用途，該藥物組合物用于治療由腸道病毒71型或柯薩奇病毒A16引起的 手足口病。
[0032] 本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：
[0033] 實(shí)驗(yàn)研宄表明，用m-3M3FBS處理可以顯著抑制TAKl的磷酸化以及巨噬細(xì)胞中的 MAP激酶和NF- κ B通路的活性，還顯著降低巨噬細(xì)胞中包括TNF、IL-6和IL-12的促炎細(xì) 胞因子的表達(dá)。而且，用m-3M3FBS處理降低了 CVA16-感染的小鼠的臨床評分，還延長了 CVA16-感染的小鼠的存活，并降低了它們在肺和肌肉組織中的組織病理發(fā)展。
【附圖說明】
[0034] 圖I :HFMD病患中，具有更高表達(dá)的PLC β 2與更低的P-TAKl和血清IL-6聯(lián)合出 現(xiàn)；
[0035] (Α，Β)來自空白對照組和HFMD病患組的外周血單核細(xì)胞（PBMC)中的PLC β 2的 免疫印跡（ΙΒ)，* ρ < 0.05 ;
[0036] (C，D)來自HFMD病患的血清中的IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)，* ρ < 0· 05 ;
[0037] (E，F(xiàn))來自HFMD病患的PBMC中的ΡΙΧβ 2和P-TAKl的免疫印跡（IB);基于每帶 的強(qiáng)度將ΡΙΧβ 2和P-TAKl水平分為低、中、高，并且分類在每個種類的病患的百分?jǐn)?shù)被描 述在（F)的柱狀圖中；
[0038] (G)感染CVA16病毒一段指定時間的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的PLC β 2的免疫印跡 (IB)；
[0039] (H)來自用poly(I:C) (10mg/ml)刺激一段指定時間的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的溶解 產(chǎn)物中的PLC β 2的免疫印跡（IB);
[0040] (I)來自用poly (I: C) (10mg/ml)刺激一段指定時間的野生型（WT)和TLR3V_小鼠 腹腔巨噬細(xì)胞的溶解產(chǎn)物中的ΡΙΧβ 2的免疫印跡（IB);
[0041] (J)在用poly(I:C) (10mg/ml)刺激一段指定時間前用ρ38抑制劑SB203580預(yù)先 處理1小時的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的PLC β 2的免疫印跡（IB);
[0042] G、H、I、J代表至少三種獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。
[0043] 圖2 :ΡΙΧβ 2-不足）小鼠更容易受到CVA16的感染；
[0044] (△，8)用？〇17(1:〇(1〇11^/1111)刺激一段指定時間的訂或？1^(^2_ /_巨噬細(xì)胞中相 對的Tnf (A)和IL-6⑶mRNA水平的Q-PCR分析；14天大的WT或PLC β 2+小鼠腹腔內(nèi)感染 1(^1〇^16(每鼠4\10節(jié)皿)0-5天；
[0045] (C，D，E)來自 WT 或 ΡΙΧβ 2+小鼠的肌肉組織中相對 Tnf(C)、IL-6(D)和 IL-12(E) mRNA水平的Q-PCR分析（η = 3);
[0046] (F)按照上述方法感染0天（未感染）或5天的WT或PLC β 2+小鼠肌肉組織的 組織病理圖；原始放大倍數(shù)：100Χ (頂部）或200 X (底部）；
[0047] (G)從經(jīng)上述方法處理的小鼠的肌肉組織獲得的復(fù)制RNA樣本中CVA16的表達(dá)（η =3)；
[0048] (H，I)經(jīng)指定方法處理的WT或PLC β 2V_小鼠的臨床評分⑶或存活率⑴；這些 數(shù)據(jù)代表至少三種獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)（平均值和s. e. m)，* ρ < 0. 05, * * ρ < 0. 01。
[0049] 圖3 :PLC β 2通過靶向TAKl泛素化抑制MAPKs和NF- κ B的活性；
[0050] (Α，Β)在ΗΕΚ293Τ細(xì)胞中表達(dá)帶有血細(xì)胞凝集素（HA)或Flag的TAKl或PLC β 2 的細(xì)胞裂解產(chǎn)物的免疫沉淀（IP)和免疫印跡（IB);
[0051] (C)從表達(dá)Flag-PLCβ 1-3和HA-TAKl的HEK293T細(xì)胞的溶解產(chǎn)物的免疫沉淀 (IP)和免疫印跡（IB);
[0052] (D)使用純化的帶有組氨酸（HIS)標(biāo)簽的PLC β 2與GST-TAKl結(jié)合的體外GST沉 淀試驗(yàn)；
[0053] (E)與內(nèi)源性PLC β 2結(jié)合的體外純化的GST-TAKl的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)；
[0054] (F)在經(jīng)poly (I:C)刺激的主要巨噬細(xì)胞中ΡΙΧβ 2與TAKl的內(nèi)源性相互作用關(guān) 系；
[0055] (G)來自用磷酸-TAKl抗體表達(dá)PLC β 2與TAKl的ΗΕΚ293Τ細(xì)胞的裂解產(chǎn)物的免 疫印跡分析；
[0056] (Η，I)使用磷酸-TAKl抗體（H)或磷酸化-抗體（I)，來自用poly (I:C) (10mg/ml) 刺激一段指定時間的WT或PLC β 2+巨噬細(xì)胞的溶解產(chǎn)物的免疫印跡分析；
[0057] (J)在存在或缺乏PLC β 2下表達(dá)K63-Ub、TAKl和TABl的ΗΕΚ293Τ細(xì)胞的裂解產(chǎn) 物的免疫沉淀（IP)和免疫印跡（IB)分析；
[0058] (K)用poly (I:C)刺激WT或PLC β 2+小鼠一段指定時間，并將細(xì)胞裂解產(chǎn)物用 抗-TAKl免疫沉淀；用抗-Ub (Κ63)抗體分析免疫沉淀物；
[0059] (L)在存在或缺失PLC β 2下表達(dá)TAKl和TABl的ΗΕΚ293Τ細(xì)胞的溶解產(chǎn)物的免疫 沉淀（IP)和免疫印跡（IB)分析；這些數(shù)據(jù)代表至少三種獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。
[0060] 圖4 :m-3M3FBS減輕CVA16病毒感染引起的手足口??；
[0061] (A，B)來自用DMSO或m-3M3FBS預(yù)處理小鼠來源的腹腔巨噬細(xì)胞、然后使用磷酸 化-抗體對P 〇ly(I:C)刺激一段指定時間的巨噬細(xì)胞的裂解產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡（IB)分析；
[0062] (C，D，E) 14天大WT小鼠用DMSO或m-3M3FBS預(yù)處理并隨后用CVA16感染0-5天； 來自兩組肌肉組織中的相對Tnf (C)、IL-6 (D)和IL-12 (E)mRNA水平的Q-PCR分析（η = 3);
[0063] (F)從兩組獲得的肌肉組織的組織病理圖；原始放大倍數(shù)：100Χ(頂部）或 200Χ (底部）；
[0064] (G，H)經(jīng)上述方法處理的小鼠的臨床評分（G)或存活率（H);這些數(shù)據(jù)代表至少三 種獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)（平均值和s. e. m);
[0065] (I)圖表描述了通過病毒誘發(fā)的ΡΙΧβ 2,通過革El向TAKl泛素化，負(fù)向調(diào)節(jié)先天免 疫反應(yīng)。
【具體實(shí)施方式】
[0066] 下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明， 但是下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。
[0067] 試驗(yàn)材料和方法：
[0068] 細(xì)胞培養(yǎng)和試劑：
[0069] 將ΗΕΚ293Τ細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基（Hyclone)中，經(jīng)10% (ν/ν)熱滅活胎牛血 清（FBS，Gibco)和100U/ml盤尼西林和鏈霉素。HeLa細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞在RPMI-1640培 養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)10% (v/v)FBS和100U/ml盤尼西林和鏈霉素。Vero細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì) 胞）在VP-SFM培養(yǎng)基（Gibco)中培養(yǎng)，4mML-谷氨酸鹽（Gibco)。這些細(xì)胞培養(yǎng)在用5% CO2平衡的37°C保溫箱中。使用之前報道過的微載體細(xì)胞培養(yǎng)生物處理方法，將臨床上分 離的CVA16菌株放在Vero細(xì)胞中繁殖。將該病毒母液存儲在-80°C。使用標(biāo)準(zhǔn)的空斑形成 試驗(yàn)方法測試病毒滴度。
[0070] 使用下列抗體：
[0071] 兔抗K63-連接特定聚泛素（5621)、兔抗磷酸TAKl(Thrl87) (4536)、兔抗磷酸 TAKl (Ser412) (9339)、兔抗磷酸 p65 (3033)、兔抗磷酸 Erkl/2 (9101)、兔抗磷酸 p38 (9215) 和兔抗磷酸 Jnk(9251)，這些抗體來自 Cell Signaling Technology;
[0072] 兔抗 PLCβ 2 (sc-206)、兔抗磷酸 TAKl(Serl92)(sc-130219)和兔抗 TAKl (sc-7162)，這些抗體來自 Santa Cruz Biotechnology;
[0073] 兔抗TABl (ab27983,來自Abeam);單克隆的鼠抗Flag M2親和凝膠（A2220)、單克 隆的鼠抗 HA (H9658)，兔抗 HA (H6908)、兔抗 GAPDH (SAB2701826)和兔抗 Flag (F7425)，這些 抗體來自Sigma ;
[0074] 以及 Protein G Sepharose? 4Fast Flow (GE Healthcare) 〇
[0075] 使用下列化合物：
[0076] m-3M3FBS(T5699)和 SB203580(P38 抑制劑，S8307)，都來自 Sigma。
[0077] 質(zhì)粒和質(zhì)粒構(gòu)建：
[0078] 將cDNAs編碼的ΡΙΧβ 2及其截短的形式和cDNAs編碼的TAKl及其缺失突變體 插入到Flag-pcDNA3載體中。將PLC β 2和TAKlcDNAs插入到HA-pcDNA3表達(dá)載體中。將 cDNAs編碼的TABl和TAB2插入到pcDNA3載體中，并將cDNAs編碼的PLC β 2和TAKl分別 插入到pET28a和p-GEX-4T-l載體中。
[0079] 小鼠品系：
[0080] 同型結(jié)合的ΡΙΧβ 2和TLR3基因剔除小鼠在上海實(shí)驗(yàn)室動物中心無特定的病原體 條件下飼養(yǎng)。在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中使用14天大或6周大的ΡΙΧβ 2基因敲除小鼠和野生型空 白對照小鼠。所有動物研宄經(jīng)過同濟(jì)大學(xué)的機(jī)構(gòu)動物照顧與使用小組批準(zhǔn)。
[0081] 巨噬細(xì)胞的分離：
[0082] 腹腔巨細(xì)胞從經(jīng)過Brewer改良硫乙醇酸鹽肉湯（BD，Sparks，MD)注射4天后的 小鼠中獲得。這些細(xì)