菌的甲醛滅活苗均分別進(jìn)行如下處理：先于10000?12000rpm 高速離心25?35min(較佳為于llOOOrpm高速離心30min)，然后用生理鹽水洗滌，再于 10000?12000rpm高速離心15min(較佳為于llOOOrpm高速離心15min)，從而分別得3種 致病菌的處理后滅活苗；
[0023] 3)、將3種致病菌的處理后滅活苗按照相同的體積比混合后并濃縮至原總體積的 1/5,得防治棘胸蛙爛皮病的全滅活疫苗。
[0024] 作為本發(fā)明的防治棘胸蛙爛皮病的全滅活疫苗的制備方法的改進(jìn)：
[0025] 步驟1)為：取〇D6(i(i值為0.2的致病菌的菌懸液40ml，加入體積％為40%的的甲 醛溶液200y1從而配制成甲醛的體積濃度為0. 2%的疫苗。
[0026] 作為本發(fā)明的防治棘胸蛙爛皮病的全滅活疫苗的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)：
[0027] 步驟2)中用生理鹽水洗滌的次數(shù)為3次。每次洗滌后均于10000?12000rpm高 速離心15min(較佳為于llOOOrpm高速離心15min)。
[0028] 備注說明：瓊氏不動桿菌、魯氏不動桿菌、約氏不動桿菌均為目前能輕易獲得的不 動桿菌。例如：瓊氏不動桿菌可選用編號為1. 8764的瓊氏不動桿菌，魯氏不動桿菌選用編 號為1. 8061的魯氏不動桿菌，約氏不動桿菌選用編號為1. 8030的約氏不動桿菌；上述3種 菌來自中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC)。
[0029] 本發(fā)明還同時提供了按照上述方法制備而得的防治棘胸蛙爛皮病的全滅活疫苗。
[0030] 本發(fā)明首先篩選和鑒定了棘胸蛙"爛皮病"病原菌，在此基礎(chǔ)上，研制了致病菌株 滅活苗，并測定疫苗的免疫力，以期實(shí)現(xiàn)棘胸蛙"爛皮病"的免疫防治。
[0031] 本發(fā)明所提供的全滅活疫苗，具有使用方便、預(yù)防治療并舉、生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)方 便等特點(diǎn)，能用于防治棘胸蛙爛皮病，因而具有很好的推廣使用價值。
[0032] 本發(fā)明使用注射免疫法對棘胸蛙進(jìn)行免疫，取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對棘胸蛙蝌 蚪、成蛙均能提供有效保護(hù)的長效疫苗的商品化生產(chǎn)和推廣。
[0033] 本發(fā)明全滅活疫苗的使用方法為：對棘胸蛙進(jìn)行疫苗頭部注射（0. 1?0. 2ml/ 只），注射一次即可。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面的實(shí)施例有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制 本發(fā)明。
[0035] 以下％均為重量％。
[0036] 下述實(shí)施例中所用的方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
[0037] 實(shí)施例1、致病菌的篩選、鑒定，依次進(jìn)行以下步驟：
[0038] 1)、將患病瀕死的棘胸蛙體表用無菌水沖洗、75% (體積％ )酒精消毒，取其頭部、 腿部、排泄孔周圍爛皮部位深層皮膚及病蛙肝臟組織，分別涂布于LB固體培養(yǎng)基中，30°C 恒溫培養(yǎng)24h。挑取不同形態(tài)的菌落進(jìn)行進(jìn)一步劃線分離，直到獲得純培養(yǎng)。
[0039] LB固體培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基，具體如下：（均為質(zhì)量濃度g/L):蛋白胨20g， K2HP04. 3H202. 5g，MgS040. 73g，甘油 15. 0ml，瓊脂 15. 0g，蒸餾水定容至 1. 0L;pH7. 0, 121°C， 15min滅菌。
[0040] 2)、將上述步驟1)所得的單菌落采用TaKaRa16SrDNABacterial IdentificationPCRKit試劑盒（購自大連寶生物工程有限公司）提取每種菌株的基因 組DNA，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增引物為試劑盒內(nèi)自帶引物，擴(kuò)增反應(yīng)總體 積為 25y1，其中模板DNA1y1，PCRpremix12. 5y1，F(xiàn)orwardprimer0? 25y1，Reverse primerl0.25yl，并用 16S-freeH20 加至 25yl;循環(huán)條件為：94°C預(yù)變性 5min，94°C lmin，50 ?55°Clmin，72°C延伸 1. 5min，30 個循環(huán)后，72°C溫育 1. 5min。PCR產(chǎn)物經(jīng) 1 % 的 瓊脂糖凝膠電泳，分離、回收、純化、連接后送交上海生工有限公司測序部測序。
[0041] 3)、將上述步驟2)所得的結(jié)果經(jīng)Blast軟件分析確定病菌所在屬。結(jié)合分析結(jié)果 確定主要致病菌，并進(jìn)行生理生化試驗(yàn)鑒定菌種。
[0042] 結(jié)果：從患爛皮病的棘胸蛙中共分離得到9株菌株。其16SrDNA序列分析結(jié)果表 明這9株菌株分別屬于摩根氏菌屬（Morganella)、不動桿菌屬（Acinetobacter)、朽1檬酸桿 菌屬（Citrobacter)、芽孢桿菌屬（Bacillus)，其中不動桿菌屬菌株約占62.5%。
[0043] 最終確定不動桿菌屬菌株為本實(shí)驗(yàn)菌株材料。
[0044] 實(shí)施例2、回歸感染實(shí)驗(yàn)
[0045] 依次進(jìn)行以下步驟：
[0046] 1)、將以上所得主要致病菌（即，不動桿菌屬）接種于LB液體培養(yǎng)基中，30°C擴(kuò)大 培養(yǎng)16h后，用無菌生理鹽水配制成0D_值為0. 1、0. 2的混合感染液。實(shí)驗(yàn)組、對照組健 康棘胸蛙各10只，酒精體表消毒后，實(shí)驗(yàn)組對其注射感染菌液，對照組同法注射等量生理 鹽水（表1)。于25°C培養(yǎng)桶中培養(yǎng)，觀察記錄發(fā)病情況，解剖瀕死棘胸蛙并進(jìn)行致病菌分 離和鑒定（表2)。
[0047] 表1回歸感染實(shí)驗(yàn)
[0048]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 防治棘胸蛙爛皮病的全滅活疫苗的制備方法，其特征是包括以下步驟： 1) 、以瓊氏不動桿菌、魯氏不動桿菌、約氏不動桿菌這三種菌作為致病菌，對每種致病 菌分別進(jìn)行如下處理： 取〇D_值為0. 2的致病菌的菌懸液，加入體積濃度為40%的甲醛溶液從而配制成甲醛 的體積濃度為〇. 2%的疫苗；將所述疫苗于37°C恒溫箱中滅活處理96h;從而分別得3種致 病菌的甲醛滅活苗； 2) 、將3種致病菌的甲醛滅活苗均分別進(jìn)行如下處理：先于10000?12000rpm高速離 心25?35min，然后用生理鹽水洗滌，再于10000?12000rpm高速離心15min，從而分別得 3種致病菌的處理后滅活苗； 3) 、將3種致病菌的處理后滅活苗按照相同的體積比混合后并濃縮至原總體積的1/5， 得防治棘胸蛙爛皮病的全滅活疫苗。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治棘胸蛙爛皮病的全滅活疫苗的制備方法，其特征是： 所述步驟1)為：取〇D6(J直為0. 2的致病菌的菌懸液40ml，加入體積濃度為40%的的 甲醛溶液200 y 1從而配制成甲醛的體積濃度為0. 2%的疫苗。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的防治棘胸蛙爛皮病的全滅活疫苗的制備方法，其特征 是： 步驟2)中用生理鹽水洗滌的次數(shù)為3次。
4.如權(quán)利要求1?3任一所述方法制備而得的防治棘胸蛙爛皮病的全滅活疫苗。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種防治棘胸蛙爛皮病的全滅活疫苗，其制備方法為包括以下步驟：1)、以瓊氏不動桿菌、魯氏不動桿菌、約氏不動桿菌這三種菌作為致病菌，對每種致病菌分別進(jìn)行如下處理：取OD600值為0.2的致病菌的菌懸液，加入甲醛溶液從而配制成甲醛濃度為0.2％的疫苗；將疫苗于37℃恒溫箱中滅活處理96h；從而分別得3種致病菌的甲醛滅活苗；2)、將3種致病菌的甲醛滅活苗洗滌后離心，從而分別得3種致病菌的處理后滅活苗；3)、將3種致病菌的處理后滅活苗按照相同的體積比混合后并濃縮至原總體積的1/5，得防治棘胸蛙爛皮病的全滅活疫苗。本發(fā)明的全滅活疫苗，能用于防治棘胸蛙爛皮病，具有很好的推廣使用價值。
【IPC分類】A61P17-00, A61K39-02, A61P31-04
【公開號】CN104524561
【申請?zhí)枴緾N201410719300
【發(fā)明人】鄭榮泉, 宋婷婷, 程宏毅, 俞佳佳, 楊沙, 吳章文, 蔣歡樂, 孫玉婷, 陳一嘉
【申請人】浙江師范大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月1日