定性。
[0091]結(jié)果發(fā)現(xiàn):經(jīng)過5h后，siRNA-PLGA共軛物的穩(wěn)定性好，而裸siRN A在有核酸酶存在的情況下，很快就降解，具體見附圖5。
[0092]2.siRNA-PLGA共軛物臨界膠束濃度(CMC)的測定
[0093]將實施例1中合成的siRNA-PLGA共軛物用DEPC水配制成0.1?12ug/mL的溶液，加入芘溶液使芘的最終濃度6.0X 107M。30°C避光振搖5h。用熒光分光光度計測定激發(fā)波長為337nm處芘的發(fā)射光譜。結(jié)果得到si RNA-PLGA共軛物的臨界膠束濃度約為3mg/L，見附圖6。
[0094]結(jié)果表明制備的siRNA-PLGA共軛物膠束具有較好的熱力學(xué)穩(wěn)定性和較好的抗稀釋能力。
[0095]3.細(xì)胞攝取分析
[0096]將人卵巢癌SK0V3細(xì)胞按2X 15細(xì)胞/孔接種到6孔板中，培養(yǎng)過夜后用N/P比值分別為20、40、80的帶有綠色熒光的FAM-siRNA/CSO和FAM_siRNA-PLGA/CS0進行轉(zhuǎn)染，Iipofectamine 2000作為陽性對照，未經(jīng)任何處理的細(xì)胞作為空白對照(Blank)。
[0097]結(jié)果發(fā)現(xiàn):單用siRNA/CSO靜電結(jié)合物的細(xì)胞攝取率很低，而siRN A-PLGA/CS0共軛物膠束的細(xì)胞攝取率隨著N/P比值的增加而增力卩。當(dāng)N/P比值為80:1時，其攝取率與陽離子脂質(zhì)體Iipofectamine 2000陽性對照組無顯著性差異，攝取率在90%以上，見附圖7。
[0098]4.SK0V3 細(xì)胞內(nèi) STAT3 mRNA 量的 qRT-PCR 定量分析
[0099]將人卵巢癌SK0V3細(xì)胞按2 X 15細(xì)胞/孔接種到6孔板中，培養(yǎng)過夜后分別用N/P比為80的N.C-siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束，STAT3 si RNA/CS0結(jié)合物，STAT3 s iRNA-PLGA/CS0共軛物膠束轉(zhuǎn)染，不做任何處理的細(xì)胞作為空白對照(BIank)，Iipofectamine 2000轉(zhuǎn)染組作為陽性對照。培養(yǎng)48h后用qRT-PCR分析法分析SK0V3細(xì)胞經(jīng)不同試劑轉(zhuǎn)染后STAT3 mRNA表達的水平。
[0100]結(jié)果發(fā)現(xiàn):SK0V3細(xì)胞經(jīng) N.C-siRNA-PLGA/CSO 共軛物膠束，S TAT3 siRNA/CSO結(jié)合物轉(zhuǎn)染后STAT3 mRNA表達與空白組相比無顯著性差異(P > 0.05)，而STAT3siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束轉(zhuǎn)染組與空白組相比，STAT3 mRNA表達明顯下降，具有顯著性差異(P < 0.001)，但與Iipofectamine 2000陽性對照組無明顯性差異(P > 0.05)見附圖8。
[0101]5.SK0V3細(xì)胞內(nèi)STAT3蛋白量的Western blot定量分析
[0102]將SK0V3細(xì)胞按2 X 15細(xì)胞/孔接種到6孔板中，培養(yǎng)過夜后分別用N/P值為80的 N.C-siRNA-PLGA/CSO 共軛物膠束，STAT3 siRNA/CS O 結(jié)合物，STAT3 siRNA-PLGA/CSO 共軛物膠束轉(zhuǎn)染，以不做任何處理的細(xì)胞為空白對照(Blank)。培養(yǎng)72h后用Western blot分析法分析SK 0V3細(xì)胞經(jīng)不同試劑轉(zhuǎn)染后STAT3蛋白表達的水平。
[0103]結(jié)果發(fā)現(xiàn):SK0V3細(xì)胞經(jīng) N.C-siRNA-PLGA/CSO 共軛物膠束，S TAT3 siRNA/CSO 結(jié)合物轉(zhuǎn)染后STAT3蛋白條帶與空白組相比無明顯性差異，而STAT3 siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束轉(zhuǎn)染組與空白組相比，S TAT3蛋白條帶明顯變淡，結(jié)果具有顯著性差異見附圖9。
[0104]6.STAT3 siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束對SK0V3細(xì)胞生長的抑制作用
[0105]使用CCK-8試劑盒來分析STAT3 siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束對S K0V3細(xì)胞的生長抑制作用。將SK0V3細(xì)胞按6000細(xì)胞/孔接種到96孔板中，37°C,5% 0)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后分別用 N.C-siRNA-PLGA/CSO 共軛物膠束，STAT3 siRNA/CSO 結(jié)合物，STAT3 siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束轉(zhuǎn)染，以不做任何處理的細(xì)胞為空白對照(Blank)。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后向每個孔中加入1ul CCK-8試劑，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育lh，用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度值。
[0106]結(jié)果發(fā)現(xiàn):SK0V3細(xì)胞經(jīng) N.C-siRNA-PLGA/CSO 共軛物膠束，S TAT3 siRNA/CSO 結(jié)合物轉(zhuǎn)染后與空白組相比，細(xì)胞生長均沒有得到明顯的抑制，而STAT3 siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束轉(zhuǎn)染組與空白組相比，細(xì)胞的生長得到明顯地抑制，尤其是到了 72h后，細(xì)胞增殖明顯受到減弱見附圖10。
[0107]7.STAT3 siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束對SK0V3細(xì)胞凋亡的促進作用。
[0108]利用細(xì)胞凋亡試劑盒來進行細(xì)胞凋亡實驗。將SK0V3細(xì)胞按2父105細(xì)胞/孔接種到6孔板中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后分別用N.C-siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束，STAT3 siRNA/CSO結(jié)合物，STAT3 siRNA-PLGA/CS O共軛物膠束轉(zhuǎn)染，以不做任何處理的細(xì)胞為空白對照(Blank)。
[0109]結(jié)果發(fā)現(xiàn):SK0V3細(xì)胞經(jīng) N.C-siRNA-PLGA/CSO 共軛物膠束，S TAT3 siRNA/CSO 結(jié)合物轉(zhuǎn)染后SK0V3細(xì)胞凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)與空白組相比無顯著性差異(P >0.05)，而STAT3 siRNA-PLGA/CS O共軛物膠束轉(zhuǎn)染組與空白組相比，細(xì)胞凋亡率明顯下降，具有顯著性差異(P < 0.01)見附圖11 (橫坐標(biāo)FITC為異硫氰酸熒光素；縱坐標(biāo)PI為碘化丙啶)。
【主權(quán)項】
1.一種siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束的制備方法，包括以下步驟: (1)PLGA,DCC和NHS在溶劑甲中反應(yīng)，處理后制得PLGA-NH S酯；PLGA_NHS酯與PDPH在溶劑乙中反應(yīng)，處理后制得PLGA-PDPH嫁接物； (2)正義鏈3’端或反義鏈5’端經(jīng)巰基修飾的siRNA溶于PBS，PLGA-PDPH嫁接物溶于DMS0，兩種溶液混合后反應(yīng)，經(jīng)處理制得siRNA-PLGA共軛物膠束； (3)將siRNA-PLGA共軛物膠束與CSO在焦碳酸二乙酯處理水中進行孵育，制得siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述的PLGA分子量為8000?20000，PLGA中兩種單體乙交酯與丙交酯的比例為50?75:50 ?25。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束的制備方法，其特征在于，步驟(l)PLGA, DCC和NHS的摩爾比為1:2?5:2?5，PLGA-NHS酯與PDPH的摩爾比為1:1?3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述的溶劑甲為二氯甲烷、二甲基甲酰胺、四氫呋喃和N-甲基吡咯烷酮中的至少一種，所述的溶劑乙為二氯甲烷、二甲基甲酰胺、四氫呋喃、N-甲基吡咯烷酮和乙酸乙酯中的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述正義鏈3’端或反義鏈5’端經(jīng)巰基修飾的siRNA包含19-30個核苷酸，分子量為10000-30000。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述的siRNA與PLGA-PDPH的摩爾比為I:20?50，PBS與DMSO體積比為1:8?12。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述的siRNA-PLGA共軛物膠束的粒徑為200nm?246nm，表面電位為_40mV?-25mV。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述的CSO分子量為1000?3000，聚合度為6_8。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束的制備方法，其特征在于，步驟(3) siRNA-PLGA共軛物膠束與殼寡糖在N/P比為I?80:1的條件下孵育，孵育溫度為10°C?40°C，孵育時間為15min?30min。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一所述的siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束的制備方法制得的siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束，粒徑為150nm-200nm，表面電位為-18mV?40mV。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束的制備方法，包括以下步驟：(1)PLGA、DCC、NHS和PDPH制得PLGA-PDPH；(2)si？RNA與PLGA-PDPH制得siRNA-PLGA；(3)siRNA-PLGA與CSO制備siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束。本發(fā)明制備方法反應(yīng)條件溫和，操作簡便。本發(fā)明采用的PLGA和CSO來源廣泛，具有低毒和生物可降解的優(yōu)良特性。本發(fā)明還公開了一種siRNA-PLGA/CSO共軛物膠束。該共軛物膠束提高了siRNA在遞送過程中的穩(wěn)定性，使siRNA免受核酸酶和溶酶體的降解，增大siRNA的細(xì)胞攝取率。
【IPC分類】C08G63-91, A61K47-48, A61K47-36, A61K9-107, A61K31-713
【公開號】CN104546711
【申請?zhí)枴緾N201410826780
【發(fā)明人】鄭彩虹, 趙云春, 張麗, 陳玥, 馮世森, 葉軼青, 趙夢丹
【申請人】浙江大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月25日