的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。
[0056] 有益效果
[0057] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研宄，首次揭示了 miR-144可特異性地抑制Nrf2的基因表 達(dá)，并且首次揭示了 miR-144的表達(dá)與心臟疾病密切相關(guān)，其高表達(dá)促進(jìn)心肌氧化應(yīng)激，從 而可誘發(fā)心肌損傷相關(guān)疾?。ㄓ绕涫翘悄虿⌒募〔。送膺€包括缺血性心臟病、高血壓性 心臟病、特異性心肌病等）。本發(fā)明為上述心臟疾病的防治提供了新的靶點(diǎn)。
[0058] 在本發(fā)明中通過(guò)下調(diào)所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)miR-144的表達(dá)水平以抑制心肌氧化應(yīng) 激的發(fā)生可以防或治療哺乳動(dòng)物心肌損傷。
【附圖說(shuō)明】
[0059] 圖1糖尿病心肌病小鼠建模成功后，與正常對(duì)照組小鼠相比，電鏡下的心肌表 現(xiàn)以及超聲心動(dòng)圖結(jié)果比較，其中A為對(duì)照組小鼠心肌電鏡下表現(xiàn)，B為糖尿病心肌病 小鼠心肌電鏡下表現(xiàn)，可見(jiàn)心肌損傷并排列紊亂，線粒體腫脹；C為正常對(duì)照組小鼠超聲 心動(dòng)圖結(jié)果（FS57. 9±5. 2%，EF83. 5±5. 8% )，D為糖尿病心肌病小鼠超聲心動(dòng)圖結(jié)果 (FS40. 6±3· 5%，EF67. 9±5· 2% )，提示心功能差于對(duì)照組。
[0060] 圖2 miR-144在糖尿病心肌病小鼠心臟中的表達(dá)及心肌細(xì)胞表達(dá)相對(duì)特異性分 析，其中A為糖尿病心肌病小鼠較對(duì)照組小鼠心臟組織中miRNA表達(dá)差異> 2倍的芯片 分析結(jié)果，B為miR-144在正常小鼠心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)差異分析，可見(jiàn) miR-144主要表達(dá)于心肌細(xì)胞。
[0061] 圖3 miR-144在糖尿病心肌損傷病理過(guò)程中表達(dá)水平逐漸升高。
[0062] 圖4 miR-144過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制Nrf2促進(jìn)高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。 過(guò)表達(dá)miR-144促進(jìn)高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞ROS生成（代表氧化應(yīng)激水平），若同時(shí)給予 Dh404(Nrf2激動(dòng)劑），Dh404可抑制miR-144過(guò)表達(dá)引起的氧化應(yīng)激。圖中"control"是 指空白組。
[0063] 圖5 miR-144沉默抑制STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠（STZ組）心肌氧化應(yīng)激水平。A 為小鼠尾靜脈注射miR-144抑制劑后miR-144在心肌中的轉(zhuǎn)染效率，B為抑制miR-144減 少STZ組心肌ROS生成（代表氧化應(yīng)激水平），C為抑制miR-144減少STZ組心肌MDA生成 (代表氧化應(yīng)激水平）。
[0064] 圖6 miR-144通過(guò)Nrf2調(diào)控高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激。A為通過(guò)熒光素酶 報(bào)告基因，發(fā)現(xiàn)Nrf2是miR-144的潛在靶基因，B為心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-144 mimic后，Nrf2 表達(dá)減少，C為心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-144 inhibitor后，miR-144表達(dá)抑制的同時(shí)，Nrf2含量 增加。圖中"control"是指空白組。
[0065] 圖7過(guò)表達(dá)miR_199a和miR-101對(duì)高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平無(wú)明顯影 響。A為心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-199a mimic后ROS水平，B為心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-101 mimic后 ROS水平。圖中"control"是指空白組。
【具體實(shí)施方式】
[0066] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0067] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人， 分子克隆：實(shí)驗(yàn)室指南（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述 的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除 非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此 夕卜，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí) 施方法與材料僅作示范之用。
[0068] 實(shí)施例1、糖尿病心肌損傷模型中microRNAs表達(dá)分析
[0069] 心肌組織中存在多種高豐度的microRNAs。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的STZ誘導(dǎo)方法，成功 建立了糖尿病心肌損傷小鼠模型，構(gòu)建方法如下：
[0070] 選取雄性C57BL/6小鼠，8周齡，隨機(jī)分為兩組。造模前禁食12h后稱(chēng)體重，測(cè)量空 腹血糖值。其中一組腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ)溶液（用pH 4. 5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖 液配制），每只小鼠一次性注射150mg/kg ;陰性對(duì)照組則單次腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬 酸鈉緩沖液。一周后尾靜脈采血，血糖儀測(cè)定血糖，連續(xù)檢測(cè)兩天全血血糖多18. 6mol/L、尿 糖陽(yáng)性，并且有明顯的多飲、多食、多尿癥狀者入選，繼續(xù)飼養(yǎng)8周后經(jīng)心臟彩超、心臟組織 切片、電鏡檢查結(jié)果確認(rèn)糖尿病心肌病模型建立成功。
[0071] 電鏡下心肌損傷伴排列紊亂，線粒體腫脹，超聲心動(dòng)圖提示心臟功能下降提 示構(gòu)建成功（圖IA :對(duì)照組小鼠心肌電鏡下表現(xiàn)，圖IB :糖尿病心肌病小鼠心肌電鏡 下表現(xiàn)，可見(jiàn)心肌損傷并排列紊亂，線粒體腫脹；圖IC :正常對(duì)照組小鼠超聲心動(dòng)圖 結(jié)果（FS57. 9±5. 2%，EF83. 5±5. 8% )，圖1D:糖尿病心肌病小鼠超聲心動(dòng)圖結(jié)果 (FS40. 6±3· 5%，EF67. 9±5· 2% )，提示心功能差于對(duì)照組。）
[0072] 糖尿病小鼠建模成功后繼續(xù)飼養(yǎng)8周時(shí)，對(duì)左室心肌利用TRIzol (Invitrogen)進(jìn) 行RNA抽提（具體步驟遵照試劑說(shuō)明書(shū)）。采用丹麥Exiqon miRNA芯片技術(shù)進(jìn)行表達(dá)譜分 析，并利用定量PCR對(duì)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。
[0073] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR :常規(guī)方法抽提RNA，通過(guò)頸環(huán)結(jié)構(gòu)的特異性引物反轉(zhuǎn)錄相應(yīng) 的microRNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，以雙標(biāo)準(zhǔn)曲線方法定量，分析各樣本的 microRNA濃度，并通過(guò)溶解曲線和瓊脂糖凝膠電泳確定基因擴(kuò)增的特異性。
[0074] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌病小鼠較對(duì)照組小鼠心臟microRNAs表達(dá)譜發(fā)生改變，其 中 miR-199a、miR-101、miR-499 等表達(dá)顯著降低，而 miR-144、miR-21、miR-22、miR-155、 miR-15a、miR_125等表達(dá)顯著升高（如圖2A)。
[0075] 此后，在25mM高糖誘導(dǎo)的心肌氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞模型中進(jìn)一步驗(yàn)證上述表 達(dá)差異較明顯的miRNA，將動(dòng)物和細(xì)胞模型中較對(duì)照組表達(dá)均發(fā)生較大變化（>2倍）的 11^1?-1993、111丨1?-101、111丨1?-499(表達(dá)減少），及111丨1?-144、111丨1?-155、111丨1?-153(表達(dá)增加）作為 下一實(shí)施例研宄對(duì)象。
[0076] 實(shí)施例2、心臟高豐度的miRNA即miR-144主要表達(dá)于心肌細(xì)胞
[0077] 心肌細(xì)胞培養(yǎng)：用0. 2%胰蛋白酶和0. 1%膠原酶進(jìn)行消化，用差速黏附貼壁法純 化心肌細(xì)胞，用MDM培養(yǎng)基培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察，用苔盼藍(lán)染色法做心肌細(xì)胞質(zhì)量 評(píng)價(jià)，心肌細(xì)胞進(jìn)行Actin免疫組化、Myoglobin熒光免疫組化和電鏡分析。
[0078] 心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)：采用酶消化+差速貼壁法原代培養(yǎng)小鼠心肌成纖維細(xì)胞， 根據(jù)心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間的不同，成纖維細(xì)胞貼壁速度較快，先附于瓶底， 采用反復(fù)差速貼壁lh，獲得成纖維細(xì)胞，并觀察細(xì)胞形態(tài)特征和免疫細(xì)胞化學(xué)染色驗(yàn)證細(xì) 胞純度（心肌成纖維細(xì)胞波形蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，肌動(dòng)蛋白呈陰性反應(yīng)）。
[0079] 本發(fā)明人分離了正常小鼠心臟的心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，并檢測(cè)了 miR-144的表 達(dá)水平。通過(guò)定量PCR(方法同實(shí)施例1)證實(shí)，miR-144主要在心肌細(xì)胞檢測(cè)到，而在成纖 維細(xì)胞表達(dá)量較低（圖2B)，具體有心肌細(xì)胞表達(dá)相對(duì)特異性。因此本發(fā)明人的結(jié)果表明， miR-144主要表達(dá)于心肌細(xì)胞。
[0080] 同樣方法檢測(cè)其他表達(dá)差異明顯的miRNA在心肌細(xì)胞中的相對(duì)特異性，結(jié)果提示 miR-199a、miR_101在心肌細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)豐富，而miR-155、miR_15a等主要存在于心肌成 纖維細(xì)胞中，miR-499在二者中表達(dá)并無(wú)顯著差異。因此，將心肌表達(dá)相對(duì)特異的miR-144、 miR_199a、miR-101納入進(jìn)一步實(shí)施例。
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