發(fā)明領域本發(fā)明涉及冷凍干燥組合物領域，特別是含有核酸的組合物。更具體地，本發(fā)明涉及使用連續(xù)旋轉(zhuǎn)冷凍和連續(xù)旋轉(zhuǎn)干燥(升華和解吸)所述組合物的方法冷凍干燥含有核酸的組合物。本發(fā)明還涉及通過根據(jù)本發(fā)明的方法可獲得的含有核酸的組合物。

背景技術：

0、發(fā)明背景

1、大多數(shù)生物制藥產(chǎn)品在水性溶液中具有有限的穩(wěn)定性，其可能導致分子的較低效力或甚至導致分子的毒性。特別地，包括dna和rna在內(nèi)的核酸在環(huán)境溫度下長期在水性溶液中非常不穩(wěn)定，這是由于被污染的核酸酶降解，以及由于固有的化學不穩(wěn)定性。該不穩(wěn)定性和完整性的喪失是制藥和生物技術工業(yè)中基于核酸的產(chǎn)品的應用的瓶頸。

2、冷凍干燥(也稱為凍干)被應用于維持產(chǎn)品的保質(zhì)期，使其更便于儲存、分配和運輸。冷凍干燥過程通常包括三個連續(xù)的步驟：i)冷凍步驟，其中水結晶成冰，ii)初級干燥步驟，其中冰晶在真空下通過升華去除，iii)二級干燥步驟，其中大部分未冷凍的水通過擴散和解吸去除。盡管傳統(tǒng)的“批量”冷凍干燥可以在一個步驟(例如，冷凍)中處理大量的小瓶，但是該方法是耗時和耗能的。主要的缺點是不受控制的冷凍和不均勻的熱傳遞，結果是批次中每個單個小瓶的處理條件不同，導致不受控制的小瓶到小瓶和批次到批次的可變性。

3、為了克服與傳統(tǒng)的批量冷凍干燥相關的缺點，已開發(fā)連續(xù)冷凍干燥技術，其中所有冷凍干燥步驟i)至iii)都整合到單一生產(chǎn)線上，其中裝有相應的液體制劑的選定的小瓶可以連續(xù)模式放置。一個重要的區(qū)別是裝有液體產(chǎn)品的小瓶沿其縱軸快速轉(zhuǎn)動并同時冷卻(即，旋轉(zhuǎn)冷凍)。因此，所得到的冷凍產(chǎn)品將以均勻的厚度鋪展在整個小瓶表面上(即，大表面積和薄產(chǎn)品層)。適當?shù)呢撦d鎖定系統(tǒng)可以用于在連續(xù)冷凍單元和連續(xù)干燥單元之間快速轉(zhuǎn)移冷凍小瓶，而不影響具體的壓力和溫度條件。在干燥室中，環(huán)形帶系統(tǒng)允許運送小瓶到單獨控制的輻射器前面，該輻射器為需要升華和解吸的小瓶提供熱傳遞，因此允許單獨的小瓶溫度調(diào)節(jié)，這與現(xiàn)有的冷凍干燥技術相比是有利的。使用冷凝器系統(tǒng)，允許其連續(xù)地去除冷凝水。

4、總之，該連續(xù)整合的方法大大減少了關鍵質(zhì)量屬性的可變性并且始終保證旋轉(zhuǎn)冷凍干燥產(chǎn)品的預定質(zhì)量。旋轉(zhuǎn)冷凍和干燥循環(huán)減少產(chǎn)品暴露于潛在不穩(wěn)定的溫度。這對于配制的核酸和對于以其裸露形式的核酸(即，未經(jīng)保護的核酸，如在實驗室中制備的核酸)而言是有效的。因此，我們發(fā)現(xiàn)由于較短的處理時間和處理均勻性，旋轉(zhuǎn)冷凍干燥的含有核酸的組合物增強了產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

5、通常，對于含有核酸的組合物的冷凍干燥，使用經(jīng)典的冷凍干燥，其使用相當?shù)蜐舛鹊睦鋬霰Ｗo劑(wo2011069528)。此外，鑒于單位劑量的連續(xù)旋轉(zhuǎn)冷凍干燥已經(jīng)公開于leys等人，2020，文中沒有冷凍干燥含有核酸的組合物，也沒有使用更高濃度的冷凍保護劑(leys等人,?2020?–?european?journal?of?pharmaceutics?and?biopharmaceutics?– a? primary?drying?model-based?comparison?of?conventional?batch?freeze-drying?to? continuous?spin-freeze-drying?for?unit?doses)。由于冷凍保護劑濃度可能顯著影響冷凍干燥的含有核酸的塊狀物的質(zhì)量和特性，發(fā)明人試圖提供允許在改變冷凍保護劑濃度方面靈活性最高的冷凍干燥方法。另外，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的旋轉(zhuǎn)冷凍干燥方法與經(jīng)典的冷凍干燥方法相比，允許在冷凍保護劑濃度方面具有更大的靈活性。特別地，20%?w/v的冷凍保護劑濃度在經(jīng)典的冷凍干燥方法中對塊狀物質(zhì)量有負面影響，而相似的冷凍保護劑濃度在本發(fā)明的旋轉(zhuǎn)冷凍干燥方法中保持良好的塊狀物質(zhì)量。

6、因此，意外地發(fā)現(xiàn)旋轉(zhuǎn)冷凍和干燥循環(huán)對于核酸和含有核酸的組合物而言是有益的，特別是當使用不同的冷凍保護劑濃度時。具體地，旋轉(zhuǎn)冷凍在小瓶內(nèi)壁上產(chǎn)生均勻的薄層，并且防止/阻止在玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(tg’)附近發(fā)生核酸水平或含有核酸的組合物的結構重組，并且保持裸露和配制的核酸的原始構型類似于液態(tài)的構型。因此，產(chǎn)品不會不穩(wěn)定，并且保持其關鍵質(zhì)量屬性，以及其生物活性。

技術實現(xiàn)思路

0、發(fā)明概述

1、在第一方面，本發(fā)明提供了用于冷凍干燥含有核酸的組合物的方法，該方法包括以下步驟：

2、a)在具有內(nèi)壁和外壁的容器中裝入含有核酸的液體制劑；特別是包含15%?(w/v)以上的冷凍保護劑的含有核酸的液體制劑；

3、b)沿軸旋轉(zhuǎn)步驟a)的所述容器，從而允許所述制劑在所述容器的圓周內(nèi)壁處形成層；

4、c)在繼續(xù)旋轉(zhuǎn)步驟b)的所述容器的同時，冷卻所述容器以冷凍干燥在圓周內(nèi)壁處的所述制劑；從而獲得旋轉(zhuǎn)冷凍容器；

5、d)通過使所述容器經(jīng)受向所述容器的圓周內(nèi)壁提供均勻熱傳遞的加熱源，干燥步驟c)的所述旋轉(zhuǎn)冷凍容器，以形成干燥的含有核酸的組合物。

6、在本發(fā)明的具體實施方案中，所述含有核酸的組合物還包含一種或多種脂質(zhì)、脂質(zhì)體、脂質(zhì)納米顆粒、聚合物、基于聚合物的納米顆粒、緩沖液/介質(zhì)、注射用水、tris緩沖鹽水(tbs)和/或磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)。

7、在另一具體實施方案中，所述含有核酸的液體制劑還包含冷凍保護劑。特別地，本發(fā)明的冷凍保護劑可以選自包含以下的列表：檸檬酸鈉、氯化鈉、山梨醇、聚山梨醇酯、海藻糖、甘露糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、組氨酸、精氨酸、賴氨酸、葡聚糖、麥芽糖糊精、環(huán)糊精、聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)、甘氨酸、甘油、聚乙二醇(peg)、丙二醇，和/或其混合物；特別是蔗糖。

8、在本發(fā)明的另外的實施方案中，所述含有核酸的液體制劑包含的所述冷凍保護劑的濃度范圍為0.01%至25%?(w/v)或0.01%至25%w/v；更特別地為16%至25%?(w/v)。

9、在本發(fā)明的方法的另外的實施方案中，在步驟b)和c)中所述容器沿其縱軸在大約1000和5000?rpm下以及在1000至5000?rpm之間旋轉(zhuǎn)。

10、在本發(fā)明的方法的另外的實施方案中，步驟c)包括惰性低溫氣體流的使用。

11、在另外的實施方案中，本發(fā)明的方法在包含冷凍室和干燥室的2室系統(tǒng)中進行。

12、在另一特定的實施方案中，步驟c)的所述旋轉(zhuǎn)冷凍容器通過中間負載鎖定隔室快速從所述冷凍室轉(zhuǎn)移至所述干燥室，使得系統(tǒng)允許連續(xù)冷凍干燥方法。特別地，所述負載鎖定隔室可以在每個室中保持約5帕至35帕之間的壓力和約-5°c至-30°c之間的溫度。

13、在本發(fā)明的具體實施方案中，所述干燥室是環(huán)形帶系統(tǒng)，其將所述旋轉(zhuǎn)冷凍容器運送到至少一個單獨控制的非接觸加熱源前面；特別地，所述單獨控制的加熱源選自紅外輻射器和/或電加熱墊。

14、在另外的實施方案中，所述旋轉(zhuǎn)冷凍容器在所述至少一個單獨控制的加熱源前面沿其縱軸在約5-12?rpm下緩慢轉(zhuǎn)動，持續(xù)約1至120分鐘之間的時間。

15、在本發(fā)明的方法的另外的實施方案中，步驟d)包括通過真空下升華去除冰晶的初級干燥步驟；和通過擴散和解吸去除大部分剩余的未冷凍液體的二級干燥步驟。特別地，使用低溫冰冷凝器連續(xù)地去除所述升華的冰晶和解吸的液體。

16、在另外的方面，本發(fā)明提供通過如本文中所公開的方法可獲得的冷凍干燥的含有核酸的組合物。

17、特別地，本發(fā)明提供容器，其包含呈粉末形式的含有核酸的組合物，其中所述粉末在所述容器的圓周內(nèi)表面處呈薄層形式。

18、附圖簡要描述

19、現(xiàn)在具體參考附圖，強調(diào)所顯示的細節(jié)是通過示例的方式，并且僅出于對本發(fā)明的不同實施方案進行說明性討論的目的。它們是為了提供被認為是本發(fā)明的原理和概念方面的最有用和最容易的描述的目的而提供的。在該方面，沒有試圖比對本發(fā)明的基本理解所需的更詳細地顯示本發(fā)明的結構細節(jié)。附圖采取的描述使本領域的技術人員清楚本發(fā)明的幾種形式可以如何在實踐中實施。

20、圖1：旋轉(zhuǎn)冷凍步驟的圖示說明

21、裝有含有核酸的液體制劑的容器沿其縱軸快速轉(zhuǎn)動以形成鋪展在整個小瓶內(nèi)壁上的產(chǎn)品薄層(即，旋轉(zhuǎn)冷凍)。當獲得均質(zhì)的產(chǎn)品層時，冷、惰性和無菌氣體的流動導致溶液的冷卻和冷凍，并且使所述含有核酸的制劑在整個容器內(nèi)壁上固化，產(chǎn)生均勻厚度的薄產(chǎn)品層。

22、圖2：與連續(xù)干燥系統(tǒng)相連的連續(xù)冷凍系統(tǒng)

23、以連續(xù)方式旋轉(zhuǎn)冷凍的容器通過負載鎖定系統(tǒng)運送至連續(xù)干燥室。負載鎖定系統(tǒng)連接冷凍室和干燥室，同時保持特定壓力和溫度條件。

24、圖3：在單個紅外加熱器前面沿其縱軸轉(zhuǎn)動的旋轉(zhuǎn)冷凍小瓶的紅外輔助連續(xù)初級干燥的圖示說明

25、在干燥室中，環(huán)形帶系統(tǒng)允許運送旋轉(zhuǎn)冷凍容器到單獨控制的輻射器前面，該輻射器為整個容器表面提供均勻和充分的熱傳遞，以實現(xiàn)高效和均質(zhì)的干燥行為。每個容器在單個輻射器前面非常緩慢地轉(zhuǎn)動，因此允許單獨的溫度調(diào)節(jié)，該溫度調(diào)節(jié)使每個旋轉(zhuǎn)冷凍容器能夠有最佳的干燥軌跡。

26、圖4：在冷凍過程中的產(chǎn)品溫度曲線

27、冷凍是冷凍干燥過程中的第一步，其使材料凝固。該圖描繪了在15°c/min的冷卻速率下溫度(°c,?y軸)隨冷凍步驟的時間(分鐘,?x軸)的變化。細線表示冷凍循環(huán)的溫度設定點，而粗線表示實際產(chǎn)品溫度。箭頭指示產(chǎn)品的溫度完全穩(wěn)定至設定點溫度的時刻(t?=7?min)。冷凍速率對于冰晶的形成和大小是重要的—冷凍速率快會形成較小的冰晶，反之亦然。

28、圖5：在干燥過程中的產(chǎn)品溫度曲線

29、冷凍干燥過程的干燥階段包括兩個步驟，即初級步驟和二級步驟。該圖描繪了溫度(°c,?y軸)隨干燥階段的時間(分鐘,?x軸)的變化。箭頭(t?=?0-40?min)指示將初級干燥階段(升華)與二級干燥階段(解吸)分開的溫度。

30、圖6：塊狀物在注射用水中重構之前和之后的產(chǎn)品視覺外觀

31、所得到的干燥產(chǎn)品形成薄層，其均勻地圍繞小瓶內(nèi)壁分布。加入500?μl注射用水以重構粉末后，得到了白色至灰白色的半透明液體，其與冷凍干燥之前的液體的視覺外觀相當。10倍稀釋的產(chǎn)品產(chǎn)生澄清的溶液。重構的液體和10倍稀釋的液體均無可見顆粒。

32、干燥的產(chǎn)品重構后粒度輕微增加，然而，重構的樣品顯示高度的粒度均勻性(即，尺寸分布窄)，其反映在低的多分散性指數(shù)值中。

33、圖7：通過使用15%?w/v蔗糖(a)或20%?w/v蔗糖(b)的常規(guī)冷凍干燥(左圖)與旋轉(zhuǎn)冷凍干燥(右圖)的fd塊狀物的視覺外觀。對于常規(guī)冷凍干燥(左圖)，15%?w/v蔗糖(a)產(chǎn)生視覺上看起來完美、均質(zhì)并且沒有裂縫的fd塊狀物。另一方面，使用20%?w/v蔗糖(b)產(chǎn)生質(zhì)量差的fd塊狀物，其視覺上顯示收縮、易碎、顯示一些開裂、以及一些在小瓶底部的結晶。對于旋轉(zhuǎn)冷凍干燥(右圖)，15%?w/v(a)和20%?w/v(b)均產(chǎn)生完美的fd塊狀物，其是均質(zhì)的、沒有裂縫。

34、發(fā)明詳述

35、現(xiàn)在將進一步描述本發(fā)明。在以下段落中，本發(fā)明的不同方面被更詳細地定義。如此定義的每個方面可以與任何其他一個或多個方面組合，除非明確相反地指出。特別地，任何指示為優(yōu)選的或有利的特征可以與任何其他一個或多個指示為優(yōu)選的或有利的特征組合。

36、如在說明書和所附權利要求書中所使用，單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該”包括復數(shù)指代物，除非上下文明確另有規(guī)定。例如，“化合物”是指一種化合物或一種以上化合物。

37、當指可測量值如參數(shù)、量、時間持續(xù)時間等，如本文中所使用的術語“約”或“大約”是指包括指定值的和從指定值的+/-10%或更少，優(yōu)選+/-5%或更少，更優(yōu)選+/-1%或更少，以及仍然更優(yōu)選+/-0.1%或更少的變化，只要這樣的變化適合于在所公開的發(fā)明中進行。應當理解，修飾語“約”或“大約”所指的值本身也具體地并且優(yōu)選地公開。

38、因此，本發(fā)明特別地涉及利用旋轉(zhuǎn)冷凍干燥步驟的用于含有核酸的組合物的冷凍干燥方法。本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，與使用標準的冷凍干燥方法的冷凍干燥的組合物相比，旋轉(zhuǎn)冷凍干燥的含有核酸的組合物具有更好的分配和儲存的穩(wěn)定性。

39、本發(fā)明的另外的優(yōu)點是，本發(fā)明中所描述的冷凍干燥方法比常規(guī)的冷凍干燥快20-40倍。這導致冰晶形成的顯著減少。

40、因此，并且如本文在以上已詳述的，在第一方面，本發(fā)明提供冷凍干燥含有核酸的組合物的方法，該方法包括以下步驟：

41、a)在具有內(nèi)壁和外壁的容器中裝入含有核酸的液體制劑；特別是包含15%?(w/v)以上的冷凍保護劑的含有核酸的液體制劑；

42、b)沿軸旋轉(zhuǎn)步驟a)的所述容器，從而允許所述制劑在所述容器的圓周內(nèi)壁處形成層；

43、c)在繼續(xù)旋轉(zhuǎn)步驟b)的所述容器的同時，冷卻所述容器以冷凍干燥在圓周內(nèi)壁處的所述制劑；從而獲得旋轉(zhuǎn)冷凍容器；

44、d)通過使所述容器經(jīng)受向所述容器的圓周內(nèi)壁提供均勻熱傳遞的加熱源，干燥步驟c)的所述旋轉(zhuǎn)冷凍容器，以形成干燥的含有核酸的組合物。

45、如本文中所使用，并且除非另有說明，術語“核酸”應理解為由核苷酸(其是由三種組分組成的單體：5碳糖、磷酸基團和含氮堿基)組成的生物聚合物或生物大分子。術語“核酸”是攜帶信息的分子如rna?(核糖核酸；糖化合物是核糖)和dna?(脫氧核糖核酸；糖化合物是脫氧核糖)的總稱。在本發(fā)明中，所涉及的序列可以是天然(人類、動物、植物、細菌、病毒)或人工來源，并且特別是基因組dna、cdna、信使rna?(mrna)、轉(zhuǎn)運rna?(trna)、核糖體rna?(rrna)、微rna?(mirna)、小干擾rna?(sirna)、核仁小rna?(snorna)、piwi相互作用rna(pirna)、trna衍生的小rna?(tsrna)、小rdna衍生的rna?(srrna)、雜交序列或合成或半合成序列。術語裸核酸是指未經(jīng)保護的核酸如在實驗室中制備的dna/rna。此外，核酸的大小可以變化，范圍從寡核苷酸到染色體，并且可以是單鏈或雙鏈的。

46、在本發(fā)明的上下文中，術語“rna”涉及分子，其包含核糖核苷酸殘基并且優(yōu)選地完全或基本上由核糖核苷酸殘基組成?！昂颂呛塑账帷鄙婕霸讦?d-呋喃核糖基基團的2'位上具有羥基基團的核苷酸。該術語包括雙鏈rna，單鏈rna，分離的rna如部分純化的rna，基本純的rna，合成的rna，重組產(chǎn)生的rna，以及通過添加、刪除、替換和/或改變一個或多個核苷酸而不同于天然存在的rna的修飾的rna。這樣的改變可以包括非核苷酸類物質(zhì)的添加，如添加至rna的(多個)末端或內(nèi)部添加，例如在rna的一個或多個核苷酸處。rna分子中的核苷酸也可以包括非標準核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化學合成的核苷酸或脫氧核苷酸。這些改變的rna可以是指類似物。核酸可以包含在載體中。如本文中所使用的術語“載體”包括技術人員已知的任何載體，包括質(zhì)粒載體，粘粒載體，噬菌體載體如λ噬菌體，病毒載體如腺病毒或桿狀病毒載體，或人工染色體載體如細菌人工染色體(bac)、酵母人工染色體或天然存在的rna的類似物。

47、根據(jù)本發(fā)明，術語“rna”包括并且優(yōu)選地涉及“mrna”，其是指“信使rna”，并且涉及可以使用dna作為模板產(chǎn)生并且編碼肽或蛋白質(zhì)的“轉(zhuǎn)錄本”。mrna通常包含5'非翻譯區(qū)(5'-utr)、蛋白質(zhì)或肽編碼區(qū)和3'非翻譯區(qū)(3'-utr)。mrna在細胞中和在體外具有有限的半衰期。優(yōu)選地，mrna通過使用dna模板的體外轉(zhuǎn)錄來制備。在本發(fā)明的一個實施方案中，rna通過體外轉(zhuǎn)錄或化學合成來獲得。體外轉(zhuǎn)錄方法是技術人員已知的。例如，有各種可商購的體外轉(zhuǎn)錄試劑盒。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述mrna分子是編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的mrna分子。

48、在本發(fā)明的上下文中，術語“編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的mrna分子”是指編碼改變抗原呈遞細胞(更特別地是樹突狀細胞)的功能的蛋白質(zhì)的mrna分子。這樣的分子可以選自包含以下的列表：cd40l、cd70、catlr4、il-12p70、el-選擇素、ccr7和/或4-1?bbl、icosl、ox40l、il-21；更特別地是cd40l、cd70和catlr4的一種或多種。本發(fā)明的方法中所使用的免疫刺激因子的優(yōu)選的組合是cd40l和catlr4(即“dimix”)。在另一優(yōu)選的實施方案中，使用cd40l、cd70和catlr4免疫刺激分子的組合，其在本文中也稱為“trimix”。

49、在另一具體的實施方案中，所述mrna分子是編碼抗原特異性和/或疾病特異性蛋白的mrna分子。

50、根據(jù)本發(fā)明，術語“抗原”包括任何分子，優(yōu)選肽或蛋白質(zhì)，其包含至少一個將引發(fā)免疫反應和/或免疫反應所針對的表位；因此，術語抗原也是指包括來自抗原的最小表位。如本文中所定義的“最小表位”是指能夠引發(fā)免疫反應的最小結構。優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中的抗原是任選地在處理之后誘導免疫反應的分子，所述免疫反應優(yōu)選地對抗原或表達抗原的細胞具有特異性。特別地，“抗原”涉及分子，其任選地在處理之后被mhc分子呈遞并且與t淋巴細胞(t細胞)發(fā)生特異性反應。

51、在具體的實施方案中，抗原是靶標特異性抗原，其可以是腫瘤抗原或細菌、病毒或真菌抗原。所述靶標特異性抗原可以源自以下中的一種：從(一種或多種)靶細胞分離的總mrna、一種或多種特異性靶mrna分子、(一種或多種)靶細胞的蛋白質(zhì)裂解物、來自(一種或多種)靶細胞的特異性蛋白質(zhì)，或合成的靶標特異性肽或蛋白質(zhì)和合成的編碼靶標特異性抗原或其衍生肽的mrna或dna。

52、為了避免任何誤解，本發(fā)明的lnp可以包括單個mrna分子，或者它們可以包括多個mrna分子，如一種或多種編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的mrna分子和/或一種或多種編碼抗原特異性和/或疾病特異性蛋白的mrna分子的組合。

53、在非常具體的實施方案中，所述編碼免疫調(diào)節(jié)分子的mrna分子可以與一種或多種編碼抗原特異性和/或疾病特異性蛋白的mrna分子組合。例如，本發(fā)明的lnp可以包括編碼免疫刺激分子cd40l、cd70和/或catlr4?(如dimix或trimix)的mrna分子；與一種或多種編碼抗原特異性和/或疾病特異性蛋白的mrna分子組合。因此，在非常具體的實施方案中，本發(fā)明的lnp包括編碼cd40l、cd70和/或catlr4的mrna分子；與一種或多種編碼抗原特異性和/或疾病特異性蛋白的mrna分子組合。

54、在本發(fā)明的上下文中，術語“組合物”是指構成組合物的所有不同的、單獨的物質(zhì)、化合物或元素(例如，藥劑、調(diào)制劑、調(diào)節(jié)劑等)的同一性(identity)。其可以是溶液、混懸劑、液體、散劑或糊劑、水性或非水性制劑或其任何組合。組合物優(yōu)選為藥物組合物，其包含一種或多種藥用賦形劑、載體、稀釋劑。

55、在本發(fā)明的具體實施方案中，所述含有核酸的組合物還包含一種或多種脂質(zhì)、脂質(zhì)體、脂質(zhì)納米顆粒、聚合物、基于聚合物的納米顆粒、緩沖液/介質(zhì)、注射用水、tris緩沖鹽水(tbs)和磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)。

56、在本發(fā)明的上下文中，術語“含有核酸的組合物”是指包含至少一種核酸聚合物的組合物，所述核酸聚合物在一種或多種媒介物中遞送，所述媒介物包括脂質(zhì)、脂質(zhì)體、脂質(zhì)納米顆粒、聚合物、基于聚合物的納米顆粒、緩沖液/介質(zhì)、注射用水、tris緩沖鹽水(tbs)和/或磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)。

57、在冷凍干燥之后，所得到的干燥的核酸也可以再使用任何適合的介質(zhì)/緩沖液重構，諸如但不限于注射用水、tris緩沖鹽水(tbs)和/或磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)。

58、如本文中所使用，脂質(zhì)是指來自以下類別的任何組分：脂肪酸類、甘油脂類、甘油磷脂類、鞘脂類、固醇類、異戊烯醇類(prenol)、糖脂類、聚酮類。另外，在本發(fā)明的上下文中，脂質(zhì)體是具有至少一個脂質(zhì)雙分子層的球形囊泡結構，所述脂質(zhì)雙分子層形成包圍水相的中空球的形狀。因此，任何感興趣的載荷(cargo)如含有核酸的制劑、藥物、蛋白質(zhì)/肽可以包封在脂質(zhì)體內(nèi)，在水性隔室中(如果其是水溶性/親水的)或在脂質(zhì)雙分子層內(nèi)(如果是脂溶性/親脂的)。

59、另外，如本文中所使用，脂質(zhì)納米顆粒是脂質(zhì)體樣結構，特別適用于將各種核酸(rna和dna)作為藥物或疫苗包封在非水性核中。更具體地，脂質(zhì)納米顆粒的形狀通常是球形，并且由表面活性劑穩(wěn)定的固體脂質(zhì)核組成。核脂質(zhì)可以是脂肪酸類、?；视皖?、蠟類及其混合物。生物膜脂質(zhì)如磷脂類、鞘磷脂類、膽鹽類(牛磺膽酸鈉)和固醇類(膽固醇)可以用作穩(wěn)定劑。雖然許多不同類型的脂質(zhì)可以包含在這樣的lnp內(nèi)，但是本發(fā)明的lnp通常由可電離脂質(zhì)、磷脂、固醇和peg脂質(zhì)的組合組成。

60、在本發(fā)明的上下文中，術語“peg脂質(zhì)”或供選擇地“peg化的脂質(zhì)”是指任何適合的用peg(聚乙二醇)基團修飾的脂質(zhì)。

61、在本發(fā)明的上下文中，術語“可電離的”(或供選擇地，陽離子的)在化合物或脂質(zhì)的上下文中是指在所述化合物或脂質(zhì)中存在任何不帶電的基團，該基團能夠通過產(chǎn)生離子(通常是h+離子)而解離，并因此本身變得帶正電。供選擇地，在所述化合物或脂質(zhì)中的任何不帶電的基團可以產(chǎn)生電子并因此變得帶負電。

62、在本發(fā)明的上下文中，術語“磷脂”是指脂質(zhì)分子，其由兩個疏水脂肪酸“尾”和一個由磷酸基團組成的親水“頭”組成。這兩種組分最常通過甘油分子連接在一起，因此，在本發(fā)明的磷脂中優(yōu)選甘油磷脂。此外，磷酸基團通常用簡單的有機分子如膽堿(即，產(chǎn)生磷酸膽堿)或乙醇胺(即，產(chǎn)生磷酸乙醇胺)修飾。

63、在本發(fā)明的上下文中，術語“固醇”，也稱為甾醇(steroid?alcohol)，是類固醇的亞組，其天然存在于植物、動物和真菌中，或可以通過一些細菌生產(chǎn)。在本發(fā)明的上下文中，可以使用任何適合的固醇，如選自包含以下的列表：膽固醇、麥角固醇、菜油甾醇、氧甾醇、樟芝甾醇(antrosterol)、鏈甾醇(desmosterol)、尼卡甾醇(nicasterol)、谷甾醇和豆甾醇，優(yōu)選膽固醇。

64、如本文中所使用，聚合物是指天然的或合成的物質(zhì)或材料，其由非常大的分子或高分子組成，所述非常大的分子或高分子由許多重復的被稱為單體的亞單元組成。術語“聚合物納米顆?！睉斫鉃槌叽绶秶?至1000?nm內(nèi)的球形顆粒，其可以裝載活性化合物，該活性化合物被包裹在聚合物核內(nèi)或表面吸附在聚合物核上。另外，術語“納米顆粒”應理解為納米膠囊或納米球，其中納米膠囊由藥物通常溶解在其中的油核組成，所述油核被聚合物殼包圍，而納米球基于連續(xù)的聚合物網(wǎng)絡，其中藥物可以保留在內(nèi)部或吸附在其表面上。

65、如本文中所使用，并且除非另有說明，術語“容器”應理解為用于容納產(chǎn)品的任何貯器或外殼，其通過使產(chǎn)品處于其結構的內(nèi)部而保持產(chǎn)品被保護。容器可以由玻璃、塑料或任何其他材料制成，并且用于儲存、包裝、運輸液體、散劑、片劑或膠囊劑產(chǎn)品，并且可以為例如小瓶、瓶子、器皿、罐、燒瓶的形式，優(yōu)選為圓柱形小瓶的形式。

66、如本文中所使用，并且除非另有說明，術語“液體制劑”應理解為液體或半液體形式的任何賦形劑，其包含至少一種溶解在或不溶解在所述液體或半液體中的組分。

67、在另一具體的實施方案中，所述含有核酸的液體制劑還包含冷凍保護劑。特別地，本發(fā)明的冷凍保護劑可以選自包含以下的列表：檸檬酸鈉、氯化鈉、山梨醇、聚山梨醇酯、海藻糖、甘露糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、組氨酸、精氨酸、賴氨酸、葡聚糖、麥芽糖糊精、環(huán)糊精、聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)、甘氨酸、甘油、聚乙二醇(peg)、丙二醇，和/或其混合物。在非常具體的實施方案中，冷凍保護劑是蔗糖。

68、如本文中所使用，并且除非另有說明，術語“冷凍保護劑”應理解為滲透性或非滲透性物質(zhì)，其用于保護組合物及其相關化合物免受冷凍損害(即，由于冰形成導致的冷凍損害)。常規(guī)的冷凍保護劑通常是二醇類(含有至少兩個羥基基團的醇類)和糖類，如乙二醇、丙二醇、甘油和海藻糖。特別地，海藻糖是由兩個葡萄糖分子組成的非還原糖，其以無毒的方式在冷凍和解凍期間保持細胞的結構完整性。以前的研究已使用該二糖來冷凍保存人類細胞，如血小板、紅細胞、精子、卵母細胞、胰島和胎兒皮膚。

69、在本發(fā)明的另外的實施方案中，所述含有核酸的液體制劑包含所述冷凍保護劑的濃度范圍為0.01%至25%?(w/v)或0.01%至25%?w/v；特別地為1%至20%?w/v，更特別地5%?w/v以上，更特別地10?w/v以上，更特別地約15%?w/v，更特別地15%?w/v以上；更特別地從16%至25%?w/v。

70、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的檸檬酸鈉：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

71、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的氯化鈉：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

72、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的山梨醇：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

73、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的聚山梨醇酯：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

74、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的海藻糖：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

75、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的甘露糖：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

76、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的甘露醇：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

77、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的麥芽糖：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

78、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的蔗糖：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

79、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的葡萄糖：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

80、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的果糖：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

81、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的乳糖：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

82、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的組氨酸：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

83、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的精氨酸鈉：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

84、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的賴氨酸：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

85、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的葡聚糖：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

86、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的麥芽糖糊精：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

87、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的環(huán)糊精：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

88、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

89、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的甘氨酸：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

90、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的甘油：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

91、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的聚乙二醇(peg)：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

92、在一些實施方案中，所述液體制劑可以包含具有以下最小量的丙二醇：至少約0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25%?(w/v)。

93、在本發(fā)明的方法的另外的實施方案中，在旋轉(zhuǎn)和冷卻步驟期間，所述容器沿其縱軸在大約1000和5000?rpm下以及在1000至5000?rpm之間旋轉(zhuǎn)。

94、如本文中所使用，并且除非另有說明，術語“旋轉(zhuǎn)”應理解為圍繞其軸轉(zhuǎn)動所述容器，其將所述制劑盡可能均勻地鋪展在整個容器內(nèi)表面上，允許所述制劑在所述容器的圓周內(nèi)壁處形成層(圖1)。所述容器的旋轉(zhuǎn)(或轉(zhuǎn)動)可以在冷凍干燥過程中以連續(xù)的方式進行，但不一定以相同的速度，該速度也指的是每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)(rpm)。

95、如本文中所使用，并且除非另有說明，術語“軸”應理解為縱軸或橫軸。

96、在一些實施方案中，術語“縱軸”應理解為從指定容器的頂部到底部的軸。

97、如本文中所使用，并且除非另有說明，術語“橫軸”應理解為水平穿過指定容器的中心的軸。

98、在本發(fā)明的方法的一些實施方案中，在冷卻步驟期間容器的旋轉(zhuǎn)在大約1000和5000?rpm下以及在1000至5000?rpm之間進行，優(yōu)選在大約1500和4000?rpm下以及在1500至4000?rpm之間進行，更優(yōu)選在大約2000和3700?rpm下以及在2000至3700?rpm之間進行。

99、如本文中所使用，并且除非另有說明，術語“冷卻”應理解為通過液態(tài)或固態(tài)的氣體將產(chǎn)品溫度降低至0°c以下，通常在約-90°c至-20°c之間，更優(yōu)選-70°c，以將產(chǎn)品的液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)，并且特別地在指定容器的內(nèi)表面處形成冰晶。在該冷凍階段期間的溫度曲線可以取決于要冷卻的組合物，并且可以從線性冷卻(例如15°c/min)到更復雜和動態(tài)的溫度曲線變化。冷卻階段持續(xù)約1至30分鐘，更優(yōu)選15分鐘。

100、如本文中所使用，并且除非另有說明，術語“冰晶”應理解為在較低溫度下由水蒸氣在固體上凝結形成的結構，其中固體可以是顆粒或其他物質(zhì)。

101、在本發(fā)明的方法的另外的實施方案中，冷卻步驟包括惰性低溫氣體流的使用。

102、如本文中所使用，并且除非另有說明，惰性低溫氣體流可以選自包含以下的列表：氦氣、二氧化碳和氮氣；優(yōu)選二氧化碳，最優(yōu)選氮氣，其可以環(huán)繞所述至少一個容器以獲得薄的冷凍產(chǎn)品層。

103、在本發(fā)明的方法的一些實施方案中，薄的冷凍產(chǎn)品層為約0.1-10?nm的厚度，優(yōu)選為約0.5-5?nm的厚度，最優(yōu)選約1-3?nm的厚度。

104、在另外的實施方案中，轉(zhuǎn)動的或旋轉(zhuǎn)的容器連續(xù)冷卻持續(xù)約1至60分鐘，優(yōu)選5至30分鐘，更優(yōu)選10至20分鐘。

105、在另外的實施方案中，本發(fā)明的方法在包含冷凍室和干燥室的2室系統(tǒng)中進行(圖2)。

106、如本文中所使用，并且除非另有說明，術語“干燥”是指水或另一溶劑從固體、半固體或液體組合物中去除的過程。這可以通過使組合物經(jīng)受加熱源、干燥劑，將組合物置于真空下或其組合來實現(xiàn)。

107、如本文中所使用，并且除非另有說明，“2室系統(tǒng)”應理解為兩個互相連接的室—冷凍室和干燥室。

108、在另一特定的實施方案中，所述旋轉(zhuǎn)冷凍容器通過中間負載鎖定隔室快速從所述冷凍室轉(zhuǎn)移至所述干燥室，使得系統(tǒng)允許連續(xù)冷凍干燥方法(圖2)。

109、在具體的實施方案中，所述負載鎖定隔室可以保持約5帕至35帕之間的壓力。在另一具體的實施方案中，所述負載鎖定隔室可以在每個室中具有約-5°c至-30°c之間的溫度。在另外的實施方案中，所述負載鎖定隔室可以在每個室中保持約5帕至35帕之間的壓力和約-5°c至-30°c之間的溫度。

110、如本文中所使用，并且除非另有說明，術語“負載鎖定系統(tǒng)”應理解為這樣的系統(tǒng)，其用于在連續(xù)冷凍室和連續(xù)干燥室之間快速轉(zhuǎn)移旋轉(zhuǎn)冷凍小瓶，而不干擾在每個室中的特定壓力和溫度條件，保證過程的連續(xù)性。

111、在本發(fā)明的方法的一些實施方案中，冷凍室、干燥室和負載鎖定隔室是閉環(huán)系統(tǒng)，其中負載鎖定隔室和干燥室優(yōu)選處于壓力(也稱為真空條件)下。容器放置在真空條件下(經(jīng)受或不經(jīng)受加熱源)，發(fā)生將產(chǎn)生水蒸氣的過程，其中使用冷凝器去除水蒸氣。

112、在本發(fā)明的方法的一些實施方案中，負載鎖定隔室中的壓力可以是在0帕至70帕之間，優(yōu)選5帕至40帕之間，最優(yōu)選5帕至35帕之間，并且可以在這樣的過程期間進行調(diào)整。

113、在本發(fā)明的方法的一些實施方案中，負載鎖定隔室中的溫度可以在-5至-30°c之間，優(yōu)選-5至-25°c之間，最優(yōu)選在約-10°c處，并且可以在這樣的過程期間進行調(diào)整。

114、在本發(fā)明的方法的另外的實施方案中，干燥過程包括通過真空下升華去除冰晶的初級干燥步驟；和通過擴散和解吸去除大部分剩余的未冷凍液體的二級干燥步驟。特別地，使用低溫冰冷凝器連續(xù)地去除所述升華的冰晶和解吸的液體。

115、在一些實施方案中，術語“干燥”是指術語“升華”(也是指“初級干燥步驟”)或指術語“擴散和解吸”(也是指“二級干燥步驟”)，或指二者。

116、如本文中所使用，并且除非另有說明，術語“升華”應理解為物質(zhì)在真空下直接從固態(tài)到氣態(tài)而不經(jīng)過液態(tài)的轉(zhuǎn)變。

117、在本發(fā)明的方法的一些實施方案中，在升華步驟期間的壓力可以在0帕至70帕之間，優(yōu)選5帕至40帕之間，最優(yōu)選5帕至35帕之間，并且可以在這樣的過程期間進行調(diào)整。

118、如本文中所使用，并且除非另有說明，術語“擴散”應理解為在真空下在絕對零度以上的溫度下，所有(液體或氣體)粒子的熱運動。擴散解釋了分子從濃度較高的區(qū)域到濃度較低的區(qū)域的凈通量。

119、如本文中所使用，并且除非另有說明，術語“解吸”應理解為物質(zhì)在真空下憑此從表面或通過表面釋放到氣相中的現(xiàn)象。特別地，大部分未冷凍的水(即，溶解在固體非晶相中的水)通過吸附和吸收結合到容器的內(nèi)表面，并通過解吸逐漸被去除。

120、在本發(fā)明的方法的一些實施方案中，在擴散和解吸步驟期間的壓力可以在0帕至70帕之間，優(yōu)選5帕至40帕之間，最優(yōu)選5帕至35帕之間，并且可以在這樣的過程期間進行調(diào)整。

121、如本文中所使用，并且除非另有說明，術語“低溫冰冷凝器”應理解為設計來快速吸收蒸汽和降低容器壓力的系統(tǒng)。

122、在另外的實施方案中，在干燥過程期間，所述旋轉(zhuǎn)冷凍容器在所述至少一個單獨控制的加熱源前面沿其縱軸在約5-12?rpm下緩慢轉(zhuǎn)動，持續(xù)約1至120分鐘之間的時間。

123、在本發(fā)明的一些實施方案中，所述容器的連續(xù)旋轉(zhuǎn)可以沿其縱軸在大約150和600rpm/s2下以及在150至600?rpm/s2之間進行，優(yōu)選在大約3和25?rpm下以及在3至25?rpm之間進行，更優(yōu)選在大約5和12?rpm下以及在5至12?rpm之間進行。

124、在本發(fā)明的方法的一些實施方案中，初級干燥步驟(也是指升華)，可以占用約1至60分鐘，優(yōu)選5至30分鐘，更優(yōu)選10至20分鐘，最優(yōu)選直到殘余水分為0至30%，優(yōu)選2至25%，更優(yōu)選3至20%，最優(yōu)選5至15%。

125、在本發(fā)明的方法的一些實施方案中，二級干燥步驟(也是指擴散和解吸)，可以占用約1至60分鐘，優(yōu)選5至30分鐘，更優(yōu)選10至20分鐘。供選擇地，二級干燥持續(xù)進行，直到組合物具有可接受的用于長期儲存的水分含量，最優(yōu)選殘余水分含量為約0至5%，優(yōu)選0.2至4%，最優(yōu)選0.5至3%。

126、在本發(fā)明的方法的另一實施方案中，在二級干燥步驟期間的溫度可以在10°c至70°c之間，更優(yōu)選20°c至60°c之間，以及最優(yōu)選30°c至50°c之間。

127、在本發(fā)明的方法的一些實施方案中，執(zhí)行整個干燥步驟持續(xù)至少60分鐘的一段時間，優(yōu)選少于或等于120分鐘。

128、在本發(fā)明的具體的實施方案中，所述干燥室是環(huán)形帶系統(tǒng)，其將所述旋轉(zhuǎn)冷凍容器運送到至少一個單獨控制的非接觸加熱源前面；特別地，所述單獨控制的加熱源可以選自紅外輻射器和/或電加熱墊。

129、如本文中所使用，并且除非另有說明，術語“環(huán)形帶系統(tǒng)”應理解為將容器以連續(xù)方式放置到加熱源前面的運送系統(tǒng)。

130、如本文中所使用，并且除非另有說明，術語“加熱源”用于指示加熱器，其至少暫時地與附近的容器相關聯(lián)，并且其被驅(qū)動以主要向所述容器提供熱，優(yōu)選不向其他容器提供熱能。該裝置通過輻射或傳導均勻地傳遞能量用于干燥(升華和解吸)，并且可以按單位劑量進行調(diào)節(jié)。

131、在本發(fā)明的方法的一些實施方案中，加熱器可以是紅外輻射器，其中紅外加熱允許僅對不透明物體而不是它們周圍的空氣進行非接觸式熱傳遞。

132、在另一實施方案中，紅外輻射器達到大約100和450°c以及在100至450°c之間的溫度，并且可以在這樣的過程期間進行調(diào)整。

133、如本文中所使用，并且除非另有說明，術語“紅外”，也被理解為紅外(ir)熱成像法，其允許在升華界面處對產(chǎn)品溫度進行非接觸式、實時和空間監(jiān)測。在另外的方面，本發(fā)明提供通過如本文中所公開的方法可獲得的冷凍干燥的含有核酸的組合物。

134、特別地，本發(fā)明提供容器，其包含呈粉末形式的含有核酸的組合物，其中所述粉末在所述容器的圓周內(nèi)表面處呈薄層形式。

135、實施例

136、實施例1

137、材料和方法

138、含有mrna的脂質(zhì)納米顆粒使用混合裝置來制備，然后去除乙醇，用0.22?μm濾器過濾，并且裝入2ml?i型透明玻璃小瓶(每個小瓶0.5?ml的填充體積)。

139、使藥物產(chǎn)品制劑經(jīng)受在單一小瓶設備上運行的連續(xù)冷凍干燥，所述藥物產(chǎn)品制劑含有在補充15%海藻糖的tris緩沖鹽水(tbs)中的500?μl包封mrna的脂質(zhì)納米顆粒(包含可電離脂質(zhì)、磷脂、固醇和peg脂質(zhì))。

140、在旋轉(zhuǎn)冷凍(圖1)期間，小瓶圍繞其縱軸以大約每分鐘2500轉(zhuǎn)(rpm)轉(zhuǎn)動(旋轉(zhuǎn))，表明2500?rpm產(chǎn)生平均鋪展的產(chǎn)品層，其具有產(chǎn)品層底部和頂部之間的10%的最大層厚度差異。應用的處理條件為：15°c/min的冷卻速率直到-70°c，保守的干燥設置，在旋轉(zhuǎn)冷凍期間150?rpm/s2的加速。干燥循環(huán)在保守設置下進行，紅外(ir)加熱器(圖3)在大約0.6瓦特時關閉，其是升華500?mg的冰所需的能量值。冷凍干燥循環(huán)的持續(xù)時間是1.5小時。重構后，確定粒度、多分散性指數(shù)和視覺外觀。

141、結果

142、產(chǎn)品的溫度以15°c/min的冷卻速率降低，直到-70°c，在該溫度下產(chǎn)品完全穩(wěn)定到設定點溫度(圖4)。

143、圖5描繪了在初級和二級干燥階段期間溫度的升高，該初級和二級干燥階段分別在箭頭的左側(cè)和右側(cè)。

144、所得到的干燥的產(chǎn)品形成圍繞小瓶內(nèi)壁均勻分布的薄層(圖6)。用水重構粉末形成白色至灰白色的半透明液體。10倍稀釋的產(chǎn)品產(chǎn)生澄清的溶液。重構的和10倍稀釋的液體均無可見顆粒(表1)。干燥的產(chǎn)品重構后粒度輕微增加，然而，重構的樣品證實高度的粒度均勻性(即，尺寸分布窄)，其反映在低的多分散性指數(shù)值中。

145、表1.干燥的和重構的產(chǎn)品的視覺外觀和顆粒表征

146、

147、實施例2

148、在該實施例中，使用不同濃度的蔗糖對經(jīng)典冷凍干燥與旋轉(zhuǎn)冷凍干燥中的冷凍干燥的塊狀物進行了比較。

149、lnp產(chǎn)生：

150、使用t型接頭混合器將酸性緩沖液中的mrna與乙醇中的脂質(zhì)混合物混合。在混合之后，lnp分散體使用透析緩沖液置換為中性緩沖液，并且然后通過離心濃縮來濃縮。向最終的lnp分散體中加入不同濃度的蔗糖(5%、8%、10%、15%和20%?w/v)作為冷凍保護劑。

151、凍干和分析：

152、常規(guī)的凍干使用martin?christ?epsilon?2-6?lscplus冷凍干燥器進行。旋轉(zhuǎn)冷凍干燥根據(jù)本文中所公開的方法使用rheavita?multi?vial?unit進行。

153、在凍干之后，樣品在wfi?(注射用水)中重構。在重構之前和之后評估樣品的視覺外觀。

154、結果

155、雖然對于較低水平的冷凍保護劑(蔗糖)，凍干塊狀物的視覺外觀良好，但是15%以上的增加的蔗糖含量導致塊狀物的開裂和收縮以及融化的跡象(見圖7，對于濃度15%和20%w/v))。因此，當加入高水平的冷凍保護劑時，旋轉(zhuǎn)冷凍干燥技術產(chǎn)生fd塊狀物的改善的視覺外觀和更好的視覺質(zhì)量。所有標準的關鍵質(zhì)量屬性(cqa)都是相當?shù)?，在大小、pdi、ph、滲透壓(osmolality)、mrna含量和包封效率方面差異極小。