一種siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因藥物載體領(lǐng)域，尤其涉及一種SiRNA-PLGA/CSO共軛物膠束及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]siRNA是RNA干擾(RNA interference, RNAi)途徑的中間產(chǎn)物，也是RNAi發(fā)揮作用的效應(yīng)分子。自RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)以來，RNAi已經(jīng)成為細胞遺傳的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器和闡明機體生長、發(fā)病機理和衰老的有力工具。是否能有效地將siRNA遞送到靶細胞部位，與目標(biāo)mRNA結(jié)合，成為限制si RNA的應(yīng)用的關(guān)鍵因素。此外，當(dāng)siRNA被細胞攝取后，被遞送到溶酶體中被溶酶體降解，極大地減弱了 siRNA的治療活性。因此提高siRNA遞送的穩(wěn)定性也十分重要。只有有效的細胞攝取和內(nèi)吞活動以及保持雙鏈SiR NA的完整性才能使siRNA最終發(fā)揮治療效果。siRNA自身的理化性質(zhì)如電負性，分子量大，體積大等特點使得它不能通過被動擴散通過陰性的細胞膜。因此，基因治療的關(guān)鍵在于尋找到需要修飾或者抑制的目的基因和擁有理想的載體。
[0003]非病毒載體安全性高，并且易于大量獲得，因此在基因治療中比病毒性載體更受到廣大研宄者的青睞。非病毒載體在體內(nèi)穿過血液屏障轉(zhuǎn)運至靶細胞，與靶細胞特異性地結(jié)合，進入細胞質(zhì)，釋放出siRNA，需克服多重障礙，因此應(yīng)用載體時既要有利于siRNA的保護和攝取，使其在胞外較少被降解，又要在到達作用部位后，能高效地導(dǎo)入靶細胞，并在胞質(zhì)中有效釋放。在siRNA的傳遞中，最常使用的是陽離子載體，并且以脂質(zhì)體和微粒居多。
[0004]最常用的陽離子脂質(zhì)體為聚合物聚乙烯亞胺(PEI)，在(siRNA的非病毒載體研宄進展，王曦培等，世界臨床藥物研發(fā)前沿，第29卷第I期，2008) —文中，Kim等人將抗VEGFsiRNA和聚乙二醇(PEG)通過二硫鍵形成絡(luò)合物，再與陽離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI)相互作用形成聚電解質(zhì)膠束。前列腺細胞實驗中發(fā)現(xiàn)siRNA能完好地從絡(luò)合物中釋放。這種方法的優(yōu)點是二硫鍵可以在輸送過程中保持穩(wěn)定，在胞外相對高氧化態(tài)環(huán)境中不易斷裂，而在到達腫瘤細胞后，在胞質(zhì)中微量谷胱甘肽(GSH)觸發(fā)下高敏感性二硫鍵斷裂，從而還原釋放siRNA。另外，PEI分子上存在很多氨基，具有所謂“質(zhì)子海綿效應(yīng)，”在入胞后的內(nèi)吞與溶酶化過程中發(fā)揮緩沖作用，破壞并逃過溶酶體的降解，實現(xiàn)基因的高效表達。但是由于PEI具有較高的細胞毒性和有限的生物可降解程度，造成對自身免疫系統(tǒng)的激活和全身給藥的毒性問題。
[0005]聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是一種研宄成熟，生物可降解，具有生物相容性的聚合物，已經(jīng)在制藥界應(yīng)用幾十年。PLGA是被最廣泛研宄的作為藥物控釋的載體共聚物之一。它較陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物相比具有更低毒性，PLGA已被廣泛用于包埋DNA、反義寡核苷酸和siRN A以提高藥物穩(wěn)定性，并實現(xiàn)持續(xù)釋放。但PLGA是一種可降解高分子，降解后產(chǎn)生酸性低聚物或者乳酸、乙醇酸單體，所產(chǎn)生的酸性環(huán)境可能引起藥物的失活。PLGA作為藥物載體的另一個缺點是與細胞組織缺少特異性結(jié)合的位點，缺少活化的功能基團，因而不能與活性配體分子結(jié)合。
[0006]殼聚糖(CS)是一種堿性多糖，因其具有低毒性、低免疫原性以及出色的生物降解性和生物相容性等優(yōu)點，殼聚糖結(jié)構(gòu)中的伯氨基為活性反應(yīng)基團，氨基可以與機體的生物活性的配基偶聯(lián)。因此殼聚糖已成為構(gòu)成siRNA納米粒的常用材料。
[0007]分子量是影響殼聚糖(CS)物理化學(xué)性質(zhì)和生物活性的關(guān)鍵因素，分子量能夠誘導(dǎo)構(gòu)象轉(zhuǎn)變，低分子量殼聚糖的分子構(gòu)象相對于高分子量殼聚糖的伸展性和剛性更好。增加溶液的離子強度可使分子更加收縮和卷曲。殼寡糖(CSO)是由甲殼素(Chitin)和殼聚糖經(jīng)水解后產(chǎn)生的可溶于水的氨基糖類化合物。CSO的聚合度為2-20，水溶性好，容易被吸收利用，且生物活性比CS更強。特別是聚合度為6左右的殼寡糖，更具有許多獨特的生理活性和功能性質(zhì)。
[0008]基于PLGA和CSO的性質(zhì)，將殼寡糖修飾到PLGA表面是增強和改善其性能的一種有效手段。
[0009]中國專利201410212594.2公開了一種由PLGA納米微球內(nèi)核和香草醛交聯(lián)殼聚糖外殼構(gòu)成的PLGA納米藥物體，該發(fā)明使用殼聚糖對PLGA微球進行表面修飾，之后用香草醛作為交聯(lián)劑，殼聚糖的氨基與香草醛發(fā)生化學(xué)交聯(lián)制備PLGA納米藥物體。該發(fā)明方法所用的香草醛由人工合成，具有毒性，不利于藥物的釋放。殼聚糖的氨基與香草醛發(fā)生化學(xué)交聯(lián)，所采用的實驗條件苛刻。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明提供了一種SiRNA-PLGA/CSO共軛物膠束的制備方法。本發(fā)明制備方法將siRNA-PLGA與CSO通過靜電相互作用形成siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束，反應(yīng)條件溫和，操作簡便。本發(fā)明采用的PLGA和CS O來源廣泛，具有低毒和生物可降解的優(yōu)良特性。
[0011]一種SiRNA-PLGA/CSO共軛物膠束的制備方法，包括以下步驟:
[0012](I)PLGA, N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在溶劑甲中反應(yīng)，處理后制得PLGA-NHS酯；PLGA-NHS酯與3-(2-硫代吡啶)丙酰肼(PDPH)在溶劑乙中反應(yīng)，處理后制得PLG A-PDPH嫁接物；
[0013](2)正義鏈3’端或反義鏈5’端經(jīng)巰基修飾的siRNA溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)，PLGA-PDPH嫁接物溶于二甲基亞砜(DMSO)，將兩種溶液混合后反應(yīng)，經(jīng)處理制得siRNA-PLGA共軛物膠束；
[0014](3)將siRNA-PLGA共軛物膠束與殼寡糖(CSO)在焦磷酸二乙酯(D EPC)處理水中孵育，制得外層為CSO的siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束。
[0015]本發(fā)明所述的PLGA為端羧基PLGA，也稱為羧基化PLGA。
[0016]PLGA的分子量影響PLGA的溶解度和粘度等物理性質(zhì)；PLGA中兩種單體乙交酯(PLA)與丙交酯(PGA)的比例影響PLGA降解的速度，兩種單體比例越接近，PLGA降解的速度越快。
[0017]優(yōu)選地，PLGA分子量為4000-50000，PLGA的兩種單體乙交酯(PL A)與丙交酯(PGA)的比例為50?90:50?10。
[0018]分子量大的PLGA不利于與其他物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)，無法形成膠束。
[0019]進一步優(yōu)選地，PLGA分子量為8000-20000，兩種單體乙交酯與丙交酯的比例為50 ?75:50 ?25。
[0020]步驟(I) DCC作為脫水劑和催化劑，加速PLGA和NHS成酯反應(yīng)，經(jīng)DCC、NHS活化后的PLGA與TOPH反應(yīng)得到PLGA-PDPH，PLGA-PDPH中含有二硫鍵。
[0021]優(yōu)選地，步驟(I)PLGA:DCC和NHS摩爾比為1:2?5:2?5，過量的NHS保證PLGA完全反應(yīng)。
[0022]優(yōu)選地，步驟(I)PLGA-NHS酯與TOPH的摩爾比為1:1?3，過量的I3DPH保證PLGA-NHS酯完全反應(yīng)。
[0023]步驟(I)溶劑的選擇原則是充分溶解反應(yīng)物。
[0024]優(yōu)選地，所述的溶劑甲為二氯甲烷、二甲基甲酰胺、四氫呋喃和N-甲基吡咯烷酮中的至少一種。
[0025]步驟(I) PLGA, DCC和NHS的反應(yīng)溫度為10°C -40°C，反應(yīng)時間為5h_8h。
[0026]步驟⑴所述的溶劑乙為二氯甲烷、二甲基甲酰胺、四氫呋喃、N-甲基吡咯烷酮和乙酸乙酯中的至少一種。
[0027]步驟(I) PLGA-NHS酯與PDPH反應(yīng)溫度為10°C -40°C，反應(yīng)時間為5h_8h。
[0028]步驟(2)正義鏈3’端或反義鏈5’端經(jīng)巰基修飾的siRNA，與PLGA-PDPH上的二硫鍵通過二硫鍵的置換反應(yīng)形成siRNA-PLGA。
[0029]步驟(2)所述siRNA包含19?30個核苷酸，分子量為10000-30000。
[0030]步驟(2)siRNA 與 PLGA-PDPH 的摩爾比 1:20 ?50。
[0031]步驟(2)PBS與DMSO體積比為1:8?12，PBS量過多會影響PLGA-PDPH的溶解。
[0032]步驟(2)反應(yīng)溫度為10°C?40 °C，反應(yīng)時間為16h?26h。
[0033]步驟⑵制得siRNA-PLGA共軛物膠束的粒徑為200nm?246nm，表面電位為 _40mV ?_25mV0
[0034]步驟(3)帶負電荷的siRNA-PLGA共軛物膠束與帶正電荷的CSO通過靜電相互作用形成聚電解質(zhì)復(fù)合物膠束，siRNA-PLGA的帶電性由負轉(zhuǎn)正。
[0035]優(yōu)選地，步驟(3)所述的殼寡糖(CSO)分子量為1000?3000，聚合度為6_8。
[0036]優(yōu)選的孵育條件為:siRNA-PLGA共軛物膠束與CSO在N/P比為1_80:1的條件下孵育，孵育溫度為10°c?40°C，孵育時間15min?30min。
[0037]所述的N/P比表示N元素與P元素的比例。
[0038]優(yōu)選地，siRNA-PLGA共軛物膠束與CSO在N/P比為10-80:1的條件下孵育。在優(yōu)選的N/P比條件下，本發(fā)明孵育制得的siRNA-PLGA共軛物膠束帶正電荷，能夠很好地與電負性的細胞膜結(jié)合，增大siRNA的細胞攝取率。
[0039]本發(fā)明還提供了所述制備方法制得的siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束。
[0040]所述的s iRNA-PLGA/CS0共軛物膠束提高了 s iRNA在遞送過程中的穩(wěn)定性，使siRNA免受核酸酶和溶酶體的降解，增大siRNA的細胞攝取率。
[0041]所述siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束的粒徑為150nm_200nm，表面電位為_18mV?40mV。siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束隨著N/P比的增加，其表面電位由負轉(zhuǎn)正。帶正電荷的siRNA-