本發(fā)明涉及雷公藤甲素誘導(dǎo)的肝毒性緩解，尤其涉及一種基于麥角硫因的降低雷公藤甲素誘導(dǎo)肝毒性的方法。

背景技術(shù)：

1、雷公藤甲素(tp)是存在于衛(wèi)矛科植物tripterygium?wilfordii?hook?f根、葉、花、果實(shí)中的環(huán)氧二萜內(nèi)酯類化合物，具有較強(qiáng)的抗癌和抗炎活性。雷公藤甲素可通過抑制tnf-α(腫瘤壞死因子-α，一種促炎細(xì)胞因子),il-6(白細(xì)胞介素-6，一種促炎細(xì)胞因子),cox2和il-18等細(xì)胞因子的表達(dá)同時抑制nf-κb、nlrp3、hmgb1、atf6/chop、rank/rank/opg，和nrf2信號通路等多種方法減少細(xì)胞黏附和凋亡起到抗炎癥作用，但其具體機(jī)理仍然未知。盡管雷公藤甲素有較強(qiáng)的抗炎和抗癌活性，但是其結(jié)構(gòu)上的眾多環(huán)氧橋決定了其必然有較強(qiáng)的毒性。

2、然而，鑒于雷公藤甲素引發(fā)的各種器官毒性，包括肝臟、腎臟、卵巢和心臟在內(nèi)的各種器官的潛在毒性，特別是肝毒性，其臨床應(yīng)用受到了很大限制。研究發(fā)現(xiàn)，tp誘導(dǎo)的肝毒性與氧化應(yīng)激(ros)有關(guān)，ros是由氧化和抗氧化劑之間的不平衡引起的。ros導(dǎo)致脂質(zhì)和dna損傷，導(dǎo)致細(xì)胞器功能障礙和損傷。大量體內(nèi)和體外研究發(fā)現(xiàn)，tp可導(dǎo)致ros和丙二醛(mda)增加，超氧化物歧化酶(sod)、過氧化氫酶(cat)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(gst)和gsh(還原型谷胱甘肽，細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)節(jié)代謝物和抗氧化劑)減少。

3、麥角硫因(egt)是一種天然的組氨酸衍生化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。大量研究證實(shí)，天然抗氧化劑對預(yù)防氧化應(yīng)激引起的肝臟疾病具有積極作用這是由于它們具有清除自由基的能力，并增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性。麥角硫因(egt)作為一種抗氧化劑，可以有效地消除羥基自由基，與亞鐵和銅離子螯合，抑制過氧化氫產(chǎn)生羥基自由基，激活細(xì)胞的自然抗氧化防御機(jī)制，能夠減輕由氧化應(yīng)激引起的肝臟損傷。在生理ph值下，麥角硫因(egt)是穩(wěn)定的，因?yàn)樗饕粤蛲男问酱嬖?，使其能夠抵抗自氧化。麥角硫?egt)可以清除活性氧和活性氮等物質(zhì)，從而降低氧化應(yīng)激。

4、現(xiàn)有技術(shù)中用于配伍雷公藤甲素使用降低其毒性的藥物有藏紅花素、刺山柑或刺山柑提取物，但這些藥物獲取方法主要為植物提取，都為混合物，組成成分不明確，且藥效及毒理作用尚未完全明確，與雷公藤甲素聯(lián)用可能會導(dǎo)致其他癥狀，反而不利于雷公藤甲素的臨床應(yīng)用。

5、為此，設(shè)計(jì)一種基于麥角硫因的降低雷公藤甲素誘導(dǎo)肝毒性的方法，為解決上述技術(shù)問題提供另一種技術(shù)方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題為：提供一種基于麥角硫因的降低雷公藤甲素誘導(dǎo)肝毒性的方法，以解決其余藥物緩解雷公藤甲素成本高、安全性低、效果不顯著的問題。

2、為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案：

3、一種基于麥角硫因的降低雷公藤甲素誘導(dǎo)肝毒性的方法，步驟如下：

4、s1：雷公藤甲素和麥角硫因聯(lián)合處理硫酸葡聚糖鈉鹽誘導(dǎo)建立的炎癥動物模型；根據(jù)疾病活動指數(shù)評分、結(jié)腸長度、結(jié)腸組織病理學(xué)染色、結(jié)腸組織硫氧還蛋白還原酶活性、谷胱甘肽水平、結(jié)腸組織硫氧還蛋白體系蛋白水平以及炎癥因子表達(dá)水平的指標(biāo)判斷麥角硫因?qū)坠偌姿厮幮У挠绊懀?/p>

5、s2：根據(jù)肝臟系數(shù)、血清谷草氨酸/谷丙氨酸水平、肝臟組織病理學(xué)染色的急性毒性指標(biāo)判斷麥角硫因降低雷公藤甲素誘導(dǎo)肝毒性的效果。

6、作為本發(fā)明提供的所述的一種基于麥角硫因的降低雷公藤甲素誘導(dǎo)肝毒性的方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述s1步驟中，建立炎癥動物模型，步驟如下：

7、用含3％dss的飲用水喂養(yǎng)小鼠，持續(xù)7天，同時將雷公藤甲素和麥角硫因藥物通過腹腔注射的方式給小鼠送藥；第8天將小鼠的飲用水換為無菌水，并在禁食處理后得到炎癥動物模型，對小鼠疾病活動指數(shù)、結(jié)腸長度、結(jié)腸組織病理學(xué)進(jìn)行分析。

8、作為本發(fā)明提供的所述的一種基于麥角硫因的降低雷公藤甲素誘導(dǎo)肝毒性的方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述s1步驟中，對結(jié)腸組織進(jìn)行提取，步驟如下：

9、取結(jié)腸組織，放于離心管中；

10、加入緩沖液pbs和酶抑制劑pmsf，并進(jìn)行勻漿；

11、對勻漿后的樣品進(jìn)行離心，取上清液。

12、作為本發(fā)明提供的所述的一種基于麥角硫因的降低雷公藤甲素誘導(dǎo)肝毒性的方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述s1步驟中，對蛋白濃度測定，步驟如下：

13、蛋白溶液經(jīng)pbs稀釋，每孔取樣加入酶標(biāo)板中，隨后每孔加入bca工作液，孵育后，檢測吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白濃度。

14、作為本發(fā)明提供的所述的一種基于麥角硫因的降低雷公藤甲素誘導(dǎo)肝毒性的方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述s1步驟中，對結(jié)腸組織trxr活性、gsh水平檢測，步驟如下：

15、a.進(jìn)行trxr活性檢測，步驟如下：

16、將蛋白濃度測定后，將pbs緩沖液將樣品稀釋至同一濃度；

17、在酶標(biāo)板中加入蛋白和nadph；

18、室溫孵育后，特異性抑制對照孔中trxr活性；

19、然后加入nadph和dtnb的混合液，檢測5min內(nèi)每隔1min的吸光度變化；

20、b.進(jìn)行g(shù)sh水平檢測，步驟如下：

21、酶標(biāo)板中加入蛋白，并將每個蛋白樣品設(shè)置3個重復(fù)孔及一個對照孔；

22、在重復(fù)孔的內(nèi)部添加nadph和gr，在對照孔的內(nèi)部添加nadph；

23、室溫孵育2min后，加入nadph和dtnb的混合液，檢測5min內(nèi)吸光度變化，樣品gsh水平等于樣品孔斜率減去對照孔斜率。

24、作為本發(fā)明提供的所述的一種基于麥角硫因的降低雷公藤甲素誘導(dǎo)肝毒性的方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述s1步驟中，對結(jié)腸組織trx體系蛋白水平檢測，步驟如下：

25、將蛋白濃度測定后，將處理后的樣品，進(jìn)行稀釋；

26、置于100℃金屬浴中進(jìn)行反應(yīng)，持續(xù)時間為10分鐘；

27、反應(yīng)完成后，讓樣品自然冷卻并保存；

28、采用western?blot技術(shù)檢測trx體系相關(guān)抗氧化酶的蛋白水平。

29、作為本發(fā)明提供的所述的一種基于麥角硫因的降低雷公藤甲素誘導(dǎo)肝毒性的方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述s1步驟中，對結(jié)腸組織炎癥因子水平檢測，步驟如下：

30、依據(jù)trizol法的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，對結(jié)腸組織樣本進(jìn)行總rna的提取，提取得到的rna，采用兩步法將其反轉(zhuǎn)錄為cdna，利用實(shí)時熒光定量pcr技術(shù)對炎癥因子il-1β、il-6和tnf-α的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。

31、作為本發(fā)明提供的所述的一種基于麥角硫因的降低雷公藤甲素誘導(dǎo)肝毒性的方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述s2步驟中，對肝臟的急性毒性檢測步驟如下：

32、動物模型建立：用含3％dss的飲用水喂養(yǎng)小鼠，持續(xù)7天，同時將tp和egt藥物通過腹腔注射的方式給小鼠送藥；第8天斷食12h后，眼球取血并提取小鼠肝組織；

33、肝臟毒性分析：將完整切除后的肝臟，在清理后，稱取肝臟重量，并計(jì)算肝臟系數(shù)；

34、將提取的血液室溫靜置，待上下分層后，于離心力為2500g、溫度為4℃下離心15min，然后收集上清液，將上清液用生理鹽水稀釋20倍后，使用全自動生化分析儀檢測血清中的ast、alt水平，小鼠肝組織經(jīng)4％多聚甲醛固定后，用于he染色觀察細(xì)胞具體形態(tài)結(jié)構(gòu)和病理損傷。

35、本發(fā)明還公開了一種藥物組合物，包括麥角硫因和雷公藤甲素，麥角硫因和雷公藤甲素的質(zhì)量比為1-20∶1。

36、作為本發(fā)明提供的所述的一種藥物組合物的一種優(yōu)選實(shí)施方式，藥物組合物在制備緩解炎癥疾病的藥物中的應(yīng)用。

37、同時，通過以上技術(shù)方案，本發(fā)明至少具備以下有益效果：

38、(1)本發(fā)明提供的一種基于麥角硫因的降低雷公藤甲素誘導(dǎo)肝毒性的方法，通過采用麥角硫因與雷公藤甲素的配合使用，進(jìn)而能夠增加麥角硫因的用途，同時緩解具體疾病模型下雷公藤甲素誘導(dǎo)的急性肝損傷，且不影響其藥效；從而為雷公藤甲素輔助用藥提供新思路，減少臨床用藥副作用；

39、(2)在使用時，不僅拓寬了egt的應(yīng)用范圍，同時在不影響tp藥效的情況下，緩解了疾病狀態(tài)下tp誘導(dǎo)的急性肝損傷，為tp的臨床輔助用藥提供了新思路，開拓了拮抗雷公藤甲素肝毒性藥物的應(yīng)用前景；

40、(3)提供現(xiàn)有常用且研究透徹、成本較低的臨床藥物麥角硫因，保證其用藥安全性，降低導(dǎo)致其他癥狀的風(fēng)險(xiǎn)。