本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，尤其涉及fundc1抑制劑在制備防治皮膚光損傷藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、線粒體通過(guò)氧化磷酸化和etc產(chǎn)生細(xì)胞的大部分能量，以atp形式存在，為細(xì)胞生命活動(dòng)提供能量。在氧代謝過(guò)程中，線粒體產(chǎn)生一種天然的副產(chǎn)物mtros，導(dǎo)致mtdna突變。到達(dá)地球表面的紫外輻射(ultraviolet?radiation，uvr，295～400nm)，包括uva(長(zhǎng)波黑斑效應(yīng)紫外線，320～400nm)和uvb(中波紫外線，280～320nm)，uvb在到達(dá)地面的紫外線(uv)中所占比例雖然僅為5％，但其能量高于uva，其對(duì)皮膚產(chǎn)生的副反應(yīng)更顯著。uvb能夠穿透表皮，而uva主要穿透真皮。uv對(duì)人類皮膚可以產(chǎn)生急性或慢性的光損傷，急性光損傷主要由uvb引起。紫外線會(huì)損害皮膚細(xì)胞(包括角質(zhì)形成細(xì)胞，表皮干細(xì)胞，黑色素細(xì)胞，成纖維細(xì)胞等)中的線粒體。uv可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和線粒體dna(mitochondrial?dna，mtdna)的損傷，包括線粒體ros(mitochondrial?ros，mtros)產(chǎn)生和mtdna突變，從而導(dǎo)致線粒體去極化，引起線粒體功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致皮膚光損傷。基于前述機(jī)制，線粒體異常參與uv誘導(dǎo)的皮膚損傷。

2、fundc1是調(diào)控線粒體自噬的關(guān)鍵受體，由155個(gè)氨基酸構(gòu)成，是一種在大部分哺乳動(dòng)物(包括人類)中保守性較高的跨膜蛋白。fundc1可與lc3相互反應(yīng)介導(dǎo)線粒體自噬。正常情況下，fundc1能穩(wěn)定存在于線粒體外膜而不介導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生，即，在正常條件下，fundc1被酪氨酸激酶磷酸化，此時(shí)與lc3的親和作用力較弱，自噬被抑制；在缺血缺氧條件下，酪氨酸激酶被滅活，fundc1與lc3的親和作用力顯著提升，并且fundc1可以被絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶通過(guò)去磷酸化的形式激活，進(jìn)而誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生。

3、線粒體自噬能夠清除細(xì)胞內(nèi)受損的線粒體和不需要的線粒體，涉及不同病理?xiàng)l件下的細(xì)胞能量平衡。光損傷過(guò)程中，pink1-parkin介導(dǎo)的線粒體自噬需在一定條件下才被激活，bnip3介導(dǎo)的線粒體自噬有時(shí)不足以保護(hù)細(xì)胞免受光損傷。雖然有研究表明光照輻射可以誘導(dǎo)部分線粒體發(fā)生自噬，但fundc1介導(dǎo)的線粒體自噬在紫外線輻射(uvr)光損傷中表現(xiàn)如何尚無(wú)報(bào)道，研究fundc1在uvr引起的光損傷中所起的作用對(duì)未來(lái)緩解皮膚問(wèn)題具有重要意義。

4、此外，一方面由于對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解存在差異；另一方面由于申請(qǐng)人做出本發(fā)明時(shí)研究了大量文獻(xiàn)和專利，但篇幅所限并未詳細(xì)羅列所有的細(xì)節(jié)與內(nèi)容，然而這絕非本發(fā)明不具備這些現(xiàn)有技術(shù)的特征，相反本發(fā)明已經(jīng)具備現(xiàn)有技術(shù)的所有特征，而且申請(qǐng)人保留在背景技術(shù)中增加相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)之權(quán)利。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)之不足，本發(fā)明第一方面提供了fundc1抑制劑在制備防治皮膚光損傷藥物中的應(yīng)用。fundc1抑制劑包括能夠調(diào)控受試者體fundc1表達(dá)情形的小分子化合物、高分子聚合物、多肽、蛋白、核酸物質(zhì)或病毒。核酸物質(zhì)還包括基于基因工程方式所沉默、敲除或部分敲除有關(guān)fundc1的相關(guān)物質(zhì)。fundc1抑制劑通過(guò)抑制或降低fundc1的表達(dá)來(lái)緩解、減輕或防治皮膚光損傷。

2、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，fundc1抑制劑通過(guò)抑制或降低fundc1的表達(dá)以降低細(xì)胞內(nèi)ros水平，進(jìn)而緩解、減輕或防治皮膚光損傷。

3、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，fundc1抑制劑通過(guò)抑制或降低fundc1的表達(dá)以減少細(xì)胞凋亡和壞死，進(jìn)而緩解、減輕或防治皮膚光損傷。

4、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，fundc1抑制劑通過(guò)抑制或降低fundc1的表達(dá)以減輕細(xì)胞核損傷，進(jìn)而緩解、減輕或防治皮膚光損傷。

5、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，fundc1抑制劑通過(guò)抑制或降低fundc1的表達(dá)以降低反映細(xì)胞核損傷的γh2ax表達(dá)水平，進(jìn)而緩解、減輕或防治皮膚光損傷。

6、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，fundc1抑制劑通過(guò)抑制或降低fundc1的表達(dá)以減輕線粒體損傷，進(jìn)而緩解、減輕或防治皮膚光損傷。

7、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，fundc1抑制劑通過(guò)抑制或降低fundc1的表達(dá)以調(diào)節(jié)線粒體的分布，進(jìn)而緩解、減輕或防治皮膚光損傷。

8、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，fundc1抑制劑通過(guò)抑制或降低fundc1的表達(dá)以促進(jìn)線粒體均勻分布，進(jìn)而緩解、減輕或防治皮膚光損傷。

9、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，fundc1抑制劑通過(guò)抑制或降低fundc1的表達(dá)以調(diào)節(jié)線粒體膜的極化情況，進(jìn)而緩解、減輕或防治皮膚光損傷。

10、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，fundc1抑制劑通過(guò)抑制或降低fundc1的表達(dá)以促進(jìn)線粒體膜極化，進(jìn)而緩解、減輕或防治皮膚光損傷。

11、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，fundc1抑制劑通過(guò)抑制或降低fundc1的表達(dá)以調(diào)節(jié)線粒體膜電位，進(jìn)而緩解、減輕或防治皮膚光損傷。

12、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，fundc1抑制劑通過(guò)抑制或降低fundc1的表達(dá)以促進(jìn)線粒體膜電位增高，進(jìn)而緩解、減輕或防治皮膚光損傷。

13、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，fundc1抑制劑通過(guò)抑制或降低fundc1的表達(dá)以促進(jìn)線粒體蛋白cox4的表達(dá)，進(jìn)而緩解、減輕或防治皮膚光損傷。

14、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，fundc1抑制劑通過(guò)抑制或降低fundc1的表達(dá)以補(bǔ)充pink1-parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，進(jìn)而保護(hù)線粒體免于凋亡。

15、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，fundc1抑制劑通過(guò)抑制或降低fundc1的表達(dá)以上調(diào)抗凋亡蛋白bcl2的表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)線粒體免于凋亡。

16、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，fundc1抑制劑通過(guò)抑制或降低fundc1的表達(dá)以下調(diào)促凋亡蛋白bax的表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)線粒體免于凋亡。

17、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，fundc1抑制劑通過(guò)抑制或降低fundc1的表達(dá)以上調(diào)抗凋亡蛋白bcl2的表達(dá)和下調(diào)促凋亡蛋白bax的表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)線粒體免于凋亡。

18、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，光損傷為由紫外線輻射引起的損傷。

19、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，光損傷為由中波紫外線(uvb)引起的損傷。

20、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，基因工程方式中的沉默為使用shrna對(duì)fundc1基因進(jìn)行沉默。

21、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，shrna的序列如seq?id?no：1～seq?id?no：3之一所示。

22、本發(fā)明第二方面提供一種特異性抑制或降低fundc1的表達(dá)的shrna序列，其序列如seq?id?no：1～seq?id?no：3之一所示。

23、本發(fā)明第三方面提供一種載體，其包括本發(fā)明第二方面提供的shrna序列。

24、本發(fā)明第四方面提供本發(fā)明第二方面提供的shrna序列或本發(fā)明第三方面提供的載體在制備fundc1基因缺失細(xì)胞株中的用途。

25、本發(fā)明第五方面提供一種用于敲減fundc1基因的試劑盒，其包含本發(fā)明第二方面提供的shrna序列或本發(fā)明第三方面提供的載體。

26、本發(fā)明第六方面提供一種特異性抑制或降低fundc1的表達(dá)的sgrna序列，其序列如seq?id?no：14～seq?id?no：16之一所示。

27、本發(fā)明第七方面提供一種載體，其包含本發(fā)明第六方面提供的sgrna序列。

28、本發(fā)明第八方面提供一種用于敲減fundc1基因的試劑盒，其包含第六方面提供的sgrna序列或本發(fā)明第七方面提供的載體。

29、本發(fā)明第九方面提供一種防治皮膚光損傷的藥物組合物，藥物組合物包括fundc1以及藥學(xué)上可接受的載體或輔料，其中，fundc1抑制劑包括能夠調(diào)控受試者體fundc1表達(dá)情形的小分子化合物、高分子聚合物、多肽、蛋白、核酸物質(zhì)或病毒，其中所述核酸物質(zhì)還包括基于基因工程方式沉默、敲除或部分敲除有關(guān)fundc1的相關(guān)物質(zhì)。

30、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，基因工程方式中的沉默為使用shrna對(duì)fundc1基因進(jìn)行沉默。

31、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，shrna的序列如seq?id?no：1～seq?id?no：3之一所示。

32、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，基因工程方式中的沉默為使用sgrna對(duì)fundc1基因進(jìn)行沉默。

33、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，sgrna的序列如seq?id?no：14～seq?id?no：6之一所示。

34、本發(fā)明第十方面提供一種制備防治皮膚光損傷藥物的方法，該方法包括：提供fundc1抑制劑；將fundc1抑制劑與藥學(xué)上可接受的載體或輔料混合；將混合物制成藥物形式，其中，fundc1抑制劑包括能夠調(diào)控受試者體fundc1表達(dá)情形的小分子化合物、高分子聚合物、多肽、蛋白、核酸物質(zhì)或病毒，其中所述核酸物質(zhì)還包括基于基因工程方式沉默、敲除或部分敲除有關(guān)fundc1的相關(guān)物質(zhì)。

35、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，基因工程方式中的沉默為使用shrna對(duì)fundc1基因進(jìn)行沉默。

36、根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，shrna的序列如seq?id?no：1～seq?id?no：3之一所示。

37、本發(fā)明第十一方面提供一種以fundc1為靶標(biāo)在篩選防治皮膚光損傷的藥物中的應(yīng)用。

38、本發(fā)明第十二方面提供一種治療患者皮膚光損傷的方法。該方法包括向患者施加有效量的fundc1抑制劑。其中，fundc1抑制劑包括能夠調(diào)控受試者體fundc1表達(dá)情形的小分子化合物、高分子聚合物、多肽、蛋白、核酸物質(zhì)或病毒，其中所述核酸物質(zhì)還包括基于基因工程方式所沉默、敲除或部分敲除有關(guān)fundc1的相關(guān)物質(zhì)。

39、fundc1(fun14?domain?containing?1)是一種與線粒體自噬(mitophagy)相關(guān)的蛋白。目前，針對(duì)fundc1的特異性抑制，現(xiàn)有技術(shù)提供了一些方法和化合物被用來(lái)抑制或調(diào)節(jié)fundc1的活性，例如：小干擾rna(sirna)或短發(fā)夾rna(shrna)：這些是基因沉默技術(shù)，可以用來(lái)特異性地降低fundc1的表達(dá)。fundc1磷酸化調(diào)節(jié)劑：ulk1抑制劑：如sbi-0206965，可以間接影響fundc1的活性，因?yàn)閡lk1參與fundc1的磷酸化。pgam5抑制劑：pgam5是fundc1的去磷酸化酶，抑制pgam5可能影響fundc1的活性。線粒體自噬抑制劑：雖然不直接針對(duì)fundc1，但可以影響fundc1介導(dǎo)的線粒體自噬過(guò)程：mdivi-1：線粒體分裂抑制劑，3-甲基腺嘌呤(3-ma)：自噬抑制劑?？寡趸瘎耗承┛寡趸瘎┛赡芡ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激來(lái)間接影響fundc1的活性，如n-乙酰半胱氨酸(nac)。特異性肽抑制劑還包括小分子化合物。

40、有益效果：本發(fā)明利用c57bl/6小鼠建立了皮膚光損傷模型，由于uvb主要穿透皮膚的表皮，因而利用uvb照射hacat細(xì)胞后建立細(xì)胞光損傷模型，其中，大體照片發(fā)現(xiàn)光損傷的臨床特征如皮膚紅斑、鱗屑和結(jié)痂，以及皮膚鏡偏振光下可以觀察到明顯的毛細(xì)血管擴(kuò)張。組織學(xué)檢查(he切片)顯示，小鼠表皮在uvb照射后24h即開始增厚，72h有明顯結(jié)痂，真皮層有大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而確認(rèn)成功建立了小鼠的皮膚光損傷模型。利用cck8評(píng)估uvb照射后的細(xì)胞存活率，在30mj/cm2的uvb劑量下，細(xì)胞存活率下降到約60％。uvb為30mj/cm2照射后觀察到細(xì)胞內(nèi)ros、細(xì)胞凋亡和壞死的增加以及γh2ax表達(dá)水平的上升，進(jìn)一步表明本研究成功建立了uvb誘導(dǎo)的hacat細(xì)胞的光損傷模型。

41、關(guān)于uvb誘導(dǎo)皮膚光損傷中與線粒體有關(guān)的機(jī)制，多數(shù)都涉及與線粒體功能及其相關(guān)的信號(hào)通路。為了進(jìn)一步探索線粒體在uvb誘導(dǎo)的光損傷中的機(jī)制，本發(fā)明通過(guò)使用geo(gse138800)數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)uvb不同劑量(20mj/cm2和40mj/cm2)照射前后的差異基因與amigo?2數(shù)據(jù)庫(kù)中與線粒體相關(guān)的基因取交集，將這些基因進(jìn)行kegg富集，提示線粒體自噬在uvb誘導(dǎo)的光損傷中發(fā)揮了重要作用。進(jìn)一步地，本發(fā)明第二部分探討線粒體自噬以及線粒體凋亡在uvb誘導(dǎo)的皮膚光損傷中的作用。

42、在哺乳動(dòng)物中，線粒體自噬包括pink1/parkin依賴的泛素介導(dǎo)的線粒體自噬，以及bnip3、fundc1依賴的受體介導(dǎo)的線粒體自噬。本發(fā)明通過(guò)western?blot檢測(cè)uvb照射小鼠背部皮膚后線粒體自噬相關(guān)分子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)fundc1在uvb照射后24h和72h下降，而bnip3、pink1和parkin無(wú)變化，上述結(jié)果表明fundc1受體介導(dǎo)的線粒體自噬在uvb誘導(dǎo)的光損傷中起著關(guān)鍵作用，而泛素介導(dǎo)(pink1/parkin)的線粒體自噬在uvb照射后并未直接激活。同樣，在暴露于30mj/cm2的uvb的hacat細(xì)胞中，fundc1水平降低，而bnip3的表達(dá)增加，上述表明uvb照射后發(fā)生了受體介導(dǎo)的線粒體自噬的變化。相反，pink1和parkin，uvb暴露前后沒(méi)有變化，與小鼠的結(jié)果相一致。此外，本發(fā)明還驗(yàn)證了fundc1在人體標(biāo)本中的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)在陽(yáng)光暴露的皮膚中，fundc1的表達(dá)減少，與小鼠和細(xì)胞均表現(xiàn)出一致性的下調(diào)。

43、上述已經(jīng)證明fundc1介導(dǎo)的線粒體自噬在uvb照射的小鼠皮膚和hacat細(xì)胞中被抑制，因而本發(fā)明通過(guò)過(guò)表達(dá)fundc1以促進(jìn)線粒體自噬，進(jìn)而加強(qiáng)清除受損線粒體的能力以及抑制線粒體凋亡，達(dá)到緩解或防治光損傷的目的。出乎意料地，fundc1過(guò)表達(dá)加劇了uvb誘導(dǎo)的線粒體損傷和光損傷。在uvb照射后，fundc1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降到30％，伴隨著ros、細(xì)胞凋亡和γh2ax水平的升高；線粒體損傷的加重包括線粒體沿細(xì)胞核的長(zhǎng)軸沿兩極分布更加顯著、mtros進(jìn)一步增加以及線粒體膜電位進(jìn)一步下降。fundc1過(guò)表達(dá)并沒(méi)有通過(guò)促進(jìn)受損線粒體的清除來(lái)保護(hù)線粒體凋亡介導(dǎo)的光損傷。相反，線粒體蛋白cox4完全消失提示fundc1過(guò)表達(dá)后，uvb照射hacat細(xì)胞可能使健康和受損線粒體被無(wú)差別清除。

44、鑒于fundc1過(guò)表達(dá)加劇了uvb誘導(dǎo)的光損傷，本發(fā)明探索了敲減fundc1是否能夠保護(hù)hacat細(xì)胞免受uvb誘導(dǎo)的光損傷。在fundc1敲減后，細(xì)胞存活率提高至80％。與uvb組相比，ros水平、凋亡和γh2ax表達(dá)減少。在uvb照射后，fundc1敲減同樣減輕了線粒體損傷，表現(xiàn)為線粒體分布沿細(xì)胞核均勻分布、線粒體膜電位復(fù)極化和mtros積累減少。在機(jī)制研究方面，本發(fā)明的結(jié)果表明，fundc1敲減通過(guò)補(bǔ)償pink1/parkin介導(dǎo)的線粒體自噬減輕了線粒體損傷和光損傷。因此，本發(fā)明提出干預(yù)fundc1介導(dǎo)的線粒體自噬通過(guò)調(diào)控線粒體凋亡途徑可以保護(hù)uvb誘導(dǎo)的線粒體損傷和光損傷，為未來(lái)緩解皮膚光損傷提供了潛在的靶點(diǎn)。