修飾的bont/a(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?idno:6)。

      662、所有紋(皺紋)都得到緩解,皮膚看起來干凈年輕,而且由于修飾的bont/a的持續(xù)時間長,jone不需要超過9個月的進一步治療。因此,與接受未修飾bont/a治療的同等受試者相比,john接受的注射頻率較低(例如每年)。此外,由于修飾的bont/a的安全性得到改善,bill沒有表現(xiàn)出任何副作用。

      663、實施例20

      664、修飾bont/a(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:6)在人體中的安全性和有效性seq?idno:6(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式)通過肌肉內(nèi)注射的方式施用于人類受試者。受試者被施用于2x?15,000pg單位劑量(即總共30,000pg)、2x?25,000pg單位劑量(即總共50,000pg)或2x?36,000pg單位劑量(即總共72,000pg)的修飾bont/a(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:6)。

      665、結(jié)果表明,所有經(jīng)測試的修飾的bont/a單位劑量均能有效麻痹肌肉、安全耐受,并且未觀察到任何不良反應(yīng),盡管每塊肌肉的劑量極高(例如25,000pg和36,000pg單位劑量)。這表明修飾的bont/a不會從注射位點擴散,并凸顯了修飾的bont/a(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:6)的卓越安全性。

      666、本文在治療面部皺紋的背景下描述的單位劑量和總劑量完全在對本文描述的這種有利的修飾的bont/a分子安全有效的劑量范圍內(nèi),為臨床醫(yī)生提供了治療選擇方面的靈活性,包括利用修飾的bont/a(例如轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:6)的有利特性和卓越的安全性。

      667、實施例21

      668、修飾的bont/a(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:?6)在治療眉間紋中的安全性和有效性

      669、seq?id?no:6(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式)通過肌肉內(nèi)注射的方式施用于人類受試者。

      670、一組受試者接受了5次注射(每側(cè)皺眉肌2次,降眉間肌1次),每次2,500pg單位劑量,總劑量為12,500pg。另一組受試者接受了5次注射(每側(cè)皺眉肌2次,降眉間肌1次),每次4,000pg單位劑量,總劑量為20,000pg。

      671、眉間紋減少。結(jié)果表明,所有測試的修飾的bont/a單位劑量均安全耐受,并且沒有觀察到不良反應(yīng),盡管每塊肌肉的劑量非常高。這表明修飾的bont/a不會從注射位點擴散,并突出了修飾的bont/a(轉(zhuǎn)化為雙鏈形式的seq?id?no:6)的卓越安全性。

      672、上述說明書中提到的所有出版物均以引用的方式并入本文中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的各種修改和變化,而不會偏離本發(fā)明的范圍和精神。盡管本發(fā)明已結(jié)合特定的優(yōu)選實施例進行了描述,但應(yīng)理解,所要求保護的發(fā)明不應(yīng)過度局限于這些特定的實施例。事實上,對于生物化學(xué)和生物技術(shù)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說,實施本發(fā)明的所述模式的各種修改都是顯而易見的,這些修改旨在屬于以下權(quán)利要求的范圍。

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